不同滅菌工藝對香菇培養(yǎng)料理化特性與微生物菌群動態(tài)變化的影響

宋吉玲 陳星坤 陳 青 何愛珍 袁衛(wèi)東，* 陸中華，*

（1杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 泰安 271000；3浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310020；4淳安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心，浙江 淳安 311700）

香菇［Lentinusedodes（Berk.）Pegler］，隸屬于擔(dān)子菌綱（Basuduimycota）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香菇屬（Lentinula），又稱香蕈、香菰［1］，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、多糖、多酚和人體所必需的多種氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是一類營養(yǎng)豐富的食藥兼用型真菌［2］。

香菇作為浙江省主要栽培的食用菌品種之一，其培養(yǎng)基質(zhì)以闊葉類木屑、麩皮等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)下腳料為主，但這些原料中含有大量的細(xì)菌、放線菌、病毒等微生物和蟲害，會與香菇爭奪營養(yǎng)成分，從而對香菇的生長產(chǎn)生影響［3］。因此，在香菇等食用菌的栽培過程中，培養(yǎng)料的滅菌處理是保障高效生產(chǎn)的一個重要環(huán)節(jié)［4］。在生產(chǎn)中，培養(yǎng)料的滅菌處理主要采用濕熱滅菌法，依據(jù)壓力的不同分為高壓滅菌、微壓滅菌和常壓滅菌［5］。在規(guī)模化生產(chǎn)中，一般采用高壓滅菌和微壓滅菌，即培養(yǎng)基質(zhì)完成裝袋后在一定的壓力和溫度條件下進(jìn)行滅菌，以達(dá)到殺滅大部分微生物的目的；而在一些香菇的主產(chǎn)區(qū)，依然延續(xù)著傳統(tǒng)的常壓滅菌方式。不同的滅菌方式不僅會對培養(yǎng)料質(zhì)量性狀和食用菌的生長造成一定的影響［6］，還會影響微生物的種類和結(jié)構(gòu)［7］。在食用菌的生長過程中，微生物作為分解有機(jī)物的主要參與者，在養(yǎng)分循環(huán)利用、改善培養(yǎng)基質(zhì)結(jié)構(gòu)和提高食用菌產(chǎn)量方面均表現(xiàn)出良好的效果［8-9］。然而，目前關(guān)于不同滅菌處理方式對食用菌生長影響的研究主要集中在其對培養(yǎng)料酶活大?。?0］、氨基酸含量［11］、微量營養(yǎng)素的多少［12］和滅菌效果的好壞［13］等，鮮見有關(guān)不同滅菌方式對香菇培養(yǎng)料理化特性和微生物菌群動態(tài)變化影響的相關(guān)研究。

因此，本研究通過檢測培養(yǎng)料的理化特性探究不同滅菌工藝對香菇培養(yǎng)料營養(yǎng)變化的影響，通過Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)分析不同滅菌工藝對微生物菌群動態(tài)變化的改變，結(jié)合相關(guān)生物學(xué)分析手段，對培養(yǎng)料理化特性與微生物菌群進(jìn)行相關(guān)性分析，以期明確不同滅菌處理對香菇生長發(fā)育的影響，為香菇的精準(zhǔn)化栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 香菇菌株為浙香6 號，由武義食用菌創(chuàng)新公司提供。

1.1.2 栽培方法 于2021年7月—2022年4月在杭州桐廬和誠食用菌專業(yè)合作社開展香菇栽培試驗。試驗配方采用木屑79%、麩皮20%、石膏1%，含水量50%～55%。分別采用三種滅菌工藝進(jìn)行滅菌，滅菌具體參數(shù)見表1。栽培袋規(guī)格采用15 cm×55 cm×0.045 cm 的聚乙烯袋，每棒干料重1.2 kg。其中在高壓滅菌時，栽培袋刺小孔（直徑0.5 cm）后貼透氣膜進(jìn)行滅菌。按照常規(guī)方法進(jìn)行接種、培養(yǎng)、出菇。試驗隨機(jī)分組，3次重復(fù)，每個重復(fù)300個菌棒。

表1 不同滅菌工藝及技術(shù)參數(shù)Table 1 Different sterilization processes and technical parameters

1.1.3 試驗儀器 HiFi Hotstart PCR 試劑盒（Kapa Biosystems，南非），文庫定量試劑盒Illumina?平臺（Kapa Biosystems，南非），AGENCOURT?AMPURE?XP Kit（Beckman Coulter Inc.，美國），QIA 快速凝膠萃?。≦iagen，德國），T100TM熱循環(huán)PCR 儀（Bio-Rad Inc.，美國），Qseq100 DNA 分析儀（Bioptic Inc.，臺灣），LightCycler?96 實時熒光定量PCR 儀（Roche Inc.，瑞士），Qubit?Fluorometers 熒光定量儀（Thermo Fisher Scientific，美國），PE300 MiSeq?測序系統(tǒng)（Illumina Inc.，美國），PE250 Novaseq 6000?測序系統(tǒng)（Illumina Inc.，美國）。

1.2 取樣

取樣時期包括滅菌前空白菌棒（0）、滅菌后空白菌棒（1）、滿棒期（2）、轉(zhuǎn)色期（3）、原基期（4）、成熟期（5）。每個時期隨機(jī)選取30 個菌棒，使用無菌鏟分別對每個菌棒上、中、下部的中心處培養(yǎng)料進(jìn)行采樣。按每個處理分別混合均勻后取300 g，一部分用于微生物測序，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；一部分風(fēng)干、磨粉后用于有機(jī)碳、全氮、纖維素、木質(zhì)素、半纖維素等理化特性指標(biāo)的測定；一部分直接用于培養(yǎng)料含水量測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀測定 待菌絲萌發(fā)后，隨機(jī)抽取10個菌棒，每隔7 d 測量1 次菌絲生長速度，并記錄菌絲長勢（菌絲濃密程度、顏色）和各潮次產(chǎn)量。待菌絲滿棒后，統(tǒng)計污染菌棒的數(shù)量，計算菌棒成品率。

菌棒成品率=污染菌棒數(shù)量/全部菌棒數(shù)量×100%。

1.3.2 理化特性指標(biāo)測定 對不同滅菌工藝處理下培養(yǎng)料的理化特性進(jìn)行測定，其中采用重鉻酸鉀容量法測定有機(jī)碳含量［14］；凱氏定氮法測定全氮含量［15］；蒽酮比色法測定纖維素含量［16］；乙酰溴法測定木質(zhì)素含量［17］；培養(yǎng)料經(jīng)酸性水解后采用蒽酮法測定半纖維素含量［18］。按照下式計算培養(yǎng)料中碳氮比（C/N）：

C/N=（SOC/SAN）×100%

式中，SOC為培養(yǎng)料中有機(jī)碳（organic carbon，OC）含量（g·kg-1），SAN 為培養(yǎng)料中全氮（total nitrogen，TN）含量（g·kg-1）。

1.3.3 基質(zhì)DNA提取與微生物測序 樣品中DNA使用DP336 土壤DNA 提取試劑盒（上海三黍生物科技有限公司）進(jìn)行提取，并選擇16S rRNA 基因高變區(qū)序列進(jìn)行菌落測序，引物序列B341F：5′-CCTACGGGNG GCWGCAG-3′；B785R-5′GACTACHVGGGTATCTAAT-3′，測序區(qū)域V3～V4 區(qū)，目的片段長450 bp。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系共25 μL：50 ng·μL-1DNA、2×Kapa hifi hotstart ready mix 1.25 μL、特異性上、下游引物各0.25 μL、用PCR級無菌去離子水補(bǔ)至25 μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環(huán)；72 ℃孵化5 min；4 ℃保持。反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物使用AMPure XP Beads 純化后用2% 瓊脂糖凝膠電泳回收。采用Illumina Novaseq 6000 PE250 模式對樣品進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Vsearch 2.22.1 對序列進(jìn)行質(zhì)量控制，以相似度大于97% 的序列聚到同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）中，使用Mothur 1.48.0軟件、Rdp 和Unite 數(shù)據(jù)庫對OTU 進(jìn)行注釋，并在各分類學(xué)水平上統(tǒng)計樣本中的群落組成［19］。根據(jù)統(tǒng)計的OTU結(jié)果采用Origin 8.0軟件完成門、屬水平豐度圖繪制。并計算Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)分析群落的豐富度和多樣性［20］。同時對不同滅菌工藝條件下微生物菌群變化與培養(yǎng)料理化特性的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌工藝對香菇生長的影響

不同滅菌工藝下的香菇菌絲生長、產(chǎn)量和菌棒成品率均存在顯著差異（表2），其中Z工藝的菌絲生長速度最快，為3.690 mm·d-1；G 工藝的生長速度次之，為3.270 mm·d-1，C 工藝的生長速度最慢，僅為2.340 mm·d-1。產(chǎn)量與菌絲生長的變化趨勢有所不同，C 工藝總產(chǎn)量最高，為0.611 kg/棒；Z 工藝次之，為0.585 kg/棒；G工藝總產(chǎn)量最低，為0.535 kg/棒。從各潮次產(chǎn)量情況來看，G 工藝的第一潮產(chǎn)量相對較高，后期產(chǎn)量相對較弱，出菇持續(xù)性表現(xiàn)較差；而C 工藝和Z 工藝的變化趨勢相似，以第一潮和第四潮產(chǎn)量較高，第二和第三潮產(chǎn)量稍低，整體表現(xiàn)相對平穩(wěn)、持久。從菌棒成品率情況來看，G 工藝和Z 工藝的菌棒成品率較高，分別為98.98%和97.08%，C 工藝的菌棒成品率較低，僅為88.87%。綜合分析可知，C 工藝的產(chǎn)量表現(xiàn)較好，但整體的成品率較低；G 工藝的產(chǎn)量相對較低，主要集中在第一潮，后期出菇能力表現(xiàn)相對較弱；而Z工藝在菌絲生長速度、菌棒成品率和產(chǎn)量方面整體表現(xiàn)相對較好。

表2 不同滅菌工藝對香菇生長情況的影響Table 2 Effects of different sterilization processes on the growth of Lentinula edodes

2.2 不同滅菌工藝對培養(yǎng)料理化特性的影響

栽培過程中培養(yǎng)料含水量的變化如圖1-a 所示：在滅菌前后的空白菌棒階段，C 工藝的含水量稍有增加，由滅菌前的50.48%提高到51.46%；而G 工藝和Z工藝的含水量均有所下降，其中G 工藝由滅菌前的50.48%下降到47.86%，Z 工藝由滅菌前的50.48%下降到49.28%，這可能與不同滅菌工藝滅菌時溫度和滅菌時間存在一定的差異有關(guān)。而經(jīng)過滿棒期、轉(zhuǎn)色期、原基期和采收期后，G 工藝和Z 工藝的培養(yǎng)料含水量變化趨勢相近，均在原基期達(dá)最高，分別為73.37%和73.19%；C 工藝呈逐漸上升趨勢，成熟期時達(dá)最高，為71.57%。綜合分析來看，C 工藝的含水量變化幅度相對較小，而Z工藝和G工藝的整體變化幅度相對較大。

圖1 培養(yǎng)料理化特性Fig.1 Physicochemical properties of culture medium

栽培過程中培養(yǎng)料碳氮比的變化如圖1-b 所示：香菇整個生長過程中，碳氮比的變化整體呈先降后升的趨勢，均在原基期達(dá)最低值，其中C工藝由滅菌前的95.94%下降為36.41%；Z 工藝由滅菌前的95.94%下降為30.98%；G 工藝由滅菌前的95.94% 下降為29.56%。

圖1-c、d、e 分別為纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維素含量的變化，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，整體均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在菌絲生長階段（時期1～3）降解較慢，進(jìn)入生殖生長階段（時期4～5）降解較快，尤其是木質(zhì)素。在香菇的生長發(fā)育階段，纖維素含量表現(xiàn)為C 工藝>G 工藝>Z 工藝，其中G 工藝和Z 工藝兩者相差不大；半纖維素含量表現(xiàn)為Z 工藝>C 工藝>G 工藝；木質(zhì)素含量表現(xiàn)為G工藝>Z工藝>C工藝。

綜上所述，不同滅菌工藝對培養(yǎng)料的含水量、碳氮比和木質(zhì)纖維素降解存在一定的影響。隨著滅菌壓力的逐漸增強(qiáng)，含水量的上升幅度和碳氮比的下降幅度均逐漸增強(qiáng)。而在木質(zhì)纖維素方面的差異主要表現(xiàn)在不同組分上，其中G 工藝在纖維素和半纖維素降解方面表現(xiàn)較強(qiáng)，Z 工藝在纖維素降解方面表現(xiàn)較強(qiáng)，而C工藝則是在木質(zhì)素降解方面表現(xiàn)較強(qiáng)。

2.3 不同滅菌工藝培養(yǎng)料中菌群多樣性比較分析

通過Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，3 種不同滅菌工藝細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)無顯著差異，而在Simpson 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)水平上存在顯著性差異，其中Simpson 指數(shù)表現(xiàn)為C 工藝>G 工藝>Z 工藝，Chao1和ACE 指數(shù)均表現(xiàn)為Z 工藝>C 工藝>G 工藝。綜上，C工藝在菌群多樣性方面顯著高于G 工藝和Z 工藝（Simpson 指數(shù)）；Z 工藝在菌群豐富度方面顯著高于G工藝和C工藝（Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)）（表3）。

表3 不同滅菌工藝培養(yǎng)料中細(xì)菌的豐度和多樣性Table 3 Abundance and diversity bacteria in culture media by different sterilization on processes

2.4 不同滅菌工藝對培養(yǎng)料中微生物菌群的影響

相對豐度較大的優(yōu)勢菌群可以直接反映樣本自身的特性或與周圍環(huán)境之間的關(guān)系［21］。不同滅菌工藝培養(yǎng)料中微生物菌群動態(tài)變化結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果表明，不同滅菌工藝條件下，不同物種的相對豐度存在較大的差異。

三種滅菌工藝門水平（圖2-a）的優(yōu)勢細(xì)菌菌群組成有較高的相似性，均為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等，但表現(xiàn)在不同的培養(yǎng)時期。C工藝中，相比于C1時期，C2的Proteobacteria豐度升高，替代Firmicutes、Bacteroidetes 和Actinobacteria 等，其中Firmicutes 的豐度下降幅度最大。在G工藝中，G1時期的Proteobacteria 和Firmicutes 豐度較高，在隨后的時期，F(xiàn)irmicutes的豐度逐漸降低，而Proteobacteria的豐度逐漸升高，至G4時成為豐度最高的門。在Z工藝中，Z1時期Firmicutes等豐度較高，其次為Proteobacteria，在隨后的培養(yǎng)時期中，Proteobacteria在Z2時期豐度達(dá)最高，隨后逐漸降低，至Z5 時期又有所上升，而Firmicutes 的豐度隨培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。

三種滅菌工藝條件下相對豐度排名前16 的優(yōu)勢菌屬如圖2-b 所示，不同滅菌工藝和不同培養(yǎng)時期均有所不同。在C工藝中，在C1（空白期）豐度最高的3個屬為不動桿菌屬（Acinetobacter，17.71%）、魏斯氏菌屬（Weissella，17.33%）、乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus，8.05%）；經(jīng)發(fā)菌滿棒后，醋酸桿菌科未知屬（Acetobacteraceae_unclassified，98.62%）替換Acinetobacter、Weissella、Lactiplantibacillus成為C2 時期豐度最高的屬，而C3（轉(zhuǎn)色期）時期豐度最高的3 個屬則為伯克氏菌科未知屬（Burkholderiaceae_unclassified，14.23%）、帕拉伯克霍爾德菌屬（Paraburkhoideria，8.67%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.53%）；C4（原基期）嗜酸菌屬（Acidisoma，9.98%）替換Pseudomonas，與Burkholderiaceae_unclassified（17.73%）、Paraburkholderia（11.45%）成為C4時期豐度最高的3個屬；子實體成熟后，Paraburkholderia的豐度有所提高，為15.92%，與Burkholderiaceae_unclassified（13.83%）和Acidisoma（5.48%）組成豐度較高的3個屬。

G 工藝中，G1 與C1 豐度最高的3 個屬相同，即為Acinetobacter（21.09%）、Weissella（20.08%）、Lactiplantibacillus（10.54%），但豐度表現(xiàn)有所提高；G2 時期，Pseudomonas（7.96%）和嗜鹽單胞菌屬（Halomonas，6.62%）替換Weissella、Lactiplantibacillus，與Acinetobacter（42.27%）成為滿棒期豐度最高的屬；G3（轉(zhuǎn)色期）豐度最高的3 個屬則為Burkholderiaceae_unclassified（23.13%）、顆粒桿菌屬（Granulibacter，22.09%）、Paraburkholderia（7.38%）；G4（原基期）以Acetobacteraceae_unclassified（39.83%）替換Granulibacter，與Burkholderiaceae_unclassified（13.78%）和Paraburkholderia（8.75%）成為豐度最高的3個屬；G5時期的優(yōu)勢屬與G4時期表現(xiàn)相一致，但豐度表現(xiàn)有所差異，其中Burkholderiaceae_unclassified 為22.11%、Paraburkholderia為13.46%、Acetobacteraceae_unclassified為9.82%。

Z 工藝中，Z1 時期豐度最高的3 個優(yōu)勢屬為Weissella（6.95%）、擬桿菌屬（Bacteroides，6.19%）、Acinetobacter（6.01%）；Z2 時期豐度較高的優(yōu)勢菌屬為Acinetobacter（39%）、Acetobacteraceae_unclassified（34.08%）、Pseudomonas（6.55%）；而Z3時期豐度較高的優(yōu)勢菌屬為Paraburkholderia（13.36%）、Burkholderiaceae_unclassified（12.54%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，7.25%）；Z4時期，Acidisoma（8.3%）替換Burkholderia，與Burkholderiaceae_unclassified（17.63%）和Paraburkholderia（10.19%）成為豐度最高的3個屬；而Z5時期的優(yōu)勢菌屬為Burkholderiaceae_unclassified（6.95%）、Paraburkholderia（6.19%）、Burkholderia（4.76%）。

綜上所述，在門水平，三種滅菌工藝在不同時期樣品中的優(yōu)勢菌為Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria等。在屬水平，每個滅菌工藝不同階段都有各自的優(yōu)勢菌，分別為Acetobacteraceae_unclassified、Burkholderiaceae_unclassified、Acinetobacter、Paraburkhoideria、Weissella等。

2.5 碳氮比、纖維素各組分含量與細(xì)菌屬相對豐度的相關(guān)性

SparCC 相關(guān)性熱圖如圖3 所示。在3 種滅菌工藝中，Z工藝中排名前16的細(xì)菌屬與碳氮比、木質(zhì)纖維素各組分含量具有較高的相關(guān)性，其中Burkholderiaceae_unclassified、Gryllotalpicola、Paraburkholderia、Granulibacter、Burkholderia、Alacligenaceae_unclassified、Acidisoma和Bordetella相對豐度與木質(zhì)素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為-0.999；Phocaeicola、Weissella和Lactiplantibacillus相對豐度與纖維素含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均為0.999，而與碳氮比和半纖維素含量之間無顯著相關(guān)性。C 工藝中Pseudomonas相對豐度與纖維素、Burkholderia相對豐度與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.999 和0.963，在G 工藝中，Lactiplantibacillus相對豐度與半纖維素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.994。

圖3 碳氮比、木質(zhì)纖維素各組分含量與細(xì)菌前16個優(yōu)勢屬的SparCC相關(guān)性熱圖Fig.3 Heat map of SparCC correlation between carbon-nitrogen radio，content of lignocellulose components and top 16 dominant bacteria

2.6 細(xì)菌間的相關(guān)性

通過SparCC 分析法分析細(xì)菌菌群間相關(guān)性（屬水平豐度大于0.5%，相關(guān)系數(shù)閾值0.1）網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果如圖4 所示。C 工藝中的物種有28 個，建立了156 條連接，其中有135 條為正相關(guān)連接，正相關(guān)率為86.5%。而在G 工藝中（圖4-b）的物種有28 個，建立了214 條連接，其中有166 條正相關(guān)連接，正相關(guān)率為77.6%；Z工藝中的物種有35 個，建立了285 連接，其中有234 條正相關(guān)連接，正相關(guān)率為82.1%。綜合來看，與G工藝和C 工藝相比，Z 工藝會使物種間建立更多、更復(fù)雜的相關(guān)性連接，這與表2 中Z 工藝中物種的豐富性表現(xiàn)較好的結(jié)論相一致。

圖4 基于SparCC分析屬水平各物種間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Analysis of correlation network among species at genus level based on SparCC

3 討論

食用菌的生長主要依靠培養(yǎng)料提供營養(yǎng)，從菌絲生長、產(chǎn)量和成品率等方面能夠直觀了解到不同滅菌工藝對食用菌的影響［22］，但目前缺少相對系統(tǒng)的試驗數(shù)據(jù)支撐。本研究發(fā)現(xiàn)，高壓滅菌（G）、微壓滅菌（Z）和常壓滅菌（C）在香菇菌絲生長、菌棒成品率和產(chǎn)量方面存在較大的差異，其中Z 工藝和G 工藝的菌絲生長速度和菌棒成品率優(yōu)于C 工藝，而C 工藝和Z 工藝在產(chǎn)量方面的表現(xiàn)優(yōu)于G 工藝。綜合分析來看，Z 工藝在菌絲生長、菌棒成品率和產(chǎn)量方面整體表現(xiàn)較好。推測是因為Z工藝處理的培養(yǎng)料在理化特性和微生物環(huán)境方面更適合香菇的生長。

理化特性是評價食用菌培養(yǎng)料的一個重要指標(biāo)［23］。本研究結(jié)果表明，3 種滅菌工藝在含水量、碳氮比和木質(zhì)纖維素各組分之間均存在一定差異。隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)，C 工藝滅菌后的菌棒含水量呈上升趨勢，而G 工藝和Z 工藝則呈一定的下降趨勢，這可能是由于G工藝的滅菌溫度高、壓力大，容易造成培養(yǎng)料中的水分流失，而C 工藝的滅菌過程壓力低、時間長，滅菌用的水蒸氣在一定程度上會促進(jìn)水分在培養(yǎng)料中的累積。在香菇生長階段，G 工藝和Z 工藝的含水量要顯著高于C 工藝，初步推測G 工藝和Z 工藝在提高菌絲生長代謝方面優(yōu)于C 工藝，這與曹娜等［7］的研究結(jié)果一致，即：食用菌在生長過程中會產(chǎn)生大量的水分，從而導(dǎo)致培養(yǎng)料中的含水量升高。碳氮比作為食用菌生長發(fā)育的關(guān)鍵營養(yǎng)元素之一，其比值過高時會抑制細(xì)菌和其他微生物的生長代謝，分解有機(jī)物的速度放慢，進(jìn)而影響菌絲生長和產(chǎn)量［24-25］，從3個滅菌工藝中碳氮比的變化過程來看，G 工藝和Z 工藝菌絲代謝優(yōu)于C工藝，對培養(yǎng)料有機(jī)物降解有較好的促進(jìn)作用。

培養(yǎng)料是食用菌與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)與能量交換的主要場所，培養(yǎng)料微生物群落與基質(zhì)降解和食用菌生長密切相關(guān)［7］。高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展為研究培養(yǎng)料微生物群落的物種組成、多樣性及群落結(jié)構(gòu)提供了先進(jìn)的方法和手段［26］。雋加香等［27］報道指出雙孢蘑菇二次發(fā)酵和三次發(fā)酵能夠顯著提高培養(yǎng)料Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。本研究表明，Z 工藝中的細(xì)菌總OTU 數(shù)量以及Chao1、ACE 和Shannon 等細(xì)菌多樣性指數(shù)相較于C 工藝和G工藝均有不同程度增加，說明Z 工藝能夠在一定程度上提高培養(yǎng)料細(xì)菌群落豐富度和多樣性。3 個滅菌工藝條件下細(xì)菌群落組成總體相似，在門水平中主要是以能夠降解木質(zhì)素、纖維素的變形菌門、厚壁菌門和放線菌門［28］為主。其中Z 工藝的變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）優(yōu)勢較強(qiáng)；C 工藝的變形菌門優(yōu)勢較強(qiáng)；G 工藝的厚壁菌門優(yōu)勢較強(qiáng)。而在屬水平中，相對豐度較高的包括變形菌門中的醋桿菌科-未分類（Acetobacteraceae_unclassified）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、伯克氏菌科-未分類（Burkholderiaceae_unclassified）和伯克霍爾德菌屬（Paraburkholderia）；厚壁菌門（Firmicutes）中的魏斯氏菌（Weissella）和植物乳桿菌（Lactiplantibacillus）；擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides）。其中變形菌門不僅在碳氮循環(huán)及木質(zhì)纖維素的生物降解中發(fā)揮重要作用，還在葡萄糖、丙酸和丁酸等小分子代謝與轉(zhuǎn)化過程中起著關(guān)鍵性作用［29］。厚壁菌門中的魏斯氏菌（Weissella）在調(diào)節(jié)細(xì)菌環(huán)境和抑制致病菌方面具有顯著作用［30］，擬桿菌門與有機(jī)物的利用密切相關(guān)，能夠分解碳水化合物，將纖維素、半纖維素及其他多糖類物質(zhì)分解成為小分子物質(zhì)［31］。本研究中，木質(zhì)纖維素在3 個滅菌工藝中均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在滅菌后至采收階段，C 工藝的木質(zhì)素降解速率較快，由63.20μg·mg-1下降至44.77 μg·mg-1；G工藝的纖維素和半纖維素降解較快，分別由299.10 μg·mg-1下降至136.23μg·mg-1、56.40 μg·mg-1下降至22.33 μg·mg-1；Z 工藝的纖維素降解速率較快，由324.30 μg·mg-1下降至121.20 μg·mg-1。這可能是由于C工藝中含有豐度更高的Klebsella（10.05%）［32］和Novosphingobium（4.19%）［33］，能降解木質(zhì)素的細(xì)菌，Z 工藝中含有豐度更高的Acinetobacter（39%）［34］，能降解纖維素的細(xì)菌，G 工藝中含有豐度更高的Acinetobacter（42.7%）、Weissella（20.08%）［35］，能降解纖維素和半纖維素的細(xì)菌。結(jié)合細(xì)菌菌群間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，Z 工藝排名前16 的細(xì)菌群落豐度與纖維素和木質(zhì)素含量具有較強(qiáng)的相關(guān)性，可以使物種建立更豐富、更復(fù)雜的連接，為香菇的生長提供較好的微生物環(huán)境。

4 結(jié)論

不同滅菌工藝處理的菌棒在香菇菌絲生長速度、產(chǎn)量、成品率上存在顯著差異，Z 工藝處理的香菇菌棒成品率和菌絲生長速度高于C 工藝，在產(chǎn)量方面高于G工藝。綜合分析表明，Z工藝處理下的培養(yǎng)料具有更好的微生物環(huán)境和較高的纖維素降解能力，但其對香菇產(chǎn)量的影響機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步深入研究。