生姜蛋白酶無機(jī)大分子雜化納米花的制備與研究

羅璇 陳玥 雷晶晶 馬才學(xué) 沈瑞敏

摘要：為提高游離生姜蛋白酶的酶活力，文章利用生姜蛋白酶和無機(jī)金屬鹽離子通過組裝的方法成功合成了一種具有多級(jí)花狀結(jié)構(gòu)的新型納米材料。通過掃描電子顯微鏡確定了生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的組成和結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步優(yōu)化了生姜蛋白酶無機(jī)大分子雜化納米花的制備條件，研究了其酶學(xué)性質(zhì)和使用穩(wěn)定性，初步探索了納米花酶活力與其形貌結(jié)構(gòu)的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以生姜蛋白酶為有機(jī)成分，磷酸銅為無機(jī)成分，制備的酶-無機(jī)雜化納米花的形貌結(jié)構(gòu)與酶濃度、Cu2＋濃度、pH、溫度等因素密切相關(guān)，納米花外表圓潤(rùn)、花瓣飽滿、形狀規(guī)整、粒徑相似時(shí)，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活也更高。當(dāng)酶濃度為0.5 mg/mL、CuSO 4濃度為0.8 mol/L、pH為6.0、溫度為4 ℃時(shí)，酶活力最高，可達(dá)到10 302.2 U/mg，是游離生姜蛋白酶的7 000%，溫度、酸堿穩(wěn)定性較高，重復(fù)使用性較好。

關(guān)鍵詞：生姜蛋白酶；無機(jī)雜化納米花；形貌結(jié)構(gòu)；固定化酶

中圖分類號(hào)：TS201.25? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）07-0081-07

Abstract： To improve the enzyme ability of free ginger protease， in this paper， a new type of nano material with multistage floral structure is successfully synthesized by assembly of ginger protease and inorganic metal salt ions. The composition and structure of ginger protease-inorganic hybrid nanoflower are determined by scanning electron microscopy， the preparation conditions of ginger protease inorganic macromolecule hybrid nanoflower are further optimized， the enzymatic properties and use stability are studied，and the relationship between nanoflower enzyme activity and its morphological structure is preliminarily explored. Experimental results show that with ginger protease as the organic component， copper phosphate as the inorganic component， the morphological structure of the prepared enzyme-inorganic hybrid nanoflower is closely related to enzyme concentration， Cu2+ concentration， pH， temperature and other factors. When nanoflower has round appearance， plump petals， regular shape and similar particle size， ginger protease-inorganic hybrid nanoflower enzyme activity is higher. When the enzyme concentration is 0.5 mg/mL， the CuSO 4 concentration is 0.8 mol/L， the pH is 6.0， and the temperature is 4 ℃， the enzyme ability is the highest， which can reach 10 302.2 U/mg， 7 000% of free ginger protease enzyme activity. The temperature and acid-base stability is higher， and the reusability is better.

Key words： ginger protease; inorganic hybrid nanoflower; morphological structure; immobilized enzyme

生姜蛋白酶是一種新型天然植物蛋白酶，因?yàn)槠淞己玫乃幱脙r(jià)值和在食品添加劑中的廣泛應(yīng)用，具有很大應(yīng)用前景[1]。但因?yàn)橛坞x生姜蛋白酶的不穩(wěn)定性，利用現(xiàn)有固定化技術(shù)，酶活性不高，穩(wěn)定性不強(qiáng)，導(dǎo)致少有人對(duì)其關(guān)注，使得該酶未發(fā)揮出其應(yīng)有的作用[2-3]。

通過固定化作用，可以優(yōu)化酶學(xué)性質(zhì)，增加酶與底物的適用性。酶通過雜化納米修飾具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，一是因?yàn)槊鸽s化納米花的制備過程簡(jiǎn)單，且不涉及任何劇烈的反應(yīng)條件，因此能有效地降低固定化過程中酶活的損失；二是酶雜化納米花具有獨(dú)特的形貌特征和理化特性，如較高的比表面積、穩(wěn)定的金屬骨架，因此能顯著提升酶的穩(wěn)定性、催化效率以及重復(fù)利用性[4-6]。

近年來，多種酶已經(jīng)和無機(jī)物材料成功形成固定化組裝，并且顯著提高了其酶活、重復(fù)使用次數(shù)和穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)表明，蔗糖異構(gòu)酶Pal I結(jié)合Cu2+制備納米花固定化酶，其固定化結(jié)構(gòu)明顯提高了酶的穩(wěn)定性，且具有較好的循環(huán)性能[7]；利用含Cu2+的無機(jī)物與蛋白質(zhì)雜化可以形成雜化納米花，并且酶的穩(wěn)定性及使用效率顯著提高[8]。

本文利用生姜蛋白酶結(jié)合Cu2＋成功合成了一種新型納米花結(jié)構(gòu)材料，并且優(yōu)化了其制備條件，通過掃描電鏡（SEM）確定了生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的組成和結(jié)構(gòu)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了分析和測(cè)試，研究了其酶活力、穩(wěn)定性及重復(fù)利用性。這種新型的生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米生物催化劑將在化工、生化、制藥和生物技術(shù)等工業(yè)過程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮生姜：市售；磷酸氫二鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、三水醋酸鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、硫酸銅、葡聚糖凝膠G-50（均為分析純）；干酪素、酪氨酸、福林酚試劑（均為生物純）。

1.2 儀器與設(shè)備

JSM-6010LA掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 上海繼譜電子科技有限公司；UV2000紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；TG16-WS離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AP224X電子天平 島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜蛋白酶液的制備[9]

取外形完好、無腐爛和機(jī)械損傷的新鮮生姜50 g，洗凈，切成小塊后，加入2倍體積的PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0）研磨30 min，過濾，將濾液收集置于4 ℃冰箱中，2 h后以4 000 r/min離心10 min，上清液即為生姜蛋白酶粗酶液。Sephadex G-50純化生姜蛋白酶，選擇磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0），柱床高度50 cm，上樣量3 mL粗酶，流速45 cm/h，洗脫液總用量150 mL對(duì)粗酶液進(jìn)行Sephadex G-50純化。采用福林酚法測(cè)其初始酶活。

1.3.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[10]

參考文獻(xiàn)[10]，以酪氨酸的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、A 660 nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 生姜蛋白酶酶活的測(cè)定

參考團(tuán)隊(duì)前期的研究成果，分別取生姜蛋白酶酶液和離心后剩余的酪蛋白及酶蛋白沉淀物1 mL于水浴預(yù)熱2 min，混合均勻后繼續(xù)恒溫反應(yīng)10 min，加入 0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，沉淀殘余蛋白。離心，取 1 mL上清液，加入0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL和1 mL稀釋后的福林酚試劑，混合均勻，在40 ℃水浴顯色10 min，采用可見分光光度計(jì)測(cè)其在680 nm處的吸光度。

生姜蛋白酶活力（U）＝A×K×N×7/10。

式中：A為樣品的平均吸光度值；K為100除以酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上100 μg/mL對(duì)應(yīng)680 nm處的吸光度值；N為酶液稀釋倍數(shù)；7為反應(yīng)液總體積；10為酶液分解酪蛋白反應(yīng)時(shí)間10 min。

固定化酶相對(duì)酶活力（%）＝每次使用后固定化酶活力/最高固定化酶活力×100。

1.3.4 酶-無機(jī)雜化納米花的制備工藝優(yōu)化[11-12]

1.3.4.1 不同Cu2+濃度下無機(jī)雜化納米花的制備

配制不同濃度的CuSO 4溶液（0，0.4，0.8，1.0 mol/L），各取0.2 mL于30 mL燒杯中，并加入用PBS緩沖液配制的酶濃度為1 mg/mL的生姜蛋白酶液30 mL。搖勻后室溫靜置培養(yǎng)72 h，分別取上層液體和下層固體測(cè)其酶活，收集沉淀，蒸餾水洗滌3次，然后以4 000 r/min 離心后，收集沉淀，真空冷凍干燥得到納米花。

1.3.4.2 不同酶濃度下無機(jī)雜化納米花的制備

用PBS分別配制不同濃度的生姜蛋白酶液（0，0.5，1.0，2.0 mg/mL），取30 mL于燒杯中，并分別加入0.2 mL 0.8 mol/L的CuSO 4溶液，搖勻后靜置培養(yǎng)72 h。

1.3.4.3 不同pH下無機(jī)雜化納米花的制備

配制0.01 mol/L、pH 7.4的PBS緩沖液，利用NaOH溶液或者鹽酸溶液將PBS緩沖液的pH分別調(diào)至6.0，8.0，10.0，分別配制不同pH的1 mg/mL的生姜蛋白酶溶液，再加入0.2 mL 0.8 mol/L的CuSO 4溶液。

1.3.4.4 不同溫度下無機(jī)雜化納米花的制備

將0.8 mol/L的CuSO 4溶液各取0.2 mL加入3個(gè)燒杯中，再加入用PBS緩沖液配制的酶濃度為1 mg/mL的生姜蛋白酶液30 mL，分別置于－20，4，20 ℃（室溫）下培養(yǎng)72 h。

1.3.5 酶-無機(jī)雜化納米花包埋率的測(cè)定

未知樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：取1 mL待測(cè)上清液，加入4 mL考馬斯亮藍(lán)，在595 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得上清液中酶的含量。通過比較納米花合成前初始酶濃度與納米花合成后上清液中的酶含量，計(jì)算納米花的包埋率：

E=C r-C sC r×100%。

式中：C r為初始酶濃度（mg/mL）；C s為上清液中酶含量（μg/mL）。

1.3.6 酶-無機(jī)雜化納米花實(shí)際酶含量的測(cè)定及其煅燒溫度的確定[13]

實(shí)際酶含量的測(cè)定：通過高溫煅燒，去除納米花中的有機(jī)成分，再通過煅燒前后重量的3次重復(fù)對(duì)比確定納米花中實(shí)際酶含量：

W=G N-G 0G N×100%。

式中： G N為納米花的質(zhì)量（g）； G 0為Cu 3（PO 4）·3H 2O的質(zhì)量（g）。

煅燒溫度的確定：分別稱取200 mg納米花樣品于馬弗爐中煅燒2 h，設(shè)置煅燒溫度分別為500，550，600，650，700 ℃。觀察煅燒后殘余粉末達(dá)到恒重時(shí)的溫度即為煅燒溫度。

1.3.7 酶-無機(jī)雜化納米花熱穩(wěn)定性的測(cè)定

測(cè)定固定化和游離生姜蛋白酶在不同溫度（20～80 ℃）條件下的酶活力，確定最適溫度。然后將兩種酶分別在不同溫度下處理1 h，在最適溫度下檢測(cè)各自酶活力，并計(jì)算熱處理后的剩余酶活力，分析游離生姜蛋白酶和固定化生姜蛋白酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.8 酶-無機(jī)雜化納米花pH穩(wěn)定性的測(cè)定

測(cè)定固定化和游離生姜蛋白酶在不同pH （2.0～10.0）條件下的酶活力，確定最適pH。再將兩種酶分別置于不同pH的PBS緩沖液中處理2 h，檢測(cè)各自酶活力，計(jì)算酸堿處理后剩余的酶活力，分析游離生姜蛋白酶和固定化生姜蛋白酶的pH穩(wěn)定性。

1.3.9 納米花重復(fù)率的測(cè)定[14]

測(cè)定收集好的納米花的吸光度及酶活，并用去離子水重復(fù)洗滌測(cè)定后的納米花，以去除納米花表面殘留的底物和產(chǎn)物，并測(cè)定納米花的吸光度及酶活。

1.3.10 納米花酶活的測(cè)定

通過煅燒法得到了納米花的實(shí)際含酶量，稱量一定量的納米花，使其分散于2 mL PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）中，配制成均勻酶液，計(jì)算其稀釋倍數(shù)并測(cè)其酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.998 1，y=0.010 6x＋0.011 1，說明線性關(guān)系良好。

2.2 制備條件對(duì)酶-無機(jī)雜化納米花形貌表征的影響

根據(jù)SEM（掃描電鏡）分析不同條件下生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的形貌。

2.2.1 不同酶濃度對(duì)無機(jī)雜化納米花的影響

由圖2可知，在不同酶濃度下合成的納米花緊密度和均勻性都不同，當(dāng)生姜蛋白酶濃度為0.5 mg/mL時(shí)，納米花花瓣的緊密程度最佳。當(dāng)生姜蛋白酶濃度為0 mg/mL時(shí)，沒有花狀結(jié)構(gòu)生成且相當(dāng)破碎，可能是由于其生成的納米材料中沒有生姜蛋白酶。說明酶是生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花形成的必要條件，當(dāng)溶液中沒有酶時(shí)，就不能同溶液中的Cu 3（PO 4） 2·3H 2O形成生姜蛋白酶-Cu2＋絡(luò)合物。

2.2.2 不同Cu2＋濃度對(duì)無機(jī)雜化納米花的影響

由圖3可知，隨著Cu2＋濃度的增加，納米花花瓣的排列更加緊密，外表也更加圓潤(rùn)。從納米花外表上看，當(dāng)Cu2＋濃度為0.8 mol/L時(shí)納米花質(zhì)量最好，當(dāng)Cu2＋濃度升高到1.0 mol/L時(shí)，并沒有出現(xiàn)形狀規(guī)則均勻的納米花，只出現(xiàn)了不規(guī)則形狀的生姜蛋白酶-Cu2＋絡(luò)合物，由此可知，當(dāng)Cu2＋濃度過大時(shí)，會(huì)在一定程度上阻礙生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的形成。

2.2.3 不同pH值對(duì)無機(jī)雜化納米花的影響

由圖4可知，在溶液pH為6.0時(shí)，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花花瓣連接緊密，納米花分布均勻，且粒徑尺寸比較統(tǒng)一，在10 μm左右。但隨著溶液pH的增加，納米花花瓣結(jié)構(gòu)逐漸破損且納米花表面的孔隙在此條件下生長(zhǎng)不完全。所以pH 6.0是生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的最佳孵育pH。當(dāng)溶液pH過堿時(shí)，納米花不能在溶液中穩(wěn)定存在，可能是因?yàn)榇藭r(shí)溶液的pH和生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的最適合pH相差較大，造成納米花的形態(tài)差別較大。

2.2.4 不同溫度對(duì)無機(jī)雜化納米花的影響

由圖5可知，當(dāng)溶液放置在－20 ℃下孵育納米花時(shí)，生成的生姜蛋白酶-Cu2＋絡(luò)合物排列緊密，但從納米花的微觀形態(tài)上看，全是破碎的花瓣，表面結(jié)構(gòu)不完整，幾乎沒有完整的納米花。隨著納米花孵育溫度增加到4 ℃，破損的納米花花瓣結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橥獗盹枬M、花瓣排列緊密的納米花。隨著溫度的繼續(xù)增加，納米花花瓣又逐漸破損。由此可知，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的最佳孵育溫度為4 ℃。

通過以上4個(gè)生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花最優(yōu)孵育條件的測(cè)定，結(jié)合SEM對(duì)酶-無機(jī)雜化納米花形貌的影響分析可以得出：生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花中最佳CuSO 4添加量為0.8 mol/L，最佳生姜蛋白酶濃度為0.5 mg/mL，最佳孵育溫度為4 ℃，最佳孵育pH為6.0。

當(dāng)酶濃度為0.5 mg/mL、CuSO 4濃度為0.8 mol/L、pH為6.0、溫度為4 ℃時(shí)，測(cè)得生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活力最高，可達(dá)10 302.2 U/mg，但預(yù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)得生姜蛋白酶活力為138.143 U/mg，是游離生姜蛋白酶的7 000%，說明以生姜蛋白酶為有機(jī)成分、磷酸銅為無機(jī)成分，制備的酶-無機(jī)雜化納米花的形貌結(jié)構(gòu)與酶濃度、Cu2＋濃度、pH、溫度等因素密切相關(guān)，納米花外表圓潤(rùn)、花瓣飽滿、形狀規(guī)整、粒徑相似時(shí)，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活也更高。

2.3 制備條件對(duì)酶-無機(jī)雜化納米花催化活性的表征

2.3.1 不同制備條件下納米花的包埋率

2.3.1.1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)曲的制備

由圖6可知，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：y＝0.009 2x＋0.038 5，其中R2＝0.998 5，證明考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線性良好，其中x為蛋白濃度，y為吸光值。

2.3.1.2 不同制備pH下的包埋率

不同制備pH下的包埋率見表1。

2.3.1.3 不同制備溫度下的包埋率

不同制備溫度下的包埋率見表2。

2.3.1.4 不同制備酶濃度下的包埋率

不同制備酶濃度下的包埋率見表3。

2.3.1.5 不同制備Cu2+濃度下的包埋率

不同制備Cu2＋濃度下的包埋率見表4。

利用各種不同生成條件下的納米花測(cè)定其包埋率，由表3可知，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的包埋率在酶濃度為0.5～1.0 mg/mL范圍內(nèi)隨酶濃度的增加而增加，但當(dāng)酶濃度過大（2.0 mg/mL）時(shí)，包埋率不能繼續(xù)增加，過多的酶并不能隨著酶濃度的增加而被固定。由表1～表4可知，納米花的包埋率隨CuSO 4添加量、最佳孵育溫度、最佳孵育pH的變化不顯著。

2.3.2 不同制備條件下納米花的酶活

2.3.2.1 不同制備酶濃度下的酶活

不同制備酶濃度下的酶活見表5。

通過對(duì)不同酶濃度下制成的生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)利用生姜蛋白酶濃度分別為0.5，1.0，2.0 mg/mL時(shí)，制備出的生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的平均酶活分別為10 138.7，7 639.4，3 044.8 U/mg。其中納米花酶活最高的為初始生姜酶濃度在0.5 mg/mL時(shí)，而在相同條件下所測(cè)的游離生姜蛋白酶酶活為138 U/mg，通過計(jì)算可得酶濃度在0.5 mg/mL時(shí)孵育的納米花的酶活是游離生姜蛋白酶的7 347%，而在初始生姜酶濃度為0.5 mg/mL時(shí)形成的納米花花瓣的緊密程度也最佳，由此可以推斷出，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的結(jié)構(gòu)完整性和其酶活力有一定的關(guān)系。

2.3.2.2 不同制備Cu2+濃度下的酶活

不同制備Cu2＋濃度下的酶活見表6。

從納米花外表看，當(dāng)Cu2＋濃度為0.8 mol/L時(shí)納米花質(zhì)量最好。經(jīng)過測(cè)定，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花酶活隨著Cu2＋濃度的增加而增加，當(dāng)Cu2＋濃度升高到0.8 mol/L時(shí)，納米花酶活最高，平均達(dá)到13 506 U/mg。但是Cu2＋濃度繼續(xù)增加，納米花酶活又逐漸降低到4 390 U/mg左右。在圖3中可以觀察到Cu2＋濃度為1.0 mol/L時(shí)只出現(xiàn)了不規(guī)則形狀的生姜蛋白酶-Cu2＋絡(luò)合物。表明Cu2＋濃度對(duì)納米花酶活有顯著的影響，再次印證了納米花的酶活力和其形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。

2.3.2.3 不同制備pH下的酶活

不同制備pH下的酶活見表7。

本實(shí)驗(yàn)選擇6.0，8.0，10.0為孵育pH，經(jīng)過計(jì)算得到在不同pH下孵育的生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活，得出pH 6.0，8.0，10.0制備的生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的平均酶活分別為8 949.4，6 437.9，4 162.5 U/mg?？梢钥闯黾{米花的酶活隨著制備pH的升高而降低。由圖4可知，極端pH會(huì)對(duì)納米花的合成及酶活產(chǎn)生一些不良的影響。

2.3.2.4 不同制備溫度下的酶活

不同制備溫度下的酶活見表8。

通過對(duì)不同孵育溫度下生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花酶活進(jìn)行檢測(cè)，得到溫度為－20，4，20 ℃下制備的生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的平均酶活分別為2 721.7，7 634.4，5 731.8 U/mg。發(fā)現(xiàn)在溫度為－20 ℃時(shí)納米花酶活極小，這時(shí)通過掃描電子顯微鏡觀察并沒有發(fā)現(xiàn)納米花的存在，其形態(tài)上只呈現(xiàn)出破碎的花瓣?duì)?，其原因可能是在?0 ℃時(shí)Cu2＋與生姜蛋白酶不能通過不斷的配位而交聯(lián)生長(zhǎng)。

2.3.3 不同制備酶濃度下納米花的實(shí)際含酶量

納米花質(zhì)量變化見表9，不同酶濃度下實(shí)際含酶量見表10。

一定的高溫條件可以去除納米花中絕大多數(shù)的生姜蛋白酶（有機(jī)成分），留下的藍(lán)綠色固體為Cu 3（PO 4） 2（無機(jī)成分），通過計(jì)算可以得出納米花中的實(shí)際含酶量。由表10可知，在酶濃度為0.5，1.0，2.0 mg/mL時(shí)納米花的實(shí)際含酶量平均為12.8%、21.2%、52.7%，在0.5～2.0? mg/mL酶濃度范圍內(nèi)，納米花的酶含量隨著酶濃度的增加而增加，但酶濃度過高會(huì)導(dǎo)致納米花結(jié)構(gòu)過于致密，造成物質(zhì)傳遞受到阻礙，并不利于酶與底物相接觸，可能還會(huì)導(dǎo)致酶活降低，與表5的研究結(jié)果一致。

2.4 酶-無機(jī)雜化納米花pH穩(wěn)定性分析

對(duì)納米花的pH穩(wěn)定性進(jìn)行了探究，考察了等量固定化酶和游離酶在不同pH（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0）下處理2 h后的酶活。由圖7可知，在不同pH下，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花和游離生姜蛋白酶表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，酶活先上升，在pH 6.0時(shí)都達(dá)到最大值，隨后pH上升，酶活隨之下降。這表明生姜蛋白游離酶的固定化并沒有改變生姜蛋白酶的最適pH。

2.5 酶-無機(jī)雜化納米花的熱穩(wěn)定性

由圖8可知，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花和游離生姜蛋白酶的最適溫度皆為60 ℃，結(jié)果表明生姜蛋白游離酶的固定化并沒有改變生姜蛋白酶的最適溫度。當(dāng)溫度從60 ℃繼續(xù)升高后，納米花和游離酶酶活反而下降，說明溫度過高會(huì)使蛋白酶高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，使酶變性失活。

2.6 酶-無機(jī)雜化納米花的重復(fù)率

最后進(jìn)行可重復(fù)性能研究，結(jié)果見圖9。生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花第1次的相對(duì)酶活是100%，使用6次后其活性仍能維持初始值的30%，說明生姜蛋白酶納米花材料重復(fù)使用性能良好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以自制生姜蛋白酶作為有機(jī)成分，以磷酸銅作為無機(jī)成分，成功組裝了生姜蛋白酶-磷酸銅雜化納米花固定化材料，并詳細(xì)研究了其制備條件、酶學(xué)性質(zhì)，考察了納米花形態(tài)與納米花酶活之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在納米花外表圓潤(rùn)、花瓣飽滿、形狀規(guī)整、粒徑相似時(shí)，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活更高。得到了生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的最佳制備條件：酶濃度為0.5 mg/mL，CuSO 4濃度為0.8 mol/L，pH為6.0，溫度為4 ℃，此時(shí)酶活力最高，可達(dá)到10 302.2 U/mg，是游離生姜蛋白酶的7 000%。發(fā)現(xiàn)生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的酶活和其實(shí)際含酶量不成正比，生姜蛋白酶-無機(jī)雜化納米花的重復(fù)使用性較好，其溫度和pH穩(wěn)定性均有所提高。

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