低溫預(yù)處理對液態(tài)發(fā)酵黑蒜品質(zhì)的影響

賈慶超 張夢月 于婉婉 汪小鉻 劉懿鋒

摘要：主要研究低溫預(yù)處理對液態(tài)發(fā)酵黑蒜品質(zhì)的影響，以新鮮大蒜為原料，分別進行冷凍（－18 ℃）和冷藏（4 ℃）預(yù)處理，時間為4，8，12 h。以新鮮大蒜作為參照，首先利用低場核磁考察預(yù)處理后大蒜的水分遷移情況，其次以預(yù)處理后大蒜為原料制備液態(tài)黑蒜，將其處理成粒徑為4 mm的大蒜顆粒，料液比為4∶1，于85 ℃的恒溫恒濕發(fā)酵箱中進行發(fā)酵，共發(fā)酵24 d，每隔2 d分別測定3種不同液態(tài)發(fā)酵黑蒜中還原糖含量、總酚含量、總黃酮含量、褐變程度、pH和抗氧化活性等品質(zhì)指標。結(jié)果表明，冷藏和冷凍預(yù)處理有利于大蒜中的結(jié)合水形成自由水，提升自由水活度。同時，經(jīng)過冷凍和冷藏預(yù)處理的大蒜各項指標均優(yōu)于未處理的大蒜，冷凍處理8 h的液態(tài)發(fā)酵黑蒜的品質(zhì)優(yōu)于冷凍4 h和12 h的黑蒜，冷藏處理12 h的液態(tài)發(fā)酵黑蒜的品質(zhì)優(yōu)于冷藏8 h和12 h的黑蒜，且冷凍8 h和冷藏12 h預(yù)處理后，總酚含量、總黃酮含量、還原糖含量、DPPH·和·OH清除率均顯著提升，在恒溫恒濕發(fā)酵箱中發(fā)酵16 d左右，得到的液態(tài)發(fā)酵黑蒜的各項指標更好，品質(zhì)更佳。此研究預(yù)處理時間短，用于制備液態(tài)黑蒜可節(jié)約時間成本和能量成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：液態(tài)發(fā)酵黑蒜；低溫預(yù)處理；低場核磁；水分活度；品質(zhì)指標

中圖分類號：TS205.5? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）07-0073-08

Abstract： The effects of low-temperature pretreatment on the quality of liquid-state fermented black garlic is mainly studied. Fresh garlic is used as the raw material and pretreated by freezing （－18 ℃） and cold storage （4 ℃） for 4， 8， 12 h. Firstly， taking fresh garlic as the reference， the water migration of the pretreated garlic is investigated by low-field NMR. Secondly， the pretreated garlic is used as the raw material to prepare liquid-state black garlic， which is processed into garlic granules with the particle size of 4 mm， and the ratio of solid to liquid is 4∶1. The garlic is fermented in a constant temperature and humidity fermentor at 85 ℃ for 24 days. Every two days， the quality indexes such as reducing sugar content， total phenol content， total flavone content， browning degree， pH and antioxidant activity of three different liquid-state fermented black garlic are measured. The results show that cold storage and freezing pretreatments are beneficial to the formation of free water by bound water and the increase of free water activity in garlic. At the same time， all indexes of garlic pretreated by freezing and cold storage are better than those of untreated garlic. The quality of liquid-state fermented black garlic pretreated by freezing for 8 h is better than that of liquid-state fermented black garlic pretreated by freezing for 4 h and 12 h. The quality of liquid-state fermented black garlic pretreated by cold storage for 12 h is better than that of liquid-state fermented black garlic pretreated??by cold storage for 8 h and 12 h. Moreover， the total phenol content， total flavone content， reducing sugar content， DPPH· and ·OH? scavenging rates all significantly increase after the pretreatment of freezing for 8 h and cold storage for 12 h. After fermentation in constant temperature and humidity fermentor for about 16 days， the indexes and quality of the obtained liquid-state fermented black garlic are better. The pretreatment time of this study is short， can save time cost and energy cost when it is used to prepare liquid-state black garlic， and has broad application prospect.

Key words： liquid-state fermented black garlic; low-temperature pretreatment; low-field NMR; water activity; quality index

黑蒜又名發(fā)酵黑蒜，口感酸甜軟糯，而且沒有普通大蒜的蒜臭味和辛辣刺激感，在高溫高濕條件下發(fā)酵而制得，與新鮮大蒜相比，發(fā)酵黑蒜不僅保留了普通大蒜原有的所有營養(yǎng)物質(zhì)[1]，而且其含有的營養(yǎng)成分比普通大蒜增加了很多，其中蛋白質(zhì)、還原糖、維生素等物質(zhì)的含量至少為普通大蒜的2倍[2]。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的熱量加速了高分子量多糖降解為低分子量低聚糖和單糖，從而轉(zhuǎn)化為水溶性生物活性化合物，如S-烯丙基半胱氨酸、生物堿、多酚和類黃酮化合物，這些化合物與黑蒜的抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗過敏、提升免疫力、降血脂、降血糖、保護肝臟等保健功能有關(guān)，黑蒜的這些保健功能物質(zhì)取決于其加工的工藝條件[3-4]。研究表明，預(yù)處理工藝可以改變黑蒜的保健功能活性物質(zhì)，大蒜的低溫預(yù)處理可以在一定程度上破壞大蒜的細胞結(jié)構(gòu)，有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生[5]。目前黑蒜制備主要有固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵兩種工藝。相對于固體發(fā)酵黑蒜而言，液態(tài)發(fā)酵黑蒜由于大蒜發(fā)酵狀態(tài)的改變，不但具有更好的黑蒜品質(zhì)，而且具有更短的發(fā)酵時間[6]，但目前關(guān)于液態(tài)發(fā)酵黑蒜的研究國內(nèi)外卻鮮有報道。為了開發(fā)品質(zhì)更好的液態(tài)黑蒜，本研究在制備液態(tài)黑蒜前對新鮮大蒜分別進行低溫冷藏4 ℃和冷凍-18 ℃預(yù)處理，利用低場核磁考察冷藏和冷凍對大蒜水分遷移的影響，并分別測定液態(tài)黑蒜發(fā)酵過程中還原糖含量、總酚含量、pH值、褐變程度、總黃酮含量、抗氧化性等品質(zhì)指標，得到大蒜最佳低溫預(yù)處理時間和液態(tài)黑蒜的最佳品質(zhì)指標。本試驗的開展不但彌補了液態(tài)發(fā)酵黑蒜這一部分的研究空缺，同時也為液態(tài)黑蒜的發(fā)酵研究提供了有力的數(shù)據(jù)參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市售；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硝酸鈉、葡萄糖、氫氧化鈉、無水硫酸銅、亞甲基藍：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；亞鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、鄰菲啰啉、酒石酸鉀鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；蘆丁：江西佰草源生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚1 mol/L：福州飛凈生物科技有限公司；焦性沒食子酸、乙酸鋅：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；無水碳酸鈉：天津市百世化工有限公司；濃鹽酸、無水乙醇、30%過氧化氫、冰乙酸：天津市風船化學(xué)試劑科技有限公司，以上試劑皆為分析純（AR）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004B型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PHB-5型便攜式pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；恒溫發(fā)酵箱 上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；Anke TDL-50B型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水溫箱、電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；KQ5200B型機械型超聲波清洗器 上海合金超聲設(shè)備有限公司；NM120型低場核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；UV-4802H型紫外分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；CR-400型色差儀 日本Minolta公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 液態(tài)發(fā)酵黑蒜工藝流程

參考Zhang等[7]的黑蒜加工工藝流程，工藝流程：選取新鮮、無變質(zhì)大蒜→去皮→清洗→冷凍、冷藏預(yù)處理→去根蒂→蒜瓣破碎→裝罐→加水→85 ℃恒溫恒濕發(fā)酵箱中發(fā)酵→成品→各理化指標測定。

操作要點：選取新鮮無變質(zhì)的大蒜，進行去皮。分別進行冷凍（－18 ℃）和冷藏（4 ℃）處理，處理時間均為4，8，12 h，與未處理的大蒜一起破碎為4 mm，設(shè)置料液比為4∶1，于85 ℃恒溫恒濕發(fā)酵箱中進行發(fā)酵[8]。每2 d取一定量的發(fā)酵黑蒜，測定其還原糖含量、總黃酮含量、總酚含量、褐變程度、pH和抗氧化性（DPPH·清除率、·OH清除率）。

1.3.2 大蒜水分分布及遷移的測定

參考張華等[9]的測定方法，將冷凍、冷藏和新鮮大蒜相同部位切塊，利用核磁共振成像分析儀跟蹤測定大蒜水分分布，利用CMPG脈沖序列測定樣品的橫向弛豫時間（T 2），將樣品置于永久磁場中心位置的射頻線圈的中心，進行CPMG脈沖序列試驗。

1.3.3 褐變程度的測定

根據(jù)Li等[10]的方法，使用色差計測量色度。在色差計中，樣品的顏色由3個維度 L*、a*和 b*表示。 L*（反射率）值衡量產(chǎn)品對光的反射，范圍從完美白色的 100 到黑色的 0。紅色/綠色和黃色/藍色分別用a*和 b*值表示。色差計在測量前使用白色和黑色標準進行校準。褐變程度以ΔE表示。

ΔE=[（L*—L 0）2+（a*—a 0）2 +（b*—b 0）2 ]1/2。

式中：L*、a*、b*分別為色差計的測定值；L 0、a 0、b 0分別為未進行任何處理的大蒜的測定值。

1.3.4 還原糖含量的測定

根據(jù)GB 5009.7－2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》中直接滴定法測定液態(tài)發(fā)酵黑蒜中還原糖含量。

1.3.4.1 樣液制備

準確稱取黑蒜2.500～5.000 g于250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水50 mL，加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，然后加蒸餾水至刻度，混勻，靜置30 min后過濾，棄初濾液，待測。

1.3.4.2 堿性酒石酸銅溶液的配制與標定

堿性酒石酸銅甲液：準確稱取無水硫酸銅固體試劑7.500 g和亞甲藍試劑0.025 g，用蒸餾水溶解，并定容至500 mL容量瓶中。

堿性酒石酸銅乙液：準確稱取酒石酸鉀鈉固體試劑25.000 g和氫氧化鈉固體37.500 g ，用適量蒸餾水溶解后加入亞鐵氰化鉀固體試劑2.000 g，溶解后，用蒸餾水定容至500 mL容量瓶中。

準確吸取堿性酒石酸銅甲液和乙液各5.00 mL，蒸餾水10 mL，加入到含有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，加葡萄糖標準溶液約9 mL，使溶液在2 min內(nèi)加熱至沸騰，以2 s/滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標液，溶液藍色褪去即為滴定終點，記錄此時消耗的葡萄糖標液總體積，平行測定3次，取平均值。

1.3.4.3 試樣溶液測定

按上述方法，用樣液滴定至終點，記錄消耗的體積，平行測定3次，取平均值。

還原糖含量：X=100m 1/（m×F×V×250×1 000）。

式中：X為試樣中還原糖含量（g/100 g）；m 1為堿性酒石酸銅甲、乙液相當于還原糖的質(zhì)量（mg）；m為樣品質(zhì)量（g）；F為系數(shù)1；V為消耗的試樣體積（mL）；250為定容體積（mL）；1 000為換算系數(shù)。

1.3.5 pH值的測定

按照GB/T 10468－1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測定方法》測定黑蒜提取液的pH值：先對pH計進行校準，然后取發(fā)酵黑蒜提取液于塑料容器中，使其容量足以浸沒電極，用pH計進行測定。

1.3.6 總酚含量的測定

采用福林酚法[11]測定液態(tài)發(fā)酵黑蒜中總酚的含量。

1.3.6.1 沒食子酸標液的配制

0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液：準確稱取0.005 g沒食子酸固體， 用蒸餾水溶解，于50 mL容量瓶中稀釋至刻度。

1.3.6.2 繪制標準曲線

準確吸取上述標準液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL分別于10 mL容量瓶中，向容量瓶加入蒸餾水6.00 mL充分搖勻，加入福林試劑0.50 mL搖勻。1 min后，加入20% NaCO 3溶液1.50 mL，充分混勻后定容至刻度。75 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，在760 nm波長下測吸光度，得到標準曲線（Y=138.27X+0.041 4，R2=0.997 8），見圖1。

1.3.6.3 樣液制備與測定

準確稱取液態(tài)黑蒜樣品1.000 g于250 mL錐形瓶中，加入70%乙醇25.00 mL。超聲浸提30 min后，過濾至50 mL容量瓶中，定容。用吸量管從50 mL容量瓶中準確吸取樣液2.00 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。用吸量管準確吸取上述樣液1.00 mL于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水6.00 mL混勻，加福林試劑0.50 mL充分混勻，1 min后向其中加入1.50 mL 20% Na 2CO 3溶液，定容至刻度，混勻。75 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，在760 nm波長處測吸光度。

1.3.7 總黃酮含量的測定

參考趙曉娟等[12]的方法測定液態(tài)發(fā)酵黑蒜中總黃酮含量。

準確吸取0.2 mg/mL蘆丁，60%乙醇標液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于10 mL比色管中，向比色管中加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，放置6 min，加5%硝酸鋁溶液0.30 mL，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液2.00 mL，混勻后，用30%乙醇溶液補充體積至10 mL，放置15 min后于510 nm波長處測吸光度。得到標準曲線（Y=10.864X+0.005 3，R2=0.999 9），見圖2。

總黃酮的提?。簻蚀_稱取黑蒜樣品1.000 g于250 mL錐型瓶中，加入70%乙醇25.00 mL。超聲浸提30 min后，過濾至50 mL容量瓶中，反復(fù)沖洗錐形瓶后定容。

樣液測定：準確吸取0.20 mL上述樣液于10 mL比色管中，向比色管中加入0.30 mL亞硝酸鈉溶液，6 min后，加0.30 mL硝酸鋁溶液，6 min后，加2.00 mL氫氧化鈉溶液，充分混勻后，用30%乙醇溶液補充體積至刻度，15 min后，于510 nm波長處測吸光度，以不加硝酸鋁溶液為對照。計算公式如下：

總黃酮含量：X=（C×V×A）/B。

式中：X為總黃酮含量（mg/g）；C為根據(jù)標曲所求濃度（mg/mL）；V為所取液態(tài)黑蒜體積（mL）；A為所取待測液稀釋倍數(shù)；B為樣品質(zhì)量（g）。

1.3.8 抗氧化活性的測定

參考趙曉娟等[12]關(guān)于DPPH·和·OH清除活性的測定方法，進行抗氧化活性的測定。

2 結(jié)果分析

2.1 低場核磁水分遷移分析

低場核磁共振作為一種新型的無損檢測方法被廣泛用于研究食品中的水分狀態(tài)、分布及組成和遷移規(guī)律等，每個峰代表水的一種存在形式[13-15]。由圖3可知，在冷藏、冷凍和新鮮大蒜中，均存在3種水，分別為（T21）強結(jié)合水、（T22）弱結(jié)合水和（T23）自由水[16]，由于峰面積代表水含量的大小，故強結(jié)合水含量很少，大蒜中的水以自由水為主[17]。冷藏和冷凍預(yù)處理后的大蒜自由水含量分別為冷藏12 h>冷藏8 h>冷藏4 h、冷凍8 h>冷凍4 h>冷凍12 h，且相對于新鮮大蒜而言，自由水含量均相對增多，弱結(jié)合水含量均相對減少，說明冷藏和冷凍預(yù)處理破壞了大蒜的組織和細胞，促進了自由水在大蒜中的進出。同時，劉袆帆等[17]指出經(jīng)過冷藏和冷凍處理后的大蒜，自由水T23的弛豫時間越長，水的流動性越大，水分的活度越大，由圖3可知，冷藏和冷凍處理后大蒜水分活度大小為冷藏12 h>冷藏8 h>冷藏4 h、冷凍8 h>冷凍4 h>冷凍12 h，與水分含量結(jié)果較一致。自由水含量影響黑蒜美拉德反應(yīng)的速率[17]，由此可推測，冷藏12 h和冷凍8 h的大蒜能夠制備出品質(zhì)較好的黑蒜。

2.2 褐變程度

ΔE的大小意味著黑蒜顏色的深淺，值越大，大蒜的褐變程度越大，黑蒜的顏色越深[18]。在發(fā)酵過程中，大蒜中的還原糖與氨基酸相互作用，發(fā)生羰氨反應(yīng)，產(chǎn)生類黑精，使大蒜變黑，大蒜越黑證明美拉德反應(yīng)越完全[19]。由圖4可知，冷凍和冷藏大蒜在發(fā)酵期內(nèi)比未處理大蒜的褐變程度大，說明冷凍和冷藏均對大蒜的褐變起促進作用。冷凍處理條件下褐變程度的變化為8 h>12 h>4 h，當冷凍時間達到8 h時，大蒜的褐變程度最大，而冷藏處理中褐變程度的變化為12 h>8 h>4 h，褐變程度隨處理時間的增加呈現(xiàn)升高趨勢，說明冷藏有利于褐變的發(fā)生。在冷凍處理8 h和冷藏處理12 h發(fā)酵第16天時，褐變值分別達到了79和75，黑蒜已經(jīng)完全熟化，此時未處理的大蒜的褐變值僅為59。褐變程度隨美拉德反應(yīng)時間的延長而增大，這是由于低溫對大蒜細胞產(chǎn)生破壞，使大蒜中的糖類能更早地和氨基酸作用，從而使褐變速度加快，反應(yīng)后期趨于穩(wěn)定，表明黑蒜熟化基本完成[19]。由此可知，在發(fā)酵16 d時熟化基本完成，冷凍處理8 h后褐變程度更大。

2.3 還原糖含量

黑蒜中的還原糖含量取決于兩個因素：一是大蒜中的多糖被降解為還原糖，二是還原糖在美拉德反應(yīng)過程中被消耗，所以黑蒜中還原糖含量的變化是二者共同作用的結(jié)果，還原糖作為美拉德反應(yīng)的重要底物，其含量不僅影響著黑蒜褐變的速度，而且影響其口感，較高的還原糖含量既有利于黑色素的形成，又可賦予黑蒜軟糯酸甜的口感[20]。由圖5可知，經(jīng)過低溫前處理的大蒜，還原糖含量均高于未處理的大蒜。大蒜發(fā)酵過程中，黑蒜中的還原糖含量均呈上升趨勢，當達到一定程度后略有下降，趨于穩(wěn)定。冷凍處理條件下還原糖含量為8 h>4 h>12 h，冷藏處理條件下還原糖含量為12 h>8 h>4 h，這是由于大蒜經(jīng)過低溫處理后，再次處于高溫環(huán)境中，可使細胞內(nèi)組織液流出，果聚糖與果聚糖酶充分接觸并發(fā)生水解，產(chǎn)生還原糖類物質(zhì)。還原糖含量越高，意味著反應(yīng)底物增加，加快褐變的發(fā)生。由圖5還可知，在冷凍8 h和冷藏12 h時還原糖含量較高，分別在第14天和第16天達到最大值，分別為53.2，48.6 g/100 g，未處理黑蒜的還原糖含量在第20天時達到最大值32.3 g/100 g，相比分別增大到1.65倍和1.50倍。與陳玲等[16]所探究的結(jié)果相近，但是陳玲等的最佳冷凍處理時間為5 d，并且進行了真空包裝處理，過程較繁瑣且預(yù)處理時間較長。本文冷凍時間較短，同時進行破碎處理，進行液態(tài)發(fā)酵，預(yù)處理時間較短，縮短了時間和能量成本。李超峰等[21]采用糖化變溫處理工藝，得到還原糖含量為32.14 g/100 g，低于本文低溫預(yù)處理所得還原糖含量。總體來看，本研究低溫處理有利于還原糖含量的升高，說明低溫預(yù)處理有利于促進還原糖的生成。

2.4 pH值

pH值是反映黑蒜品質(zhì)的重要理化指標之一[22]。不同低溫預(yù)處理方式和處理時間制得的黑蒜在發(fā)酵過程中pH的變化見圖6。

隨著發(fā)酵時間的延長，pH均呈現(xiàn)下降趨勢，且經(jīng)過低溫處理的大蒜的pH值均低于未處理大蒜。在冷凍處理條件下，pH值的大小為8 h<4 h<12 h，冷藏處理條件下為12 h<8 h<4 h。在冷凍8 h和冷藏12 h時pH值最低，達到了4.78和4.69，此時未處理的大蒜的pH值為4.98。pH值降低是由于大蒜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，而酸性物質(zhì)的產(chǎn)生則是由于發(fā)酵過程中還原糖中的—OH被逐步氧化為有機酸中的—COOH[23]。有研究表明，黑蒜提取物的抗氧化性隨pH值的升高而下降，pH值在7.0以下，其抗氧活性隨pH值的升高下降程度緩慢，pH值在7.0以上，其抗氧化活性下降較快[24]。因此，黑蒜在發(fā)酵過程中，pH值的下降更有利于提高其抗氧化性。由圖6可知，經(jīng)過冷藏處理12 h制備的黑蒜的pH值降低幅度最大，優(yōu)于冷凍和其他冷藏時間的黑蒜。

2.5 總酚含量

酚類物質(zhì)是體現(xiàn)黑蒜抗氧化能力的一個重要功能性成分，與黑蒜的抗氧化活性緊密相關(guān)，是衡量黑蒜品質(zhì)的重要指標之一[22]。由圖7可知，總酚含量均為上升趨勢且在16～20 d左右達到最大值，之后呈略微下降的穩(wěn)定趨勢。不難看出，經(jīng)過低溫處理的大蒜在發(fā)酵過程中總酚含量明顯高于未經(jīng)過處理的大蒜。這是由于大蒜經(jīng)低溫處理后，在高溫條件下進行發(fā)酵，瞬間升高溫度使大蒜細胞組織迅速遭到破壞，細胞膜的通透性增加，使其內(nèi)容物流出，導(dǎo)致褐變進程加快，從而使總酚含量大量積累，當褐變程度達到一定程度時不再發(fā)生，總酚含量也趨于穩(wěn)定[19]。冷凍處理條件下總酚的含量變化為8 h>12 h>4 h。冷藏條件下總酚含量的變化為12 h>8 h>4 h。以上數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過冷凍8 h和冷藏12 h處理的大蒜總酚含量變化最明顯，在發(fā)酵16 d時達到最大值，分別為10.89，11.92 mg/g，此時未處理的大蒜的總酚含量為4.37 mg/g，相比分別提升到2.5倍和2.7倍左右。唐仕榮等[25]的研究結(jié)果中，固態(tài)發(fā)酵黑蒜的總酚含量在發(fā)酵30 d后達到最大值，僅為3.3 mg/g左右。相比之下，此液態(tài)發(fā)酵黑蒜的總酚含量提高了3～4倍，說明進行液態(tài)發(fā)酵可以提高總酚的含量，并且低溫處理后總酚含量上升更明顯。王海粟等[18]采用冷凍處理和變溫發(fā)酵工藝制備固態(tài)黑蒜，得到總酚含量為10.44 mg/g，與本文所得總酚含量相差不大，可能是變溫發(fā)酵過程中大分子化合物釋放出更多的酚羥基，使多酚的相對含量升高[26]。隨著發(fā)酵過程中美拉德反應(yīng)的進行和多酚氧化酶的作用，液態(tài)發(fā)酵黑蒜的總酚含量變化明顯。發(fā)酵后期，多酚類物質(zhì)可能發(fā)生縮合反應(yīng)，生成褐色物質(zhì)，導(dǎo)致總多酚含量出現(xiàn)下降趨勢。同時本次低溫預(yù)處理制備的液態(tài)黑蒜總酚含量與前期我們利用pH值變化提升液態(tài)黑蒜品質(zhì)的研究結(jié)果也基本一致，由此可知，適時低溫預(yù)處理有利于總酚物質(zhì)的生成，且冷藏12 h時效果最好。

2.6 總黃酮含量

類黃酮是植物界中分布最廣泛的天然化合物之一，具有多種功能活性，如抗氧化、抗菌、抗炎等，還可以調(diào)節(jié)血糖、血脂和血壓[27]。由圖8可知，總黃酮含量的變化趨勢與總酚變化趨勢較一致，呈現(xiàn)出先逐漸升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。據(jù)報道，大蒜中的生物活性物質(zhì)在發(fā)酵過程中增加，尤其是多酚和類黃酮等抗氧化物質(zhì)，這可能是由于高分子量多酚類化合物的分解釋放出低分子量衍生物。本文在發(fā)酵10～16 d左右總黃酮的含量變化幅度較大，并且冷凍8 h和冷藏12 h變化最明顯，分別達到了2.95，3.12 mg/g，此時未處理的大蒜的總黃酮含量為1.41 mg/g，相比分別增加到2.1倍和2.2倍。鄭清等[28]的研究結(jié)果中，成品固體黑蒜的總黃酮含量為1.71 mg/g。相比之下，此液態(tài)發(fā)酵黑蒜的總黃酮含量提高了1.7倍左右，說明液態(tài)發(fā)酵有利于總黃酮的生成，且進行低溫處理后黑蒜中總黃酮含量更高。以上結(jié)果表明，適時低溫處理有利于大蒜發(fā)酵過程中總黃酮含量的升高，且冷藏處理12 h時效果最好。

2.7 抗氧化活性

2.7.1 DPPH·清除能力

黑蒜中含有較多的自由基清除能力強的生物活性成分，可清除自由基。由圖9可知，黑蒜的DPPH·清除率隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先逐漸升高又趨于平穩(wěn)的趨勢。這可能是由于黑蒜加工過程中抗氧化活性物質(zhì)酚類等物質(zhì)含量增加，抗氧化能力也隨之增強，所以自由基清除能力也增強[29]。而后期基本趨于穩(wěn)定也與多酚類化合物的分解及抗氧化活性物質(zhì)的含量基本穩(wěn)定有關(guān)。冷凍處理條件下DPPH·清除率大小為8 h>12 h>4 h。冷藏處理條件下DPPH·清除率大小為12 h>8 h>4 h。經(jīng)過冷凍8 h和冷藏12 h處理的大蒜的DPPH·清除能力最大值分別達到84.1%和81.6%，未處理的大蒜的最大值僅為54.8%，分別是未處理大蒜的1.53倍和1.49倍。王玉榮等[30]通過發(fā)酵制備的黑蒜的DPPH·清除能力為77.5%，小于本文所得的84.1%和81.6%，說明低溫預(yù)處理制備的液態(tài)發(fā)酵黑蒜的抗氧化性較強。由此可知，經(jīng)過低溫處理的大蒜制備的液態(tài)黑蒜的DPPH·清除率均增加，說明適時低溫處理有利于提升DPPH·清除率，并且冷凍8 h時效果最好。

2.7.2 ·OH清除能力

由圖10可知，隨著發(fā)酵時間的增加，不同處理方式和時間下黑蒜的·OH清除率呈現(xiàn)先逐漸增大后基本趨于穩(wěn)定的趨勢，與DPPH·清除率趨勢一致。黑蒜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酚類、黃酮類物質(zhì)及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，這些產(chǎn)物均具有較強的抗氧化活性，因此羥基自由基清除率得以升高[22]，且冷凍8 h和冷藏12 h時清除率變化最明顯，分別達到73.1%和71.3%，而未進行任何預(yù)處理的大蒜最大值為51.8%，相比高出未處理的大蒜的21.3%、19.5%。以上結(jié)果表明經(jīng)過冷凍8 h處理的大蒜，在發(fā)酵過程中·OH清除率更高，所以低溫預(yù)處理有利于提高·OH清除率。

3 結(jié)論

低場核磁結(jié)果表明，冷藏和冷凍預(yù)處理可破壞大蒜結(jié)構(gòu)和細胞，有利于大蒜中結(jié)合水變成自由水，同時增加自由水的水分活度，有利于制備液態(tài)黑蒜，其中冷藏12 h和冷凍8 h效果最好。

該試驗選用新鮮、無變質(zhì)的大蒜為原料，發(fā)酵條件：分別進行冷凍（－18 ℃）預(yù)處理和冷藏（4 ℃）預(yù)處理，時間為4，8，12 h，處理后在85 ℃恒溫發(fā)酵箱中進行發(fā)酵。每隔2 d分別測定液態(tài)發(fā)酵黑蒜的總酚含量、總黃酮含量和還原糖含量以及褐變程度、pH和抗氧化性。結(jié)果表明，經(jīng)過冷凍8 h和冷藏12 h預(yù)處理的大蒜，相比較未處理的大蒜的總酚含量提升到2.5倍和2.7

倍左右、總黃酮含量可以提高到2.1倍和2.2倍左右；還原糖含量提高到1.5倍左右，DPPH·清除率是未處理大蒜的1.53倍和1.49倍，·OH清除率分別提高到1.5倍和1.4倍左右，且在發(fā)酵時間和各物質(zhì)含量測定值方面優(yōu)于傳統(tǒng)的固體黑蒜。

該試驗方案操作簡單，低溫預(yù)處理時間短，用于制備液態(tài)黑蒜節(jié)約時間成本和能量成本，且低溫處理后的液態(tài)發(fā)酵黑蒜的各項理化指標均優(yōu)于未處理大蒜。從發(fā)酵結(jié)果來看，低溫處理后的大蒜會對黑蒜的理化指標產(chǎn)生較大的影響。本試驗結(jié)果表明，以新鮮大蒜為原料，冷凍處理8 h和冷藏處理12 h后，經(jīng)過85 ℃恒溫恒濕發(fā)酵箱發(fā)酵16 d左右，得到的液態(tài)發(fā)酵黑蒜的各物質(zhì)含量更高，抗氧化能力較強，品質(zhì)較好。

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