望江南莖中大黃素提取工藝優(yōu)化、純化及鑒定1)

周昊 楊瑾 張玉紅

(吉林大學(xué),長(zhǎng)春,130026) (東北林業(yè)大學(xué))

望江南(SennaoccidentalisL.)為豆科(Fabaceae)決明屬(Senna)草本植物,又名山角豆、野扁豆、喉白草、羊角豆[1]。望江南莖中含量最多的成分為黃酮及蒽醌類(lèi)化合物[2-3],目前利用蒽醌類(lèi)物質(zhì)開(kāi)發(fā)抗癌藥物備受關(guān)注尤其是針對(duì)肝癌的研究[4-5]。而大黃素為望江南中含量豐富的蒽醌類(lèi)物質(zhì)之一[6],除了作為一種常用的瀉藥[7],還具有多種藥理學(xué)活性包括治療傷口愈合[8-9]、抑制促炎細(xì)胞因子活性[10-11]、抑制肝癌HepG2細(xì)胞[4]和顯著性抑制金黃葡萄球菌活性[12]。已有對(duì)大黃素的提取分離研究主要集中在微波提取[13]、雙水相萃取、正交試驗(yàn)提取、超聲輔助提取[14]等。而對(duì)望江南植物的研究主要集中于對(duì)種子中總蒽醌的提取工藝優(yōu)化[15],對(duì)其中大黃素的單一研究較少。對(duì)其提取工藝優(yōu)化主要集中在對(duì)溫度、時(shí)間和提取溶劑等方面的考量,沒(méi)有依據(jù)大黃素這類(lèi)物質(zhì)本身的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。本研究根據(jù)大黃素在植物中容易以苷元的形式與多種糖類(lèi)結(jié)合的性質(zhì),在提取過(guò)程中加入無(wú)機(jī)酸來(lái)探討提取率的優(yōu)化。

此外,降低pH值能使得大黃素從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)從而能提高提取效率[16]。并且已有的研究中還未有從望江南中分離純化大黃素的方法。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化大黃素提取工藝,同時(shí)根據(jù)蒽醌類(lèi)物質(zhì)易溶解于堿液的性質(zhì)[17],結(jié)合質(zhì)譜分析大黃素的結(jié)構(gòu)和裂解方式,建立了一種從望江南中分離、純化大黃素的方法,為進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用望江南提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

取望江南植株地上莖部分,清理干凈,常溫干燥后粉碎,過(guò)40目篩后,密封、放置干燥處備用。

大黃素標(biāo)準(zhǔn)品,HPLC級(jí),純度大于98%,上海源葉生物科技有限公司;望江南莖40目粗粉,蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制;無(wú)水乙醇,鹽酸,三氯甲烷,氫氧化鈉,乙酸乙酯,石油醚,碳酸鈉,碳酸氫鈉,柱層析硅膠(200目),薄層層析硅膠板,分析純,均為上海麥克林公司。

電子分析天平,型號(hào)BSA124S-CW,北京賽多利斯科學(xué)儀器;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),型號(hào)UV-2250,日本島津公司;電子分析天平,型號(hào)TE2101-L北京賽多利斯科學(xué)儀器;中藥粉碎機(jī),型號(hào)WND-200A,浙江省偉能達(dá)儀器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,型號(hào)RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水真空泵,型號(hào)SHZ-D(Ⅲ),河南省予華儀器;恒溫水浴鍋,型號(hào)SYG-2,常州朗月儀器;高效液相色譜儀,型號(hào)1260,美國(guó)安捷倫公司;液相質(zhì)譜儀,型號(hào)Q-focus,美國(guó)賽默飛世爾公司。

1.2 試驗(yàn)方法

大黃素定量檢測(cè)。采用分光光度法定量測(cè)定大黃素含量[18]。精密稱取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg置于100 mL容量瓶中,加乙醇溶解搖勻、定容,配成50 mg/L的母液。取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品母液,依次配置成質(zhì)量濃度為5、10、16、20、30、40、50 mg/L的溶液,分別移取1 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL的容量瓶中,加入5 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL,去離子水定容至刻度,搖勻,放置10 min。以空白溶液為對(duì)照,在530 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并記錄其吸光度值。

提取溶液的篩選。精密稱取1 g同一批次望江南莖粉,分別用20 mL水、乙醇、乙酸乙酯、正己烷于30 ℃浸提30 min,取浸提液過(guò)濾,加入5 mol/L等量氫氧化鈉溶液,搖勻放置10 min后測(cè)定其吸光度值并依據(jù)大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

單因素提取試驗(yàn)。精密稱取1 g同一批次望江南莖粉末,采取控制單一變量的方法,料液比為1 g∶20 mL,利用熱回流方法進(jìn)行提取,分別對(duì)鹽酸用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行考察。設(shè)置梯度分別是:每20 mL提取液鹽酸用量為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL;乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%;提取時(shí)間為20、30、60、90、120 min;提取溫度為70、75、80、85、90 ℃。提取液過(guò)濾后,取上清液3 mL,加入5 mol/L等量氫氧化鈉溶液,搖勻,放置10 min,測(cè)定吸光度。

響應(yīng)面優(yōu)化。在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用Design-Expert V.12軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)的同時(shí)對(duì)得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。選取鹽酸用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度作為實(shí)驗(yàn)因素,以望江南莖中大黃素的得率為響應(yīng)值(Y)。根據(jù)Box-Benhnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),共計(jì)29組(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平

1.3 大黃素純化及鑒定

大黃素粗品的獲得。利用優(yōu)化后的提取條件獲得大黃素提取物,采用梯度pH萃取法,首先使用氯仿萃取后,加入5% Na2CO3溶液震蕩混合均勻,分離出紫紅色的堿液層,反復(fù)操作數(shù)次至堿液不再變紅,以除去大黃酸。將分離后的氯仿層與5% Na2CO3溶液混合,分離出變紅的堿液層,多次重復(fù)操作至無(wú)紅色,合并得到的堿液層,加入鹽酸至pH值為6左右,一邊滴加酸液一邊搖動(dòng),以避免液體反應(yīng)不均勻沖出瓶口,靜置直到瓶底不再有沉淀產(chǎn)生,抽濾得沉淀,反復(fù)用水洗后用氯仿進(jìn)行復(fù)溶,得到大黃素粗品。

柱層析制備及大黃素純化。采用濕法裝柱干法上樣的方法進(jìn)行柱層析。取規(guī)格為300 mm×30 mm的玻璃層析柱,將硅膠30 g與洗脫劑混合均勻后加入柱內(nèi),敲擊柱身減少氣泡后加壓使填料平整。將經(jīng)過(guò)pH梯度分離的溶液與少量硅膠混合后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)液體干粉狀態(tài)加入層析柱平鋪在填料上,使用少量洗脫劑完全浸潤(rùn)。

用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=30∶1～V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=25∶1體系洗脫,使用365 nm紫外燈照射觀察有明顯黃色色帶,收集該色帶餾分,使用薄層層析硅膠板對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品大黃素檢查為單一黃色斑點(diǎn),將餾分濃縮后,氯仿溶解進(jìn)一步進(jìn)行重結(jié)晶,可以得到純度較高的大黃素。

大黃素鑒定及質(zhì)譜分析方法:

①定量分析。利用賽默飛OTCML中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中compound discovery軟件、mzvault軟件及本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)檢索識(shí)別,并人工排查和補(bǔ)充,明確望江南中可能的蒽醌類(lèi)化學(xué)成分,經(jīng)過(guò)面積歸一法進(jìn)行定量。

②色譜條件。安捷倫C18色譜柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流動(dòng)相為甲醇(體積分?jǐn)?shù)80%)+0.1%乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)20%),流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。

③質(zhì)譜條件。色譜柱為HypersilGoldtmVanquish柱(100.0 mm×2.1 mm,1.9 mm),電噴霧離子源正負(fù)離子模式(ESI),毛細(xì)管溫度350 ℃,噴霧電壓4 000 V,鞘氣、輔助氣和S-lens射頻水平的流量分別為80、40、0,掃描范圍(m/z)為150～1 500,分辨率為70 000。流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水(A)+甲醇(B),梯度洗脫:0～1 min,為98%A(98%的甲酸水);1～9 min,98%A→2%A(流動(dòng)相甲酸水從98%降到2%);9～12 min時(shí),達(dá)到2%A(2%的甲酸水);12.0～12.5 min內(nèi),2%A→98%A(流動(dòng)相甲酸水從2%升到98%);12.5～15.0 min內(nèi),達(dá)到98%A(98%的甲酸水);流速0.35 mL/min。柱溫40 ℃,進(jìn)樣量為5 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,利用Origin 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制,采用One-way ANOVA方法進(jìn)行單因素方差分析。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2的試驗(yàn)方法,進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定。以吸光度值為縱坐標(biāo),大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,呈線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.003 9x+0.012 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。結(jié)果表明,該標(biāo)準(zhǔn)曲線在大黃素質(zhì)量濃度在5～50 mg/L,呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。表明該方法線性關(guān)系較好,適用于對(duì)大黃素進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取溶劑的篩選

在其他條件相同的情況下,分別用水、乙醇、乙酸乙酯和正己烷4種不同極性的溶劑對(duì)望江南中大黃素進(jìn)行提取,從表2中可以明顯看出,其中以乙醇為提取溶劑所得到的大黃素的得率最高,并且乙醇安全無(wú)毒。因此,選用乙醇作為從望江南莖中提取大黃素的最佳溶劑。

表2 不同提取溶劑種類(lèi)的大黃素得率 mg·g-1

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1鹽酸用量對(duì)望江南莖中大黃素提取得率的影響

從表3可知,隨著鹽酸用量的增多,望江南莖中大黃素提取得率呈逐漸上升趨勢(shì),當(dāng)鹽酸用量為1.6 mL時(shí),大黃素提取得率達(dá)到最大,隨鹽量用量繼續(xù)增加,大黃素提取得率下降。通過(guò)降低pH值既可以將望江南中的大黃素從其衍生物中以苷元的形式解離,同時(shí)也可以將以鹽形式存在的大黃素完全游離,從而提高大黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),但是過(guò)高的鹽酸體積可能會(huì)導(dǎo)致大黃素的飽和,同時(shí)也促進(jìn)了大黃素的不穩(wěn)定性。因此,每20 mL提取溶劑加入1.6 mL鹽酸為單因素提取的最優(yōu)值。

2.3.2提取時(shí)間對(duì)望江南莖中大黃素提取得率的影響

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),大黃素提取率先上升后下降,當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)達(dá)到峰值(表3)。提取時(shí)間再延長(zhǎng),大黃素的得率會(huì)下降,可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)發(fā)生部分氧化和結(jié)構(gòu)上的破壞,因此提取最優(yōu)時(shí)間為90 min。

2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大黃素提取得率影響

從表3可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高,望江南莖中大黃素的提取得率也隨之增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),大黃素的提取得率達(dá)到最大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)上升時(shí),大黃素的得率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大會(huì)增加其他雜質(zhì)的溶出,從而導(dǎo)致大黃素的提取率下降。因此,提取望江南莖中大黃素最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.3.4 提取溫度對(duì)大黃素提取率影響

隨著提取溫度升高,大黃素的提取得率先上升后下降,當(dāng)提取溫度達(dá)到85 ℃時(shí),大黃素的得率達(dá)到最高,隨后開(kāi)始下降(表3)。溫度提高能加速大黃素的溶解,但是當(dāng)溫度達(dá)到一定高度時(shí),提取率則會(huì)下降,可能是因?yàn)樵斐商崛∪軇┑膿]發(fā)和大黃素部分氧化分解。因此,提取大黃素的最優(yōu)溫度為85 ℃。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析及模型建立

為進(jìn)一步了解各提取因素之間的相互作用,在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取鹽酸用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度,以大黃素含量作為響應(yīng)值,利用Design Expert V12軟件,結(jié)合4因素3水平的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-expert軟件對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以望江南莖中大黃素得率(Y)為響應(yīng)值,對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合,得到以響應(yīng)值為目標(biāo)函數(shù)的二次多元回歸方程:

Y=9.80+0.012 3A+0.870 9B+0.061 1C+0.057 2D-0.039 7AB-0.038 4AC-0.115 3AD-0.229 4BC-0.410 2BD+0.338 4CD-0.468 2A2-1.294 5B2-0.499 0C2-1.070 1D2。

一次項(xiàng)系數(shù)值的大小可以反映因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度[13],由回歸方程可得出提取大黃素的主次影響因素由大到小為:乙醇體積分?jǐn)?shù)、鹽酸用量、提取時(shí)間、提取溫度。這也與表5中模型的方差結(jié)果相一致。

表5 回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.4.2 因素交互分析

響應(yīng)面的陡峭程度說(shuō)明影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小。從3D響應(yīng)面圖可以看出,各個(gè)因素對(duì)大黃素提取得率的影響程度。響應(yīng)曲面坡度越陡峭,表明交互作用越明顯[14]。圖2c和圖2e的響應(yīng)面較為陡峭,底部投影接近圓形,說(shuō)明提取時(shí)間和鹽酸量以及提取溫度和提取時(shí)間交互作用較顯著[19]。隨著提取時(shí)間、鹽酸量和提取溫度的增加,大黃素的提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì),在鹽酸量為1.6 mL提取溫度為86 ℃提取時(shí)間為90 min時(shí)得率最大,之后逐漸降低。而圖2a和圖2d坡度較緩,表明提取溫度、提取時(shí)間對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用較弱。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.4.3 提取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design Expert 12軟件,通過(guò)上述回歸方程得到望江南莖中提取大黃素最優(yōu)條件:鹽酸用量2 mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)87.62%,提取時(shí)間86 min,提取溫度為84.4 ℃,大黃素得率9.50 mg/g。考慮到實(shí)驗(yàn)操作的便利性,將優(yōu)化條件校正為:鹽酸用量2 mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)88%,提取時(shí)間86 min,提取溫度為84 ℃,使用同一批次望江南莖粉平行試驗(yàn)3次,大黃素得率的平均值為9.44 mg/g,變異系數(shù)為0.633 6%,經(jīng)方差分析,差異不顯著,表明該回歸方程模型的可靠性較好,可以用于預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,也表明采用響應(yīng)面優(yōu)化望江南莖中大黃素提取工藝條件是合理可行的。

2.5 大黃素檢測(cè)和鑒定

按上述最優(yōu)提取條件,進(jìn)行望江南莖中大黃素的提取,得到的大黃素提取物按照1.3的方法進(jìn)行大黃素純品的制備,獲得大黃素純品的樣品,進(jìn)行色譜和質(zhì)譜鑒定。

液相色譜分析。將m(大黃素樣品)∶m(標(biāo)準(zhǔn)品)=1∶1混勻,按照1.3中的色譜條件進(jìn)行HPLC的檢測(cè),大黃素樣品與標(biāo)準(zhǔn)品混合物僅出現(xiàn)一個(gè)峰,且相臨沒(méi)有其他峰出現(xiàn),且保留時(shí)間為3.99 min,與大黃素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間4.11 min基本一致(圖3),并且峰形較好,雜質(zhì)較少,表明樣品與標(biāo)準(zhǔn)品是同一物質(zhì)為大黃素。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品相比對(duì),純化后得到的大黃素樣品中大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.8%。

A.樣品:標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量比為1∶1;B.標(biāo)準(zhǔn)品。

質(zhì)譜分析。按照1.3的條件,將純化后的大黃素樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。由于大黃蒽醌類(lèi)化合物在電噴霧電離條件下容易失去H+而帶負(fù)電荷,因此在負(fù)離子模式下檢測(cè)結(jié)果更明顯,所以在負(fù)離子模式下,從圖4可以看出,母離子質(zhì)譜峰質(zhì)荷比為269[M-H]-,離子失去中性分子CO及一個(gè)氧原子得到質(zhì)荷比241[M-H-CO]-,質(zhì)荷比225[M-H-CO-O]-。根據(jù)負(fù)離子模式下精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息,與文獻(xiàn)比對(duì)一致[20-21],確定為大黃素。

圖4 大黃素LC-MS2掃描圖(負(fù)離子模式)

根據(jù)已有文獻(xiàn)推測(cè)大黃素最有可能的兩種裂解方式,如圖5。其中A過(guò)程為碳環(huán)羰基裂解,從能量上看,該方式裂解鍵能小產(chǎn)物能量低,結(jié)構(gòu)會(huì)更穩(wěn)定[22]。B過(guò)程中羥基斷裂脫去CO的特征離子碎片,因?yàn)榱u基連接碳與鄰位碳正負(fù)電荷差最大,離去程度高更容易斷裂[23]。

圖5 大黃素質(zhì)譜裂解途徑過(guò)程(負(fù)離子模式)

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平的響應(yīng)面法優(yōu)化望江南莖中大黃素的提取工藝條件為:鹽酸用量2 mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)88%,提取時(shí)間86 min,提取溫度為84 ℃。在此最優(yōu)條件下,從望江南莖中獲得大黃素提取物,采用梯度pH萃取法得到大黃素粗品,利用濕法裝柱干法上樣的柱層析法,并用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=30∶1～V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=25∶1體系進(jìn)行洗脫,氯仿重結(jié)晶,得到大黃素純品。經(jīng)質(zhì)譜和HPLC定性定量鑒定,大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.8%。本研究改進(jìn)了從望江南中提取和純化大黃素的工藝,操作更快速和效率,同時(shí)建立了在望江南中大黃素的鑒定方法,對(duì)望江南的開(kāi)發(fā)利用具有參考價(jià)值和重要意義。