應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析經(jīng)銨態(tài)氮脅迫處理柳樹根系的差異代謝物1)

王紅玲 黃瑞芳 施士爭

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院,南京,211153)

柳樹是我國廣泛種植的一種楊柳科(Salicacea)柳屬(Salix)樹種,為落葉喬木,種類繁多,具有生長快、耐水濕、抗逆性強(qiáng)等特征,既能作為園林觀賞植物,也是農(nóng)田防護(hù)林的常用樹種,具有較高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)價值[9-11]。柳樹的根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)性較強(qiáng),在很多不良的生境下都能生長[12]。近些年來,對于柳樹耐鹽堿的研究逐漸增多[13],但關(guān)于銨態(tài)氮對柳樹影響的機(jī)理研究報道較少。

代謝組學(xué)是一項高效多靶點的研究生物體在某個階段各種小分子代謝產(chǎn)物及其動態(tài)變化的技術(shù),可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)[14]。靶向代謝組學(xué)利用前期已建立的代謝物數(shù)據(jù)庫,能夠?qū)δ繕?biāo)代謝物進(jìn)行絕對定量分析,具有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點[15]。非靶向代謝組學(xué)可以全面分析生物體內(nèi)的已知、未知代謝物,并進(jìn)行定量分析,從而對生物現(xiàn)象進(jìn)行總體認(rèn)識,有利于發(fā)現(xiàn)新的代謝通路[16]。近些年來,基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)在植物研究領(lǐng)域受到廣泛重視,已大量應(yīng)用于氮素變化對植物影響的研究中[17-18]。Das et al.[19]研究了干旱和熱脅迫下大豆葉片中代謝物的變化,結(jié)果表明,調(diào)節(jié)碳水化合物代謝、氨基酸代謝、肽代謝、嘌呤和嘧啶生物合成的各種細(xì)胞過程的代謝產(chǎn)物都受到顯著影響。

本研究通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù),對低濃度、高濃度銨態(tài)氮脅迫處理的柳樹苗根系的整體代謝物動態(tài)變化進(jìn)行分析,并進(jìn)一步分析差異代謝物參與的代謝通路與生物學(xué)功能,有助于了解銨態(tài)氮脅迫處理柳樹的機(jī)理,為將來提高柳樹的抗逆水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究使用柳樹無菌苗,在江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院的溫室中進(jìn)行充氧水培,水培盒容積為10 L,初始水培溶液為1/8霍格蘭營養(yǎng)液,培養(yǎng)溫度為10～25 ℃,光強(qiáng)為2 000 lx,光照時間為06:00—18:00。水培20 d,水培苗平均株高達(dá)15～20 cm,挑選其中生長一致的水培苗開始脅迫處理。設(shè)置3種處理方式:低質(zhì)量濃度(2 mg·L-1的NH4Cl溶液)銨態(tài)氮脅迫、高質(zhì)量濃度(20 mg·L-1的NH4Cl溶液)銨態(tài)氮脅迫、對照處理(無銨態(tài)氮脅迫),在3種處理中分別放入10株水培苗,設(shè)置3個重復(fù)。每周更換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)5周后,收割不同處理的水培苗根部,液氮保存。

主要試劑:甲醇、水、甲酸、乙腈,均購自Sigma公司,且達(dá)到色譜純級別。

樣品處理:將前期準(zhǔn)備好的銨態(tài)氮脅迫處理的柳樹幼苗樣品,每個樣品稱取500 mg,放入5 mL離心管中。向離心管中加入2顆小鋼珠和2.5 mL冷甲醇溶液(V(甲醇)∶V(水)=4∶1),在冰箱內(nèi)-80 ℃預(yù)冷2 min后,放入研磨機(jī)中研磨(60 Hz)2 min,取出后超聲提取30 min,隨后高速離心(12 000 r·min-1,4 ℃)10 min,取上清液裝入新的離心管中。把所有樣本的提取液等體積混合制備成質(zhì)控樣本,每個質(zhì)控樣本的體積與樣本相同。用冷凍濃縮離心干燥器揮干樣品,然后用200 μL甲醇溶液(V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=80∶19∶1)充分復(fù)溶,經(jīng)過0.22 μm濾頭過濾,將樣品轉(zhuǎn)移到樣品瓶中,待上機(jī)。

色譜條件:流動相A是水(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸),B是乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸);色譜柱,ACQUITY UPLC BEH C18(100.0 mm×2.1 mm,1.7 μm);按照體積比進(jìn)行梯度洗脫,洗脫梯度0～1.0 min、體積分?jǐn)?shù)為2%的乙腈,2.0～4.0 min、體積分?jǐn)?shù)25%～60%的乙腈,7.5～12.5 min、體積分?jǐn)?shù)90%～99%的乙腈,12.7～16.0 min、體積分?jǐn)?shù)2%的乙腈。柱溫45 ℃,流速0.4 mL·min-1,進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)正、負(fù)離子模式分別掃描進(jìn)行樣品質(zhì)譜信號采集,毛細(xì)管電壓3 kV或-2.5 kV,采樣錐40 V,震源偏移80 V,源溫120 ℃,脫溶劑溫度450 ℃,脫溶劑氣流800 L·h-1,錐孔氣流50 L·h-1,掃描時間0.1 s。

使用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;使用代謝組學(xué)分析軟件(Progenesis QI V2.3)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行定性、相對定量分析;采用統(tǒng)計學(xué)分析軟件(Ezinfo 3.0)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,包括主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)、S-Plot分析、差異倍數(shù)分析等。差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)同時滿足以下條件:P≤0.05,VIP值>1,S-Plot值>0.8或<-0.8,差異倍數(shù)>2.5倍或<0.4倍。將獲得的差異代謝物通過京都基因與基因組百科全書(KEGG,https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 可信度統(tǒng)計分析

基于主成分分析可以觀察3種處理組(對照處理、質(zhì)量濃度2、20 mg·L-1的銨態(tài)氮)間的差異。主成分分析結(jié)果中正離子、負(fù)離子模式下,同一處理組內(nèi)的多個重復(fù)樣品聚集在一起,表明樣品具有較好的實驗代表性,可信度較好(圖1)。此外,不同處理樣品均間隔較遠(yuǎn),分離明顯,表明不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的柳樹幼苗樣品和對照樣品具有特定的代謝譜。

圖1 不同處理樣品和質(zhì)控樣品的主成分分析

2.2 差異代謝物的篩選與鑒定

為了提高代謝物的差異可靠性,本研究以差異倍數(shù)>2.5倍或<0.4倍為標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行差異分析。結(jié)果表明,與對照樣品相比,低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(2 mg·L-1)脅迫處理的柳樹幼苗根系樣品中篩選出28種差異顯著的代謝物(表1),包括12種上調(diào)、16種下調(diào)的代謝物。上調(diào)的代謝物主要包括(S)-大風(fēng)子油酸、氟考酸、α-亞麻酸、葫蘆素F、葫蘆素O、攀打胺等,其中(S)-大風(fēng)子油酸的上調(diào)倍數(shù)最高。此外,下調(diào)的代謝物主要包括去氫保幼酮、大黃素甲醚8-梔子苷、β-天麻素、尿膽素原、皂皮酸等,其中,去氫保幼生物酮的下調(diào)倍數(shù)最高,在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫時降低了178倍。

表1 低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(2 mg·L-1)處理時鑒定的差異代謝物

采用相同的方法,在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(20 mg·L-1)脅迫處理的柳樹幼苗根系樣品中篩選出216種差異顯著的代謝物,差異變化較大的前30個代謝物見表2,其數(shù)量顯著比低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時鑒定到的差異代謝物數(shù)量多,表明銨態(tài)氮的質(zhì)量濃度越高,對柳樹幼苗根系的代謝物影響越大。進(jìn)一步對高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的差異代謝物進(jìn)行分析,上調(diào)代謝物有117種,占種類比為54%;下調(diào)代謝物有99種,占種類比為46%?；诓町惐稊?shù),上調(diào)倍數(shù)最高的10種代謝物包括絲石竹皂甙元、皂皮酸、葫蘆素F、葫蘆素O、去氫保幼酮、大豆皂醇F、保幼激素三酸、5,6-去氫羽扇豆堿、美普清、葫蘆素L,其中絲石竹皂甙元在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時,上調(diào)了310倍。下調(diào)倍數(shù)最高的10種代謝物包括N-2-乙?；顾?、他非諾喹、氟考酸、弗斯特羅定、十三酸、3b-石膽酸、納德米定、金鏈菌素、噻前列素、羥甲睪酮,其中N-2-乙?；顾卦诟哔|(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時,下調(diào)了3 329倍。

表2 高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(4 mg·L-1)處理鑒定的前30個差異代謝物

2.3 不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理的差異代謝物比較

將低質(zhì)量濃度、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理鑒定出的差異代謝物進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)有21種代謝物在低、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時都呈現(xiàn)顯著差異,其中葫蘆素F、葫蘆素O、攀打胺這3種代謝物在不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時均上調(diào),但在高質(zhì)量濃度處理時的上調(diào)倍數(shù)更高;此外,β-天麻素、玉米赤霉醇、3b-石膽酸、十三酸這4種代謝物在不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時均下調(diào)。剩余的14種代謝物在低、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理的變化趨勢截然相反。除了上述21種代謝物在低、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理時都呈現(xiàn)差異,有7種代謝物只在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理呈現(xiàn)差異,且均為下調(diào);另外193種代謝物只在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理顯著差異,表明不同質(zhì)量濃度的銨態(tài)氮脅迫處理導(dǎo)致柳樹幼苗根系中的代謝物變化差異較大。有研究報道,糖、多元醇、脂肪酸類小分子物質(zhì)的積累可以有效調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透壓,提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,是植物應(yīng)對氮素脅迫、鹽脅迫等逆境環(huán)境的一種有效策略[20]。在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理,柳樹幼苗根系中的UDP-葡萄糖(上調(diào)2.61倍)、大豆皂醇A(上調(diào)12.37倍)、大豆皂醇F(上調(diào)49.02倍)、阿法前列醇(上調(diào)8.26倍)、澤瀉醇A(上調(diào)3.24倍)、表二氫膽甾醇(上調(diào)2.99倍)以及保幼激素三酸(上調(diào)39.99倍)、密擠青霉酸(上調(diào)13.51倍)、夫西地酸(上調(diào)10.44倍)、藤黃酸(上調(diào)6.73倍)等脂肪酸均上調(diào),表明上述代謝物的積累是柳樹幼苗應(yīng)對銨態(tài)氮脅迫的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2.4 差異代謝物的通路分析

為了進(jìn)一步研究低質(zhì)量濃度、高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理對柳樹幼苗根系的影響,將上述鑒定到的差異代謝物比對京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫,并進(jìn)行通路富集分析。在低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理,差異代謝物主要分布在9條代謝途徑中;而在高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮脅迫處理,差異代謝物主要分布在64條代謝途徑中,表明高質(zhì)量濃度的銨態(tài)氮處理影響了柳樹根系的多條代謝通路。其中最富集的代謝通路包括次生代謝產(chǎn)物的合成、α-亞麻酸的代謝、植物激素的合成、植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、萘的降解、倍半萜和三萜類化合物的合成、糖胺聚糖生物合成、嘌呤代謝、類胡蘿卜素的生物合成等。將上述富集的代謝通路與相關(guān)組件、關(guān)鍵酶進(jìn)行整合(圖2),相對聚集的代謝通路包括不飽和脂肪酸的生物合成、植物激素的合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、α-亞麻酸的代謝、糖胺聚糖生物合成,表明柳樹幼苗根系主要通過調(diào)節(jié)上述代謝通路來應(yīng)對銨態(tài)氮脅迫。

morphine addiction為嗎啡癮;adenosine為腺苷酸;glutathionylspermidine為谷胱甘肽亞精胺;glutathione metabolism為谷胱甘肽代謝;glutathione disulfide為谷胱甘肽二硫化物;3beta,5beta-ketodiol為3β,5β-酮脂酰;insect hormone biosynthesis為昆蟲激素生物合成;juvenile hormone III acid為幼激素III酸;stearidonic acid為硬脂酸;etherolenic acid為羥乙磷酸;alpha-linolenic acid metabolism為α-亞麻酸代謝;colnelenic acid為亞麻酸;17-hydroxylinolenic acid為α-羥基油酸;(6Z,9Z,12Z)-octadecatrienoic acid為(6Z,9Z,12Z)-十八碳三烯酸;biosynthesis of unsaturated fatty acids為不飽和脂肪酸生物合成;plant hormone signal transduction為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo);salicylate為水楊酸鹽;brassinolide為油菜素內(nèi)酯;biosynthesis of plant hormones為植物激素生物合成;(9Z,12Z,15Z)-octadecatrienoic acid為(9Z,12Z,15Z)-十八碳三烯酸;glycosaminoglycan biosynthesis為糖胺聚糖生物合成;heparan sulfate/heparin為硫酸乙酰肝素;adenosine 3’,5’-bisphosphate為3’,5’-二磷酸腺苷;chondroitin sulfate/dermatan sulfate為硫酸軟骨素/硫酸皮膚素;indole為吲哚;benzoxazinoid biosynthesis為苯并惡唑嗪酮生物合成。

3 討論與結(jié)論

氮素是農(nóng)林植物生長所需的重要營養(yǎng)元素,對生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。銨態(tài)氮作為植物生長所需的主要無機(jī)氮源,能與光合作用產(chǎn)物有機(jī)酸直接結(jié)合形成氨基酸和一些含氮有機(jī)化合物[21-22]。適量的銨態(tài)氮對植物是有益的,但當(dāng)銨態(tài)氮過量存在時,會對大多數(shù)植物的生長產(chǎn)生毒性。柳樹作為一種具有生物量大、抗性強(qiáng)等特征的喬木,其在園林綠化、生態(tài)修復(fù)等方面發(fā)揮了重要作用。在此背景下,研究柳樹根系對銨態(tài)氮脅迫的影響,將為柳樹的遺傳改良和科學(xué)培育提供重要借鑒。

本研究采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù),對正常培養(yǎng)與不同質(zhì)量濃度銨態(tài)氮處理時的柳樹幼苗根系的代謝物進(jìn)行比較,從代謝組學(xué)角度出發(fā)篩選出關(guān)鍵的差異代謝物,研究銨態(tài)氮脅迫處理柳樹根系的代謝物變化。低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮(2 mg·L-1)處理,鑒定出28種差異代謝物,說明低質(zhì)量濃度銨態(tài)氮對柳樹根系的影響較小;而高濃度銨態(tài)氮(20 mg·L-1)脅迫處理,鑒定出216種差異代謝物,說明高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮對柳樹根系的影響較大。基于之前的研究報道,銨態(tài)氮過量存在時,對大多數(shù)植物產(chǎn)生毒害作用[23],因此,高質(zhì)量濃度銨態(tài)氮對柳樹幼苗根系也是有害的。篩選出的差異代謝物中,包括UDP-葡萄糖、大豆皂醇A、大豆皂醇F、阿法前列醇、澤瀉醇A、表二氫膽甾醇以及保幼激素三酸、密擠青霉酸、夫西地酸、藤黃酸等脂肪酸均上調(diào),這些代謝物的積累可以有效調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透壓,提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,是柳樹根系應(yīng)對銨態(tài)氮脅迫的一種有效策略。對差異代謝物進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫通路分析,結(jié)果表明,鑒定出的差異代謝物主要參與次生代謝產(chǎn)物的合成、α-亞麻酸的代謝、植物激素的合成、植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、萘的降解、倍半萜和三萜類化合物的合成、糖胺聚糖生物合成、嘌呤代謝、類胡蘿卜素的生物合成等。綜上所述,本研究為挖掘和尋找銨態(tài)氮脅迫處理柳樹根系的關(guān)鍵代謝物提供了參考,并闡明了這些代謝物是通過參與一些重要的代謝通路,來進(jìn)行調(diào)節(jié)和應(yīng)對,這為進(jìn)一步培育出高效抗逆的柳樹新種質(zhì)提供了數(shù)據(jù)支撐。