食品中豬源性成分定性檢測能力驗證結(jié)果與分析

程瀟　徐晨　賈貞　劉娟娟　安虹

摘要 本文根據(jù)中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供的能力驗證作業(yè)指導書以及SN/T 2051—2008、GB/T 38164—2019、SN/T 3730.8—2013 3種方法對2個肉糜樣品進行豬源性成分檢測，通過參加中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心食品中豬源性成分鑒定能力驗證，驗證實驗室動物源性成分檢測的能力，擴大實驗室的影響力。結(jié)果表明，3種方法均可在樣品22-W514中檢出豬源性成分，在樣品22-K216中未檢出豬源性成分，本次能力驗證獲得滿意結(jié)果。

關(guān)鍵詞 豬源性成分；檢測能力驗證；食品

中圖分類號 TS251.7? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）08-0162-03

食品安全關(guān)乎生命與健康，隨著人類經(jīng)濟社會的持續(xù)發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對食品安全問題提出了越來越高的要求。近些年，隨著我國食品市場物品種類的豐富，加工領(lǐng)域的不斷創(chuàng)新，食品添加劑的廣泛使用，食品真實性、品質(zhì)鑒定和質(zhì)量安全等相關(guān)問題也逐漸凸現(xiàn)[1]。如何快速鑒別食品的真、偽、優(yōu)、劣成為食品市場管理的重點和難點。

國內(nèi)市場上的肉和肉制品的生產(chǎn)與銷售中，有些不法商販會利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者，其中以低價的肉冒充高價的肉最為常見，如用雞肉冒充豬肉，用豬肉、鴨肉冒充牛、羊肉等[2]。因此，對肉類制品及其加工品進行摻假、摻雜檢驗十分必要，其重點就是快速、準確地鑒定肉制品品種[3-4]。目前，最常見的動物源性成分檢測方法是基于分子生物學檢測技術(shù)的熒光定量PCR法[5]，本實驗室采用3種熒光定量PCR方法，分別對2個樣品進行豬源性成分的檢測。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

樣品由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供。樣品編號分別為22-W514、22-K216，采用真空密封鋁箔袋包裝。

1.2 試驗試劑

本次能力驗證使用GB/T 38164—2019及SN/T 3730.8—2013方法進行豬源性成分檢測的引物、探針依據(jù)標準中公布的序列進行合成（大連寶生物），使用SN/T 2051—2008方法進行豬源性成分檢測，試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。本次試驗采用的Premix Ex Taq? （Probe qPCR）、RNase Free水均購自寶生物工程（大連）有限公司，基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗設(shè)備

7500實時熒光PCR儀（美國ABI公司）；高速冷凍離心機（賽默飛世爾）；電子天平（梅特勒-托利多）；振蕩恒溫金屬?。ㄙ惸w世爾）；Thermo NanoDrop 2000核酸分析儀（賽默飛世爾）。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品DNA的提取。根據(jù)作業(yè)指導書的要求，分別取50 mg處理好的樣品放置于2 mL離心管中，每個樣品做2個平行試驗。按照基因組提取試劑盒說明書要求提取DNA，提取完成后使用Thermo NanoDrop 2000分別對DNA進行測定。

1.4.2 熒光PCR擴增。熒光PCR檢測循環(huán)條件按照相對應(yīng)的標準要求進行設(shè)置，其中陽性對照用含有豬源性成分的肉制品為模板，陰性對照使用未含有豬源性的肉制品為模板，空白對照用ddH2O代替模板，反應(yīng)體系均為25 μL。其中GB/T 38164—2019熒光PCR檢測循環(huán)條件為95 ℃ 10 min；40個循環(huán)為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。SN/T 3730.8—2013熒光PCR檢測循環(huán)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；45個循環(huán)為95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min。SN/T 2051—2008熒光PCR檢測循環(huán)條件為95 ℃ 10 s；40個循環(huán)為95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。檢測結(jié)束后，分別根據(jù)擴增曲線和Ct值綜合對結(jié)果進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GB/T 38164—2019體系豬源性成分檢測結(jié)果

圖1顯示試驗空白對照無FAM熒光信號檢出，未出現(xiàn)典型的擴增曲線；陰性對照無FAM熒光信號檢出，未出現(xiàn)典型的擴增曲線；陽性對照有FAM熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0，本次試驗有效。樣品22-W514，有FAM熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0；樣品22-K216，無FAM熒光信號檢出，Ct值大于40.0。依據(jù)GB/T 38164—2019判定要求，判定22-W514為陽性樣品，22-K216為陰性樣品。

2.2 SN/T 3730.8—2013體系豬源性成分檢測結(jié)果

圖2顯示實驗空白對照無FAM熒光信號檢出，無熒光對數(shù)增長，Ct值大于40.0；陰性對照無FAM熒光信號檢出，無熒光對數(shù)增長，Ct值大于40.0；陽性對照有FAM熒光信號檢出，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于30.0，本次試驗有效。樣品22-W514，有FAM熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0；樣品22-K216，無FAM熒光信號檢出，Ct值大于40.0。依據(jù)SN/T3730.8—2013判定要求，判定22-W514為陽性樣品，22-K216為陰性樣品。

2.3 SN/T 2051—2008體系豬源性成分檢測結(jié)果

圖3顯示試驗空白對照及陰性對照均無FAM熒光信號檢出，有VIC熒光信號檢出，且Ct值均小于28.0；陽性對照有FAM和VIC熒光信號檢出，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值均小于28.0，本次試驗有效。樣品22-W514，有FAM和VIC熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值小于35.0；樣品22-K216，無FAM熒光信號檢出，Ct值大于40.0，有VIC熒光信號檢出，Ct值小于35.0。依據(jù)SN/T 2051—2008判定要求，判定22-W514為陽性樣品，22-K216為陰性樣品。

3種不同方法試驗結(jié)果一致，均判定樣品22-W514檢出豬源性成分，樣品22-K216未檢出豬源性成分。

3 討論

目前，在生物學領(lǐng)域動物源性成分的鑒定方法以核酸分析為主，以核酸為基礎(chǔ)的方法包括普通PCR、熒光PCR、聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性等。其中熒光PCR技術(shù)具有快速、簡便、靈敏、高特異性等優(yōu)點，擴增反應(yīng)可在線實時監(jiān)控，尤其是在PCR擴增完成后不需要開蓋對擴增產(chǎn)物進行后續(xù)處理，極大地降低了交叉污染的可能，從而避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。由于該方法具有檢測時間短、靈敏性高、特異性好等特點，目前已成為肉制品品種鑒別最常用的方法。

分子試驗不僅僅會因為實驗室氣溶膠污染導致最終結(jié)果錯誤，DNA提取過程、體系配制、甚至操作失誤等多方面原因也有可能導致試驗失敗。因此在熒光PCR擴增檢測時，不僅僅需要在每一種參數(shù)檢測過程中設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照，還需要在DNA提取過程中設(shè)置試劑提取空白對照，這樣就可以避免由于提取試劑盒本身的污染導致后續(xù)試驗失敗。此外，在對動物源性成分鑒定結(jié)果進行判定時，不能僅僅根據(jù)熒光PCR儀直接給出的Ct值進行判斷，還需要結(jié)合是否出現(xiàn)擴增曲線以及閾值是否滿足要求進行綜合判定，以保證最終結(jié)果的準確性。目前大多數(shù)動物源性成分檢測標準還都是基于定性的方法，定量檢測的方法研究主要基于高通量的檢測方法以及數(shù)字PCR，但是這些方法存在著工作量大、操作繁瑣、對檢驗者及設(shè)備要求高等缺點，目前還尚未廣泛運用在動物源性成分的定量檢測中，這就要求對現(xiàn)有設(shè)備和技術(shù)進行不斷升級優(yōu)化，制定出易于推廣的動物源性成分定量檢測方法。

本次試驗結(jié)果表明，選用3種方法均可以對豬源性成分進行正確判定。需要指出的是，3種方法中SN/T 3730.8—2013僅可以對豬源性成分進行鑒定；SN/T 2051—2008可以對豬、牛、羊3種動物源性成分進行鑒定，但是檢測過程可以控制在1 h以內(nèi)；GB/T 38164—2019可以對包括豬、牛、羊在內(nèi)的20余種動物進行源性成分鑒定，所以在平時的工作中，各實驗室可以根據(jù)自身的要求選擇合適的檢測方法。

能力驗證是檢驗實驗室水平的重要手段之一[6-7]，根據(jù)中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心公布的此次能力驗證的結(jié)果，樣品22-W514和22-K216均獲得“滿意”結(jié)果，證明本實驗室具有對食品中豬源性成分進行有效鑒定的能力。

4 參考文獻

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[2] 蕭揚，潘良文. DNA檢測技術(shù)讓摻假肉制品無所遁形[J]. 食品與生活，2014（3）：24.

[3] 黃惠敏，張東升，李岳樺. PCR技術(shù)在牛羊肉制品成分鑒定及摻假鑒別中的應(yīng)用[J]. 食品安全導刊，2016，135（12）：22-23.

[4] 余卉茹，紀藝，彭城，等.肉類摻假檢測技術(shù)研究進展[J].生物技術(shù)進展，2022，12（2）：213-221.

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[7] 李俊霞，朱虹霖，周浩，等. 食品中馬源性成分定性檢測能力驗證結(jié)果與分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報，2020，11（22）：8491-8495.

（責編：王 菁）

作者簡介 程瀟（1982—），男，安徽六安人，高級工程師。研究方向：食品檢驗。

收稿日期 2023-02-06