高效液相色譜法同時測定糕點中的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸

黃 程，葉小萱，董紅兵

（武漢商學(xué)院 食品科技學(xué)院，湖北武漢 430056）

糕點是人們生活中的一款常見食品，主要以谷類、薯類、豆類、油脂、糖和蛋等中的一種或多種為原料，按需添加其他輔料，經(jīng)過調(diào)制、成型、熟制等工藝制作而成，深受消費者喜愛[1]。在糕點的制作過程中，為了延長其貨架期，人們可能會添加食品防腐劑，以增加糕點的商業(yè)價值[2]。目前，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸等防腐劑的使用在食品中屢見不鮮[3]。防腐劑主要是通過抑制食品中微生物的生長與繁殖達到防腐效果。苯甲酸是人們使用較早的一類酸性食品防腐劑，使用歷史較長，過量攝入會影響人體血壓、心臟、腎臟功能。研究表明，對大鼠肝腎多次給藥苯甲酸鈉，對肝臟造成了一定的損害[4-8]。山梨酸是很多國家的首選防腐劑，具有超高的安全性，但是過量攝入會對人體產(chǎn)生不良影響[9]。脫氫乙酸是一種廣譜高效的食品防腐劑，受到各類食品企業(yè)的普遍歡迎，被廣泛應(yīng)用于奶油、面包、蛋糕等糕點中[10-11]。

目前，對苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸檢測方法的研究很多，但以乙醇-水溶液作為提取溶劑，結(jié)合液相色譜測定的方法研究較少[12-15]。苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測主要采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[16]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[17]中規(guī)定的方法。檢測一份樣品中不同防腐劑的含量需分開檢測，增加了工作量，加大了工作難度，降低了檢測效率，且成本普遍較高，因此建立一種可以同時檢測多種防腐劑的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糕點樣品購買于本地超市。苯甲酸（99.66%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；山梨酸（99.18%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；脫氫乙酸（上海安普實驗科技股份有限公司）；甲醇（色譜級，德國merck 公司）；乙酸銨（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅和氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695 高效液相色譜儀，美國Waters 公司；TGL-205 離心機，湖南平凡科技有限公司；KQ-250B 型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各20 mg 于10 mL 容量瓶中，加入少量無水乙醇溶解后，定容至10 mL 刻度線處，配制成濃度為2 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別移取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中，以無水乙醇定容，配制成濃度為200 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g 粉碎均勻的樣品放入離心管中，加入20 mL 提取溶劑，渦旋混勻，50 ℃超聲提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱：Acclaim 120A C18色 譜 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30.0 ℃；流動相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸銨溶液=13 ∶87（V∶V）；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm。

1.3.4 提取溶液的選擇

準(zhǔn)確稱取空白樣品2 g 于50 mL 離心管中，分別添加10 μg、20 μg、40 μ（gn=3）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩混勻，加入20 mL 乙醇-水溶液（乙醇濃度為0%、20%、40%、50%、60%和80%，V∶V），渦旋混勻，50 ℃超聲提取20 min，冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾上清液，得待測液。高效液相色譜測定待測液中的防腐劑，計算3 種防腐劑的回收率。

1.3.5 方法驗證

①測定線性范圍及檢出限。將苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0.2 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3色譜條件進樣分析，以3 種防腐劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積大小為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②加標(biāo)回收試驗。取空白糕點樣品18 份，每份約2 g，分別添加10 μg、20 μg、40 μg（n=3）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入20 mL 1.3.4 確定的提取溶液，按1.3.2 樣品前處理方法處理樣品，進行加標(biāo)回收試驗，計算各組分的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。③精密度試驗。質(zhì)量濃度為1.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進樣6 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇結(jié)果

由圖1 知，3 個添加水平下，當(dāng)提取溶液中乙醇濃度逐漸升高時，苯甲酸和山梨酸的回收率均較高且相差不大；在100%乙醇作為萃取溶劑時，回收率下降明顯。脫氫乙酸在乙醇含量高于50%時，回收率開始下降，隨提取液中乙醇濃度的提高不斷下降，尤其是在10 μg 加標(biāo)濃度下。且當(dāng)提取液中乙醇含量超過60%時，脫氫乙酸的色譜峰由尖峰變?yōu)轳劮?，本方法提取溶劑中乙醇比例對脫氫乙酸影響較大。綜合考慮，選擇40%乙醇溶液，即40%的乙醇-水溶液作為提取溶劑。

圖1 不同比例乙醇-水溶液對3 種防腐劑的提取回收率

2.2 方法驗證結(jié)果

2.2.1 線性范圍及檢出限

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸在0.20 ～50.33 μg·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)＞0.999。以S/N=3 計算檢出限，以S/N=10 計算定量限，當(dāng)取樣量為2 g 時，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的最低檢出限為0.161 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1、0.160 mg·kg-1，定量限為0.403 mg·kg-1、0.400 mg·kg-1、0.399 mg·kg-1，詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的線性范圍、檢出限、定量限

2.2.2 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

從表2 可看出，3 種防腐劑的平均回收率為93.16%～99.74%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%～4.00%，表明方法回收率和重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，誤差在可接受范圍之內(nèi)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和空白樣品加標(biāo)色譜圖如圖2 所示，3 種防腐劑出峰順序為苯甲酸、脫氫乙酸、山梨酸，保留時間在7.3 min、8.9 min、9.7 min 左右，3 種防腐劑色譜峰峰形良好，峰形尖銳對稱，可完全分離，且樣品中雜質(zhì)對色譜峰無干擾。

表2 苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白樣品加標(biāo)色譜圖

2.2.3 精密度試驗

由表3 可知，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的RSD 為0.51%、0.21%和0.59%，具有良好的精密度。

表3 苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸精密度

2.3 樣品的測定結(jié)果

用建立的方法測定市場銷售的5 批次糕點中3種防腐劑的含量，并與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進行對比，結(jié)果見表4。本實驗方法所測定的實際樣品中的防腐劑含量與國標(biāo)方法測定樣品中防腐劑含量基本相符，本實驗方法的結(jié)果可靠，適用于糕點中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸3 種常用防腐劑的同時檢測。

表4 本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定樣品結(jié)果對比

3 結(jié)論

本研究選取乙醇-水溶液作為提取溶劑，利用高效液相色譜法建立了一種檢測糕點中多種食品防腐劑的方法，考察了該方法的線性范圍、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和精密度等，將檢測結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進行比較，結(jié)果表明該方法具有快速、簡便、高效的優(yōu)點，是一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的檢測方法，可以為糕點中多種防腐劑的測定提供依據(jù)。

注：—代表未檢出。