中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)絡(luò)在分泌性中耳炎中的作用及其研究進(jìn)展

楊志強(qiáng),陳小婉,張小兵

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科,甘肅 蘭州 730000)

分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME),又稱滲出性中耳炎、卡他性中耳炎和膠耳等,是一類以中耳積液及聽力下降為主要特征的疾病。OME的平均發(fā)病率約14.7%,美國(guó)兒科學(xué)會(huì)和耳鼻咽喉學(xué)會(huì)等的數(shù)據(jù)表明在冬季等季節(jié)發(fā)病率甚至可達(dá)84%。OME的臨床表現(xiàn)以聽力逐漸下降為主要癥狀,常無耳痛及耳朵流膿等表現(xiàn),由于90%的患者年齡小于5歲,常由于未察覺癥狀且描述不清而延誤就診,病程延長(zhǎng)后中耳腔滲液的黏稠度增加,更不易清除。中耳腔持續(xù)存在的滲液,會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致黏連性中耳炎、鼓室硬化和膽固醇性肉芽腫等不良后果,造成永久性聽力下降,迄今仍無有效治療方法。OME 患兒平均引起28 dBHL的聽力損失,其中20%的患兒聽力損失大于35 dBHL,同時(shí)OME的好發(fā)年齡正是兒童語言形成及發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期,分泌性中耳炎患兒出現(xiàn)聽力下降,將會(huì)導(dǎo)致語言發(fā)育遲緩,從而影響其交流、閱讀和寫作能力[1-2]。30%～40%的OME患兒反復(fù)復(fù)發(fā),5%～10%的患兒病程達(dá)1年以上[1-2]。OME的發(fā)病主要與咽鼓管功能障礙、感染、免疫相關(guān)[3-4],但該疾病病理機(jī)制尚不明確,其治療方案也不統(tǒng)一[5]。因此,明確OME的病理機(jī)制,提高其診療水平,縮短病程,減小OME對(duì)兒童言語發(fā)育水平及交流能力的不利影響,對(duì)于防聾治聾工作有著重要的意義。

1996年,Takei等[6]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞經(jīng)佛波酯處理后,中性粒細(xì)胞核染色質(zhì)從破裂的核被膜和細(xì)胞膜中釋放而顯示出形態(tài)變化,該變化被認(rèn)為是一種獨(dú)特類型的中性粒細(xì)胞死亡。Brinkmann等[7]對(duì)這種變化進(jìn)行了深入研究,并發(fā)現(xiàn)釋放的核染色質(zhì)能夠形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular traps,NETs),此后涉及NETs的研究明顯增加。NETs是一種能夠?qū)苟拘砸蜃硬缂?xì)菌的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),主要由解聚DNA的胞外鏈以及中性粒細(xì)胞顆粒蛋白組成,這些蛋白包括組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、組織蛋白酶G、白細(xì)胞蛋白酶3等30多種蛋白和酶組成[7-9]。有研究在OME患者中耳滲液中發(fā)現(xiàn)NETs的主要成分如組蛋白、NE等和較高濃度的中性粒細(xì)胞激活標(biāo)志物:MPO和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白等[10-12],提示OME的炎性反應(yīng)以NETs為主。

近年來研究發(fā)現(xiàn),NETs雖可以捕殺細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲,并防止細(xì)菌和真菌播散并對(duì)抗嚴(yán)重感染,但NETs的過度形成會(huì)導(dǎo)致炎癥的惡化、自身免疫性疾病的發(fā)生、癌癥和血栓的形成等[13-16]。其中NETs清除耳部病原體的能力可能有助于在中耳積液中建立穩(wěn)定的生物膜群落,加之胞外DNA形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架,可能會(huì)阻礙中耳積液和相關(guān)細(xì)菌的清除,最終導(dǎo)致慢性O(shè)ME的發(fā)展[17-18]。本綜述將討論NETs的形成及其在OME中作用的研究進(jìn)展,強(qiáng)調(diào)NETs在OME中的雙向作用,為OME的病理機(jī)制提供新思路。

1 NETs的形成

NETs主要包括溶解性NETs和非溶解性NETs。中性粒細(xì)胞經(jīng)各種刺激誘導(dǎo)活化后,會(huì)引起細(xì)胞核DNA和/或線粒體DNA向胞外釋放[19-20],最終形成NETs的主體結(jié)構(gòu)。

溶解性NETs的形成被認(rèn)為是一種特殊類型的中性粒細(xì)胞程序性死亡,屬于固有免疫[14,21]。由于各種刺激,中性粒細(xì)胞內(nèi)依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[22-23]。ROS聯(lián)合MPO并調(diào)節(jié)其表達(dá)[24-25],以促進(jìn)NE釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)[22,24]。細(xì)胞核內(nèi)的NE促進(jìn)組蛋白的瓜氨酸化[26],導(dǎo)致染色質(zhì)解離以及核DNA的釋放,最終導(dǎo)致核DNA的胞外釋放及NETs的形成[22,24,27]。此外,線粒體相關(guān)的ROS在某些刺激下也可誘導(dǎo)溶解性NETs的形成[28-29]。

非溶解性NETs的形成維持了中性粒細(xì)胞質(zhì)膜的完整性,保證了中性粒細(xì)胞的存活及功能的完整性[30-31]。研究表明,非溶解性NETs依賴Toll樣受體和補(bǔ)體蛋白的參與[20,32]。其中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子能夠刺激中性粒細(xì)胞線粒體DNA釋放形成NETs,并且這類NETs的形成與ROS密切相關(guān)[20]。而金黃色葡萄球菌可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞核DNA通過核膜起泡和囊泡輸出的形式形成NETs,這與ROS無明顯相關(guān)性[19]。然而,目前對(duì)非溶解性NETs的研究較少,這需要更多、更深入的研究來拓寬這一領(lǐng)域。

2 NETs在OME中的作用

中性粒細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一,在炎癥初期起到了至關(guān)重要的防御作用。NETs作為中性粒細(xì)胞功能作用的新機(jī)制,依靠其獨(dú)有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒以及寄生蟲等病原微生物的免疫作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),并在心血管疾病、自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和哮喘等疾病中發(fā)揮著重要作用[14,33]。另一方面,NETs獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也阻礙了病原體的清除,促使疾病轉(zhuǎn)化為慢性病狀態(tài)[17-18]。大量研究證明,NETs在OME患者的中耳積液中廣泛存在,并且發(fā)揮著雙向作用。

2.1 OME中的NETs

OME患者或者動(dòng)物模型中耳黏膜或中耳積液中存在NETs,其主要成分以及特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提示OME炎性反應(yīng)中NETs起到了重要作用。OME患者中耳積液廣泛存在NETs結(jié)構(gòu)[10,12,17,34]。流感嗜血桿菌[18]及其裂解物[35]、肺炎雙球菌[36]能夠建立OME動(dòng)物模型,并且在誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中耳黏膜及中耳積液中發(fā)現(xiàn)了NETs主要蛋白成分組蛋白、NE、MPO以及廣泛的胞外DNA網(wǎng)狀纏繞,說明NETs參與OME的炎性反應(yīng)。除了建立動(dòng)物模型,有研究還進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌裂解物[35]、肺炎雙球菌[36]和牛分支桿菌[37]能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成獨(dú)特的網(wǎng)格結(jié)構(gòu),并檢測(cè)到NETs相關(guān)蛋白,這與佛波酯(一種廣泛激活NETs形成的刺激物[36])誘導(dǎo)的形成NETs一致。

2.2 OME中NETs相關(guān)蛋白及信號(hào)通路

NE、MPO、組蛋白在內(nèi)的30余種蛋白參與構(gòu)成NETs的形成[7-9]。而在OME中,研究表明,組蛋白、乳鐵蛋白酶、NE、MPO、黏蛋白5B(mucin 5B,MUC5B)和MUC5AC等蛋白與NETs的形成密切相關(guān)[10,17-18,34,36,38]。其中MUC5B、MUC5AC作為氣道分泌蛋白,主要由氣道杯狀細(xì)胞和黏膜下腺體合成,形成上呼吸道的黏液,對(duì)黏液的黏彈性起決定作用,進(jìn)一步影響?zhàn)ひ豪w毛清除的功能,并且能夠在中耳黏膜中分泌[35,39- 40]。已有研究發(fā)現(xiàn),OME患者的中耳滲液中存在大量的黏蛋白MUC5AC和MUC5B[35],以MUC5B為主[12,41]。病原體的刺激能夠激活NF-κB通路,促進(jìn)趨化因子CxCl2表達(dá),從而間接調(diào)控黏蛋白基因的表達(dá)[35]。而MUC5B的表達(dá)與OME患者聽力損失明顯相關(guān)[41]。在OME患者中耳積液中,MUC5B與胞外DNA組成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[12],此外MUC5B能夠在體外強(qiáng)力誘導(dǎo)NETs的形成[34],這提示MUC5B與NETs的形成具有明顯相關(guān)性。而白介素-8能夠趨化并活化中性粒細(xì)胞,在中耳積液中的細(xì)胞因子具有極高的豐度[12],但其誘導(dǎo)NETs形成的能力較MUC5B弱[34]。也有研究分析了不同病程組OME患者細(xì)胞因子的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)3個(gè)月以上OME兒童中耳積液白介素-8的平均濃度是3個(gè)月以下OME患者的10.9倍,這說明白介素-8可能促進(jìn)了OME轉(zhuǎn)化為慢性病狀態(tài)[42]。

自噬和ROS的形成對(duì)OME相關(guān)NETs的形成是不可或缺的,Dong等[36]使用自噬抑制劑和ROS抑制劑分別處理了OME動(dòng)物和細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)NETs減少,并且ROS抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)自噬的激活。此外,缺乏Toll樣受體4的中性粒細(xì)胞相對(duì)于正常中性粒細(xì)胞ROS表達(dá)量降低、自噬活性下降及NETs減少,表明在急性O(shè)ME過程中,NETs是中性粒細(xì)胞對(duì)抗肺炎雙球菌的重要抗菌物質(zhì),其中Toll樣受體4通過調(diào)控自噬激活和ROS的產(chǎn)生參與調(diào)節(jié)了NETs的形成[36]?？贵w一般由B淋巴細(xì)胞分泌,并與抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物而被機(jī)體清除。Short等[43]檢測(cè)了正常小鼠、缺乏B細(xì)胞抗體小鼠和缺乏聚合性免疫球蛋白受體(導(dǎo)致血清游離IgA、IgG增多)小鼠的OME模型中NETs的表達(dá),以及小鼠中耳細(xì)菌的滴度,發(fā)現(xiàn)抗體促進(jìn)了NETs的形成,并導(dǎo)致了細(xì)菌在中耳的生長(zhǎng),這可能是OME慢性持續(xù)的原因之一。

2.3 NETs參與OME細(xì)菌生物膜的形成

研究發(fā)現(xiàn),NETs對(duì)細(xì)菌生物膜的形成具有顯著作用,這會(huì)促使疾病轉(zhuǎn)化為慢性病狀態(tài)。在OME的龍貓模型中, NETs存在于流感嗜血桿菌為主的細(xì)菌生物膜中,由于流感嗜血桿菌表面的寡聚糖會(huì)抵抗NETs對(duì)細(xì)菌的清除,NETs特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)反而有助于生物膜的形成,并最終導(dǎo)致了細(xì)菌在體內(nèi)的持久性[18]。Tornton等[17]的研究評(píng)估了36份中耳積液樣本,發(fā)現(xiàn)33份樣本存在廣泛由NE與胞外DNA共同纏繞形成的NETs,并且NETs中DNA和細(xì)菌均與凝集素相聯(lián)系,而凝集素與生物膜基質(zhì)中的糖蛋白結(jié)合,提示DNA參與構(gòu)成了中耳積液中的多菌生物膜,NETs清除耳部病原體的能力可能有助于在中耳積液中建立穩(wěn)定的生物膜群落。在急性中耳炎的動(dòng)物顳骨和急性起病和復(fù)發(fā)中耳炎捐贈(zèng)者的顳骨中,細(xì)菌被包裹在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)的NETs中,以遏制和消除細(xì)菌,但它也可能保護(hù)這些微生物不被炎癥細(xì)胞和抗生素清除,從而提供細(xì)菌聚集和生物被膜生長(zhǎng)的環(huán)境,并增加再次感染和疾病慢性化的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

2.4 OME中NETs的降解

NETs由胞外DNA作為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架,上面有各種顆粒蛋白鑲嵌、纏繞和包繞而形成的三維結(jié)構(gòu)[7]。DNA作為結(jié)構(gòu)主體的破壞能夠促進(jìn)NETs的降解,從而促進(jìn)炎癥前期病原體對(duì)NETs清除的抵抗[37, 44]或是改善慢性炎癥中病原體在中耳的清除[17, 43]。牛分枝桿菌能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs,與此同時(shí),其分泌的核酸酶MnuA能夠迅速酶解NETs的胞外DNA鏈,引起NETs的降解,并抵抗NETs對(duì)牛分枝桿菌的清除[36-37]。DNA酶干預(yù)肺炎雙球菌導(dǎo)致的OME小鼠模型后,小鼠中耳細(xì)菌滴度明顯下降[43]。而在DNA酶處理后的中耳積液中,NETs的胞外DNA結(jié)構(gòu)及細(xì)菌生物膜基質(zhì)的降解,導(dǎo)致細(xì)菌暴露于機(jī)體的免疫系統(tǒng)并被清除[17]。因此,局部使用DNA酶結(jié)合抗生素,不失為慢性及復(fù)發(fā)性O(shè)ME患者的一種新的治療方案。

3 總結(jié)與展望

OME是常見引起聽力下降的疾病,感染在其疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。目前NETs在OME中的研究較少,但已經(jīng)逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。一方面,中性粒細(xì)胞釋放的NETs能夠清除病原體,對(duì)抗感染;另外一方面NETs獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可能保護(hù)病原體對(duì)抗免疫系統(tǒng)和抗生素的清除,并且有些病原體能生成對(duì)抗NETs的分泌物,這進(jìn)一步導(dǎo)致了疾病的遷延不愈。

NETs參與了多種疾病過程,作為新的治療靶點(diǎn),NETs抑制劑對(duì)疾病的治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展:當(dāng)使用DNA酶處理細(xì)胞后,NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)降解; DNA酶已經(jīng)被批準(zhǔn)用于囊性纖維化和膿胸的治療[45];中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑西維來司鈉通過減少NETs的合成,具有保護(hù)上皮細(xì)胞的作用,被用于肺損傷等疾病的治療[46]。在OME動(dòng)物模型身上,給予DNA酶鼓室注射后,觀察到了鼓室積液減少[17]。目前,關(guān)于NETs對(duì)抗并清除中耳炎病原體的作用機(jī)制仍有很大的研究空間。因此,如果能夠明確感染和NETs在OME中的病理機(jī)制,平衡NETs的雙向作用,將為OME的治療提供新的方向,尤其是對(duì)病程較長(zhǎng)、滲液黏稠的患者具有更重要的意義。