宏基因組二代測(cè)序技術(shù)在惡性血液病并發(fā)感染中的診斷價(jià)值分析

姜春輝

（北京高博博仁醫(yī)院分子診斷科，北京 100070）

感染屬于臨床惡性血液病患者十分常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，主要因患者自身免疫功能低下所致。惡性血液病患者需要接受放化療治療，或應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制等藥物，會(huì)對(duì)自身的免疫功能造成影響，極大程度地增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)。目前，臨床診斷惡性血液病患者是否合并感染的技術(shù)較多，包括炎癥指標(biāo)檢測(cè)、影像學(xué)檢查、病原體檢測(cè)等，但傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)易出現(xiàn)漏診、誤診的情況，且難以鑒別病原體類型，治療方案也多是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)制定，可能影響治療效果，甚至延誤治療[1]。因此，尋找一種準(zhǔn)確、快速的診斷方法成為臨床深入研究的課題。宏基因組二代測(cè)序（mNGS）技術(shù)是近幾年新發(fā)展形成的病原體檢測(cè)技術(shù)，能夠一次檢測(cè)完成百萬(wàn)以上堿基對(duì)的核酸序列，通過(guò)與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，從而可鑒別病原體種類，制定針對(duì)性的治療方案[2]。本次研究以2019 年4 月至2022 年4 月我院收治的260 例惡性血液病疑似并發(fā)感染患者為研究對(duì)象，對(duì)比分析傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)與mNGS 技術(shù)診斷惡性血液病合并感染的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年4 月至2022 年4 月我院收治的260例惡性血液病疑似并發(fā)感染患者作為研究對(duì)象，其中男性140 例，女性120 例；年齡7 ～93 歲，平均年齡（45.94±5.25）歲；其中，130 例患者確診為急性髓系白血病，74 例患者確診為急性淋巴細(xì)胞白血病，24 例患者確診為骨髓增生異常綜合征，14 例患者確診為淋巴瘤，18 例患者確診為其他惡性血液病。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診為惡性血液疾病，且符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）體溫超過(guò)37.5℃，考慮并發(fā)感染；（3）同意配合本次診療研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料缺失；（2）樣本污染；（3）抵觸配合研究。本研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 對(duì)患者臨床癥狀的發(fā)作情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和評(píng)估，于寒戰(zhàn)或高燒發(fā)作的預(yù)估高峰前30 ～50 min采集檢驗(yàn)樣本，包括：外周血、腦脊液、支氣管灌洗液、胸腹水等。

1.2.2 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)方法 體液樣本均使用血培養(yǎng)儀培養(yǎng)，并對(duì)樣本中的病原體種類給予鑒別，嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家提供的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 mNGS 檢測(cè)方法 體液樣本采集后放于室溫下保存并立即檢測(cè)。提取體液中的游離核酸，需要將樣本以4000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層清液進(jìn)行DNA 提取，使用柱提法進(jìn)行微生物DNA 提取。取適量純化后的DNA 樣本，在DNA 片段化的同時(shí)采用轉(zhuǎn)座酶法進(jìn)行末端修復(fù)和接頭的連接，以確保低起始量的DNA 建庫(kù)成功。DNA 文庫(kù)純化后進(jìn)行PCR 富集，利用Realtime 方式對(duì)文庫(kù)濃度進(jìn)行絕對(duì)定量，以Q-Sep 100 進(jìn)行插入片段大小的質(zhì)控。待文庫(kù)質(zhì)控確認(rèn)無(wú)誤后，使用Nextseq550 測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序，有效數(shù)據(jù)不少于20 M。測(cè)序完成后，利用生物信息軟件對(duì)DNA 序列信息給予分析。先通過(guò)測(cè)序標(biāo)簽對(duì)樣本進(jìn)行拆分、剪切接頭、過(guò)濾掉低質(zhì)量片段及長(zhǎng)度低于35 bp 的序列等操作，獲取高質(zhì)量的DNA 序列。再將其與病原數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列進(jìn)行比較，比對(duì)成功的序列要再去除高重復(fù)序列（duplication）、低質(zhì)量比對(duì)序列等。根據(jù)生物信息分析后得到的結(jié)果計(jì)算檢出病原的參數(shù)，包括比對(duì)序列數(shù)、覆蓋度以及測(cè)序深度等。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌、真菌、病毒等分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）檢出率、敏感性、特異性。以臨床綜合診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)與mNGS 技術(shù)對(duì)惡性血液病并發(fā)感染的檢出率，以及診斷惡性血液病并發(fā)感染的敏感性與特異性。細(xì)菌/ 病毒陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：覆蓋率超過(guò)其他微生物10 倍以上；真菌陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)：覆蓋率超過(guò)其他真菌5 倍以上。敏感性= 真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+ 假陽(yáng)性例數(shù)）×100.00% ；特異性= 真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100.00%。（2）多種病原菌檢出率。分別計(jì)算兩種診斷技術(shù)對(duì)不同病原菌的檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 25.0 軟件作為結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的專用處理軟件，% 作為計(jì)數(shù)資料結(jié)果記錄的格式，用χ2 檢驗(yàn)，±s作為計(jì)量資料結(jié)果記錄的格式，用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果

260 例惡性血液病患者經(jīng)臨床綜合判斷，確診186 例患者并發(fā)感染，占比71.54%。傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果如表1 所示。

表1 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果（例）

2.2 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)診斷敏感性、特異性的比較

通過(guò)計(jì)算，mNGS 技術(shù)診斷惡性血液病合并感染的敏感性、特異性均明顯高于傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)診斷敏感性、特異性的比較[%（例/例）]

2.3 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)對(duì)多種病原菌的檢出率

通過(guò)計(jì)算，mNGS 技術(shù)檢出細(xì)菌、真菌及病毒的陽(yáng)性率均明顯高于傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)、mNGS 技術(shù)對(duì)多種病原菌的檢出率[例（%）]

3 討論

并發(fā)感染是臨床患者病情快速加重或死亡的重要誘因。感染產(chǎn)生的多種炎性因子具有不同的細(xì)胞毒性，可直接對(duì)組織、系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響，給機(jī)體造成更大的負(fù)荷。尤其對(duì)于惡性血液病群體而言，其本身便有全身性癥狀，并伴有機(jī)體的免疫功能下降，同時(shí)需接受化療、放療、靶向治療等多種方式干預(yù)，易引發(fā)骨髓抑制等問(wèn)題，因此惡性血液病患者均表現(xiàn)出不同程度的免疫功能衰退特性，使其成為院內(nèi)感染的高危群體[3-4]。此外，惡性血液病患者體內(nèi)的粒細(xì)胞數(shù)量大幅度減少，甚至部分群體可能出現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏的問(wèn)題，這種情況會(huì)造成感染病原體后無(wú)法形成具有感染特性的病灶，最終嚴(yán)重影響臨床對(duì)感染病原體種類的判斷，延誤治療時(shí)機(jī)，甚至可引起多重病原體感染，使患者的病情在短時(shí)間內(nèi)快速惡化。近年來(lái)，憑借現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷革新和完善，雖然惡性血液病患者的死亡率得到一定控制，但并發(fā)感染后引起死亡的概率仍居高不下。國(guó)內(nèi)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，惡性血液病患者并發(fā)感染后的死亡率可達(dá)23% 左右，而此類患者并發(fā)感染的概率則超過(guò)了50%，尤以血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)感染占比最高，前者的發(fā)生率甚至占所有惡性血液病并發(fā)感染的1/3 以上。因此，臨床上在治療惡性血液病并發(fā)感染時(shí)，需要快速、準(zhǔn)確地判斷導(dǎo)致感染的病原體種類，以便采取針對(duì)性的抗菌治療措施，在最短的時(shí)間內(nèi)控制感染，避免患者的病情加重，縮短整體治療周期[5-6]。

既往臨床針對(duì)感染的診斷方法以病原學(xué)檢測(cè)為主，可通過(guò)分離、提純樣本中的微生物，并進(jìn)一步培養(yǎng)，從而獲得具體的微生物種類，使用的方法有免疫學(xué)檢測(cè)、PCR 技術(shù)、微生物培養(yǎng)等。但這些方法均存在一定的局限性，即鑒別的準(zhǔn)確性完全依賴于分離的活體菌株，若分離活體菌株的數(shù)量不足，則體外培養(yǎng)結(jié)果可能存在偏差，加之該培養(yǎng)過(guò)程需要至少48 h，而部分真菌、結(jié)核分枝桿菌等對(duì)外界生存環(huán)境要求苛刻的病原體種類所需的培養(yǎng)時(shí)間還會(huì)被進(jìn)一步延長(zhǎng)，甚至部分菌株完全不適合在體外分離培養(yǎng)，故可導(dǎo)致漏檢、誤檢等問(wèn)題[7]。在臨床實(shí)踐工作中，通過(guò)血樣微生物培養(yǎng)方式得出的陽(yáng)性率相對(duì)較低，且精準(zhǔn)度也欠缺，加之消耗的周期較長(zhǎng)，因而正在被逐漸淘汰。免疫學(xué)檢測(cè)中的抗原/ 抗體檢測(cè)可通過(guò)人體受到抗原刺激后產(chǎn)生的特異性抗體完成檢測(cè)，從而快速、準(zhǔn)確地判斷病原體種類，但實(shí)際操作過(guò)程中會(huì)受到抗原包被、洗滌等客觀因素的影響，導(dǎo)致假陽(yáng)性問(wèn)題的出現(xiàn)。同時(shí)，該檢測(cè)技術(shù)在病毒種類的鑒別方面存在一定的不足，尤其是針對(duì)具有快速變異特性的病毒而言，檢出率極低[8]。分子診斷技術(shù)屬于新型檢測(cè)技術(shù)的一種，但需借助PCR 技術(shù)對(duì)已知特定的核酸序列給予分辨，操作時(shí)需設(shè)計(jì)特定的引物，消耗的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且若患者存在多重感染的情況，會(huì)進(jìn)一步增加檢驗(yàn)的難度。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)惡性血液病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)此類患者并發(fā)感染時(shí)出現(xiàn)混合型、多重耐藥菌感染的概率越來(lái)越高，使得病原體譜系越發(fā)復(fù)雜，給病原體的鑒別工作提出了更高的要求，傳統(tǒng)檢驗(yàn)方式越來(lái)越不適應(yīng)現(xiàn)代臨床需求。

mNGS 技術(shù)屬于新型非靶向、廣譜病原體篩查技術(shù)之一，能夠獲得采集樣本中所有病原體的基因核酸片段，且無(wú)需對(duì)各片段給予分離、提純等處理工序，大幅節(jié)省了整體檢查時(shí)間，并且在檢查過(guò)程中不會(huì)出現(xiàn)偏移現(xiàn)象。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)速度快、通量高、敏感度高、準(zhǔn)確性高、覆蓋面廣等，可用于快速、精準(zhǔn)檢測(cè)病原體的工作當(dāng)中[9]。mNGS 技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病原體種類的全覆蓋檢測(cè)，且測(cè)序技術(shù)無(wú)偏倚性缺陷，因而敏感性、準(zhǔn)確性均相對(duì)較高。該技術(shù)在檢測(cè)DNA、RNA 核酸序列時(shí)使用的是平行排列測(cè)序法，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)所有感染病原體的鑒別，為后續(xù)靶向治療方案的擬定提供準(zhǔn)確的參考，最大程度地減少了漏診、誤診情況的發(fā)生，同時(shí)也能夠縮短獲取病原體種類的時(shí)間，為早期的抗感染治療提供了保障，避免患者的病情進(jìn)一步惡化，并減少了多重耐藥菌株的出現(xiàn)。但需要注意的是，實(shí)際采樣過(guò)程中無(wú)法完全避免核酸污染的情況，加之人體內(nèi)本身也含有部分菌群，使得感染群體的原生菌群鑒別難度增加，因此操作過(guò)程中必須嚴(yán)格遵照無(wú)菌操作標(biāo)準(zhǔn)，最大程度地避免核酸污染的發(fā)生[10]。同時(shí)，mNGS 技術(shù)在應(yīng)用時(shí)需標(biāo)明檢出基因的序列數(shù)，再參照人類現(xiàn)有的病菌基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，從而判斷、鑒別所感染的病原菌種類。但由于mNGS 結(jié)果的產(chǎn)生存在較高的復(fù)雜性，因此通常將檢出序列數(shù)值最高者認(rèn)定為病原體的主要數(shù)據(jù)，而少部分病原體的基因序列數(shù)值偏低，這類病菌在檢測(cè)時(shí)往往會(huì)被認(rèn)定為疑似病原體。另外，各地區(qū)醫(yī)院搭建的病原菌數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)不同、解讀人員依照的標(biāo)準(zhǔn)不同，使得不同醫(yī)院間的診斷標(biāo)準(zhǔn)缺乏統(tǒng)一性，患者轉(zhuǎn)院后的檢查報(bào)告可能存在出入[11]。除此之外，雖然近幾年國(guó)家對(duì)于醫(yī)療費(fèi)用的控制仍在不斷加強(qiáng)，使得多項(xiàng)臨床檢查的成本得以降低，其中就包括基因測(cè)序鑒別（目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了“千元級(jí)”的基因測(cè)序），但對(duì)于普通群眾來(lái)說(shuō)仍屬于高額醫(yī)療成本[12]。且mNGS 技術(shù)常被應(yīng)用于重大疾病、突發(fā)性公共衛(wèi)生事件、重癥感染、免疫缺陷人群的檢查等工作當(dāng)中，這也使得其臨床應(yīng)用受到極大限制。

總之，臨床可利用mNGS 技術(shù)診斷惡性血液病患者是否并發(fā)感染，具有較高的準(zhǔn)確率和敏感性，同時(shí)可判斷具體的病原體種類，為進(jìn)一步制定治療方案提供依據(jù)及支持，值得臨床運(yùn)用推廣。