多組學(xué)分析LARP1在泛癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后、腫瘤微環(huán)境的關(guān)系

劉 鑫，胡福境，蘇 穎，曾毅飛，潘芳蓮，覃桂聰

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530199)

RNA 結(jié)合蛋白(RBP) 具有高度動態(tài)的時(shí)空調(diào)控作用和重要的生物學(xué)功能，它們通過轉(zhuǎn)錄后控制RNA 的加工和運(yùn)輸，包括調(diào)節(jié)RNA 剪接、聚腺苷酸化、mRNA 穩(wěn)定性、mRNA 定位和翻譯，對維持轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定至關(guān)重要[1]。人類RBPs 約有2000 種，占蛋白質(zhì)編碼基因的7.5%。越來越多的研究表明，RBPs 介導(dǎo)的RNA 修飾在癌癥進(jìn)展中具有重要作用，它們可在不同類型的癌癥中異常表達(dá)，同時(shí)可調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)和功能[2]。La 相關(guān)蛋白1 (LARP1) 是一種進(jìn)化保守的RNA 結(jié)合蛋白，屬于LARP 超家族的一員。它在果蠅體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)，被證明可與聚腺苷酸結(jié)合蛋白(PABP) 結(jié)合，是胚胎發(fā)育和生育所必需的RNA 結(jié)合蛋白。研究表明，LARP1 是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 通路與TOP mRNA 調(diào)控之間的重要的鏈接蛋白，是mTORC1 的底物，通過它的多個(gè)結(jié)構(gòu)域如LaM、RRM-L、PABP 結(jié)合域、DM15 域的mRNA 結(jié)合，既可以調(diào)節(jié)以5′末端寡核苷酸( 5′TOP)基序?yàn)樘卣鞯膍RNA 的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)譯，也可與某些5′TOP mRNA 的3′ 端多聚A 尾結(jié)合調(diào)節(jié)mRNA 的功能[3]。在宮頸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多種癌癥中，LARP1 的高表達(dá)與臨床轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系密切[4-6]。雖然研究表明LARP1 在多種腫瘤中均有促癌的作用，但目前仍缺乏它在泛癌中作用及相關(guān)機(jī)制的分析。因此，本研究運(yùn)用多種數(shù)據(jù)庫對LARP1 的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析，利用多組學(xué)數(shù)據(jù)證明LARP1 是影響患者腫瘤發(fā)生和臨床預(yù)后的關(guān)鍵分子，也是泛癌微環(huán)境中的關(guān)鍵調(diào)控因子。

1 資料與方法

1.1 基于TIMER 數(shù)據(jù)庫分析LARP1 在腫瘤組織中的表達(dá)譜

TIMER 2.0（http://timer.cistrome.org/）是一個(gè)分析各種癌癥中免疫細(xì)胞浸潤的在線資源數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫采用反卷積方法作為統(tǒng)計(jì)方法，可從基因表達(dá)譜中推斷腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤豐度。本研究主要是應(yīng)用Cancer Exploration 模塊中的 Gene_DE 模塊分析LARP1 在33 種TCGA 數(shù)據(jù)庫腫瘤組織中的表達(dá)。

1.2 不同腫瘤組織中LARP1 蛋白的表達(dá)水平以及啟動子甲基化水平

應(yīng)用UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/）分析LARP1 在乳腺癌 （BRCA）、卵巢癌 （OV）、結(jié)腸癌（COAD）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）和肺腺癌 （LUAD）組織中的表達(dá)情況及甲基化情況。

1.3 LARP1 基因在 腫瘤中的改變情況

應(yīng)用cBioPortal 數(shù)據(jù)庫（https://www.cbioportal.org/）分析LARP1 在腫瘤中的改變情況。

1.4 分析LARP1 與腫瘤臨床病理分期的關(guān)系

應(yīng)用R 語言(3.6.3 版本)ggplot2(3.3.3 版本)R 包對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，應(yīng)用多重假設(shè)檢驗(yàn)(Dunn’s test) 法分析LARP1 在不同腫瘤分期中的意義。

1.5 預(yù)后分析

根據(jù)Kaplan-Meier 曲線分析29 種癌癥中LARP1表達(dá)與患者預(yù)后〔包括總生存期(OS)、疾病特異性生存期(DSS)〕之間的關(guān)系。應(yīng)用單因素生存分析法計(jì)算危險(xiǎn)比(HRs) 和95% 置信區(qū)間。

1.6 腫瘤中LARP1 與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

采用TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，應(yīng)用R 語言(3.6.3 版本)GSVA 包(1.34.0 版本)(H?nzelmann et al, 2013) 中的ssGSEA 分析各種腫瘤中LARP1 與24 種免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，結(jié)果以熱圖顯示。

1.7 腫瘤中LARP1 與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性分析

采用SangerBox 數(shù)據(jù)庫，對LARP1 蛋白表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。在UCSC(https://xenabrowser.net/) 數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的泛癌數(shù)據(jù)集：TCGA TARGET GTEx(PANCAN,N=19131,G=60499), 進(jìn)一步從中提取LARP1 基因和60 個(gè)兩類免疫檢查點(diǎn)途徑基因Inhibitory(24)、Stimulatory(36)，對每一個(gè)表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2(x+0.001) 變換，計(jì)算LARP1 與免疫途徑標(biāo)記基因的pearson 相關(guān)性。

2 統(tǒng)計(jì)分析

采用R 軟件包（3.6.3 版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)法分析LARP1 mRNA 在泛癌中的表達(dá)情況，將Survival 包（3.2-10 版本）用于生存治療分析，采用Bonferroni 法校正的顯著性水平多重假設(shè)檢驗(yàn)(Dunn’s test) 法分析LARP1 與病理分期的相關(guān)性，將GSVA 包(1.34.0 版本) 用于免疫浸潤關(guān)聯(lián)性分析。

3 結(jié)果

3.1 泛癌中LARP1 mRNA 的表達(dá)水平

TIMER 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，相較于正常組織，LARP1 在 BLCA、BRCA、CHOL、COAD、HNSC、KICH、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、STAD中的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在GBM、KIRP、THCA 中的表達(dá)明顯減低（P＜0.05）。見圖1。

3.2 不同腫瘤組織中LARP1 蛋白的表達(dá)水平以及DNA 甲基化水平

利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫 CPTAC 模塊分析 9 種癌組織中LARP1 蛋白的表達(dá)水平。與癌旁正常組織比較，LIHC、OV、COAD、BRCA、KIRC、LUAD 、UCEC組織中 LARP1 蛋白的表達(dá)水平明顯升高 （P＜0.01），GBM 和PAAD 組織中LARP1 蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）( 見圖2)。DNA 甲基化分析也發(fā)現(xiàn)，在 BRCA、CHOL、COAD、LUAD、UCEC 等腫瘤組織中LARP1 DNA 甲基化水平顯著降低（見圖3）。

圖2 CPTAC 數(shù)據(jù)庫分析LARP1 蛋白在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平

圖3 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析LARP1 蛋白在腫瘤中LARP1 啟動子甲基化的水平

3.3 LARP1 基因在腫瘤中的改變情況

使用cBioPortal (TCGA, pan-cancer Atlas)數(shù)據(jù)庫研究LARP1 基因在泛癌中改變情況的結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌LARP1 基因突變率最高，達(dá)7.51% ；幾乎所有的腫瘤中都存在LARP1 基因突變的情況（見圖4a），LARP1 基因突變明顯影響腫瘤患者的總體生存率（見圖4b）。

圖4a LARP1 基因在泛癌中的改變情況

圖4b LARP1 基因改變對腫瘤患者總體生存率的影響

3.4 LARP1 與腫瘤病理分期的關(guān)系

應(yīng)用R 語言(3.6.3 版本)ggplot2(3.3.3 版本)R 包對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的不同病理分期（Stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察LARP1 與腫瘤分期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LARP1 表達(dá)升高與LIHC、LUAD、SKCM、LUSC、ACC、STAD、THCA 病理分期明顯相關(guān)（見圖5）。

圖5 LARP1 與腫瘤病理分期的關(guān)系

3.5 LARP1 表達(dá)與癌癥患者預(yù)后之間的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，LARP1 與ACC、BRCA、CESC、HNSC、KIRC、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UCEC、UVM 患者的總生存期明顯相關(guān)；其中LARP1 的高表達(dá)與ACC、BRCA、CESC、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UCEC、UVM、HNSC 預(yù)后差明顯相關(guān)（見圖6a）。疾病特異性生存期（DSS）方面的結(jié)果顯示LARP1的表達(dá)情況影響了ACC、BRCA、CESC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、OV、PAAD、SKCM、UVM 13 種腫瘤的DSS（見圖6b）。

圖6a LARP1 表達(dá)與腫瘤OS 的關(guān)系

圖6b LARP1 表達(dá)與腫瘤DSS 的關(guān)系

3.6 LARP1 與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系

R 語言分析結(jié)果顯示，LARP1 的表達(dá)水平與ACC、BLCA、BRCA、CESC、COAD 等19 種腫瘤組織中免疫細(xì)胞（活化的樹突狀細(xì)胞、B 細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、免疫性樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK 細(xì)胞亞群CD56bright、NK 細(xì)胞亞群CD56dim、NK 細(xì)胞、漿細(xì)胞樣DC 細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、輔助性T淋巴細(xì)胞、中央記憶性T 淋巴細(xì)胞、濾泡輔助性T 淋巴細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、Th1 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞）的表達(dá)水平有明顯的相關(guān)性（0 ＜r＜1，P＜0.01）。其中與輔助性T 淋巴細(xì)胞、中央記憶性T 淋巴細(xì)胞、Th2 細(xì)胞在大多數(shù)腫瘤中呈正相關(guān)（見圖7）。

圖7 各種腫瘤中LARP1 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

3.7 LARP1 蛋白表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)的相關(guān)性

采用SangerBox 數(shù)據(jù)庫，對LARP1 蛋白表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8 所示。LARP1 在眾多腫瘤中與刺激性和抑制性免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)均有顯著的相關(guān)性。

圖8 LARP1 蛋白表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平的相關(guān)性

4 討論

目前，腫瘤仍然是威脅人類健康的主要疾病之一，世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名前三的腫瘤是乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌[7]。針對惡性腫瘤的治療方式主要有手術(shù)、化療、放療以及基于檢查點(diǎn)的免疫療法、分子靶向治療，早期發(fā)現(xiàn)和有效治療是改善癌癥患者預(yù)后的重要前提。腫瘤患者個(gè)體化的精準(zhǔn)治療是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵，其中分子靶向藥物治療療效顯著，副作用小，但藥效的個(gè)體差異較大。免疫檢查點(diǎn)蛋白(ICP) 的鑒定是免疫學(xué)中最熱門的研究課題之一。ICP 能夠以環(huán)境依賴性的方式調(diào)節(jié)多種免疫功能。針對癌癥患者的ICP 治療，常用的藥物是ICP 的抑制劑，它可以阻斷免疫檢查點(diǎn)對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用，克服傳統(tǒng)癌癥治療的局限性，相關(guān)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)取得了較好的效果，有數(shù)種藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床[8]。因此，單基因的泛癌生物信息學(xué)分析有助于研究不同癌癥之間的異同，研究其與免疫細(xì)胞及免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系，可為癌癥預(yù)防和個(gè)性化靶向治療及免疫治療策略的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

通過分析，我們發(fā)現(xiàn)RNA 結(jié)合蛋白LARP1 在BLCA、BRCA、CHOL、COAD、HNSC 等多種腫瘤與正常組織中存在明顯的表達(dá)差異，且與腫瘤的分期和預(yù)后存在明顯的相關(guān)性。目前國內(nèi)的多個(gè)研究已證實(shí)LARP1 的表達(dá)與卵巢癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌及膽囊癌的預(yù)后明顯相關(guān)，隨著研究的深入，LARP1 有望成為評估特定腫瘤患者預(yù)后的一個(gè)潛在的重要標(biāo)志物。

DNA 甲基化是一種在表觀遺傳基因表達(dá)調(diào)控、基因組印記、X 染色體失活、轉(zhuǎn)座子沉默和基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用的化學(xué)修飾過程，異常DNA甲基化模式是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一；基因啟動子的DNA 高甲基化使基因轉(zhuǎn)錄受抑，常導(dǎo)致癌細(xì)胞中抑癌基因的沉默或失活[9]。分析發(fā)現(xiàn)在BRCA、CHOL、COAD、LUAD、UCEC 等腫瘤組織中，LARP1 DNA甲基化水平顯著降低，同時(shí)這些腫瘤中的LARP1 呈高表達(dá)，故DNA 甲基化與LARP1 表達(dá)的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。除此之外，在眾多腫瘤中都存在LARP1基因突變、擴(kuò)增和深度缺失等情況，LARP1 基因的這些改變似乎能改善腫瘤的總體死亡率，LARP1 基因改變對不同類型腫瘤的影響有待深入研究。

腫瘤微環(huán)境（TME）包括腫瘤中的所有非癌性宿主細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞、適應(yīng)性和先天免疫細(xì)胞（如T 淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等），以及其非細(xì)胞成分，包括細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 和可溶性產(chǎn)物，如趨化因子、細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外囊泡。TME 在癌癥特征的獲得和維持中發(fā)揮著重要作用，如維持增殖信號、抵抗細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)血管生成、激活侵襲和轉(zhuǎn)移、引發(fā)腫瘤促炎、避免免疫破壞[10]。針對TME 中成分的治療，是腫瘤治療的一個(gè)新方向，例如靶向成纖維細(xì)胞表面FAPα特異性抗原的西羅株單抗和在研多種針對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的藥物均已取得可喜的臨床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11]。我們通過分析發(fā)現(xiàn)，LARP1 在腫瘤中與樹突狀細(xì)胞、輔助性T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞存在相關(guān)性，其中與輔助性T 淋巴細(xì)胞、中央記憶性T 淋巴細(xì)胞、Th2 細(xì)胞在大多數(shù)腫瘤中呈正相關(guān)。我們分析各種腫瘤中LARP1 與免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)腫瘤中，LARP1 與刺激性和抑制性免疫均呈正相關(guān)，這顯示了腫瘤免疫環(huán)境的復(fù)雜性，說明LARP1 參與了腫瘤生存、發(fā)展的免疫調(diào)控作用，對其具體機(jī)制的研究具有重要意義。

5 結(jié)論

通過泛癌分析發(fā)現(xiàn)，LARP1 在多種腫瘤中異常表達(dá)，與多種腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)；與多種癌癥中活化的樹突狀細(xì)胞、B 細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、免疫性樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤相關(guān)。在多種癌癥中，均可觀察到LARP1 甲基化減少,LARP1 的表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)標(biāo)記物的表達(dá)顯著相關(guān)。進(jìn)一步研究LARP1 在癌癥中的分子機(jī)制對癌癥的診治具有非常重要的意義。