進展期白癜風患者腸道微生物菌落構(gòu)成及功能特征

欒梅,趙怡馨,李盼,牟寬厚

白癜風是一種色素脫失性自身免疫性疾病,全球發(fā)病率約0.5%～2.0%,發(fā)病機制尚未完全明確,包括有遺傳學說、自身免疫學說、精神與神經(jīng)化學學說、微量元素缺乏和自由基損傷學說等[1]。近來腸道微生物在白癜風發(fā)病中的作用受到關(guān)注。白癜風患者合并幽門螺旋菌感染及炎癥性腸病的幾率高于健康人群[2-3]。白癜風小鼠模型的研究表明,口服抗生素(氨芐青霉素)改變小鼠腸道菌群組成可顯著加速白癜風病理進程,提示腸道菌群的改變與疾病活動相關(guān)[4]。目前白癜風患者腸道菌群如何參與白癜風病理進程尚不清楚。為進一步探究腸道菌群在白癜風發(fā)病中的作用,筆者通過宏基因組學技術(shù)分析非節(jié)段型進展期白癜風患者腸道微生物組成及基因功能與潛在的代謝通路,為探索疾病的發(fā)病機制及臨床診療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 納入2022年6月—2022年9月就診于西安交通大學第一附屬醫(yī)院皮膚科的進展期非節(jié)段型白癜風患者25例,納入標準符合2021版《白癜風診療共識》[5],排除標準為既往有自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤、其他臟器疾病(甲狀腺、心臟、消化道等)及其他皮膚病,或在前3個月內(nèi)曾系統(tǒng)使用抗生素或其他免疫抑制劑,納入男18例,女7例,平均年齡(30.47±9.03)歲,身高體重指數(shù)(body mass index,BMI)為22.81±4.05。對照組納入25例性別、年齡和BMI相匹配的健康志愿者。本研究經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。所有參與者都簽署了知情同意書。

1.2樣品收集 糞便樣本使用快速提取試劑盒(MGIEasy糞便樣本收集試劑盒,上海,中國),患者排便取新鮮糞便10 g,取樣后立即儲存在-80 ℃的冰箱中。

1.3宏基因組測序 使用MagbeadsDNA?快速提取試劑盒(MP生物醫(yī)藥,上海,中國)提取糞便樣本中DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳法測定提取的DNA濃度。用超聲波碎波儀將DNA修剪至平均約420 bp,構(gòu)建成對端文庫。舍棄低質(zhì)量、與接頭序列重疊的堿基,使用Bowtie2軟件(v2.3.5.1)去除宿主基因。按照說明,在BGI平臺(MGESEQ-T7,深圳, 中國)上對人類糞便樣本進行宏基因組測序。

1.4分類分析 基于MetaPhlAn3版本3.0.5預測不同分類等級的菌群相對豐度。根據(jù)Shannon指數(shù)估算菌群豐富度和分布(α-多樣性)?；谥脫Q多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)法進行主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA),測定白癜風患者和對照組間的成分差異(β-多樣性)。生物特異性基因分布到KEGG和KEGG Orthologys(KO)。利用通路分類的MetaCyc層次結(jié)構(gòu),將每個樣本的宏基因組基于注釋重構(gòu)為代謝通路,分析腸道微生物代謝功能變化。

1.5統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用R軟件(v4.0.2)進行分析,采用Wilcoxon秩和檢驗分析組間差異,線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)組間差異菌,LDA值>2.0,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1白癜風患者腸道微生物多樣性 分析α-多樣性代表物種的多少、豐富度和均勻度。Shannon指數(shù)反應(yīng)群落的物種數(shù)量和均勻度,Shannon指數(shù)越大,代表物種多樣性越高。本研究分析顯示,白癜風患者Shannon指數(shù)較健康人降低(圖1a),差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.09,P<0.05)。進一步將白癜風患者按病程分組,發(fā)現(xiàn)病程小于5年的白癜風患者與健康對照組相比,α-多樣性降低(Z=-2.24,P<0.05,圖1b)。β-多樣性代表群落結(jié)構(gòu)的相似性,基于 Bray-Curtis算法的PCoA分析顯示兩組差異無統(tǒng)計學意義(PEMANOVA,P=0.4541),見圖1c。

Note:Compared with healthy controls,*P<0.05. α-diversity was decreased in patients with vitiligo; The Shannon index in<5 years goup was lower than healthy controls; PCoA score plot based on Bray-Curtis圖1 白癜風患者腸道菌群的多樣性分析Fig.1 Analysis of intestinal microbiota diversities patients with vitiligo

2.2白癜風患者的腸道微生物組成 在屬水平上,豐富度最高的前20種菌屬包括居海事城球桿菌屬(Phocaeicola)、擬桿菌屬(Bacteroides)、巨單胞菌屬(Megamonas)、羅斯拜瑞氏菌屬(Roseburia)、梭桿菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、地中海桿菌屬(Mediterraneibacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、別樣桿菌屬(Alistipes)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、梭菌屬(Clostridium)、厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、戴阿利斯特菌屬(Dialister)、多爾氏菌屬(Dorea)、埃希氏菌屬(Escherichia)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、梭狀鏈桿菌屬(Fusicatenibacter)、毛螺菌屬(Lachnospira)(圖2)。白癜風患者中擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、多爾氏菌屬(Dorea)和布勞特氏菌屬(Blautia)(Z=-2.09,P<0.05)相對豐度較健康人群低。

圖2 白癜風患者腸道菌群的分類學組成Fig.2 Taxonomy composition of the intestinal flora in patients with vitiligo

2.3白癜風患者和健康對照的差異微生物 與健康對照組相比,11種菌屬相對豐度在白癜風組降低(圖3a),包括阿里松氏菌屬(Allisonella)(Z=-2.91,P<0.01)、伊格爾茲氏菌科(Eggerthellaceae)(Z=-2.88,P<0.01)、霍爾德曼穆爾菌屬(Holdemanella)(Z=-2.58,P<0.05)、粗桿菌屬(Raoultibacter)(Z=-2.40,P<0.05)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)(Z=-2.17,P<0.05)、棲白蟻菌屬(Isoptericola)(Z=-2.08,P<0.05)、特呂佩爾氏菌屬(Trueperella)(Z=-2.06,P<0.05)、糞樣單胞菌屬(Faecalimonas)(Z=2.04,P<0.05)、幼嬰糞桿菌屬(Coprobacter)(Z=-2.63,P<0.01)、布勞特氏菌屬(Blautia)(Z=-2.09,P<0.05)、Neobittarella(Z=-2.24,P<0.05)。其中霍爾德曼穆爾菌屬(Holdemanella)和特呂佩爾氏菌屬(Trueperella)在白癜風患者中缺如。念珠菌-糖鏈菌(Candidatus-Saccharibacteria)(Z=2.01,P<0.05)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)(Z=-2.18,P<0.05)、日本醫(yī)學研究開發(fā)署桿菌屬(Amedibacillus)(Z=2.25,P<0.05)、座便單胞菌屬(Sellimonas)(Z=2.00,P<0.05)相對豐度在白癜風組明顯增加(圖3a)。

Note:Compared with healthy controls,*P<0.05,**P<0.01. Wilcoxon test; LEfSe圖3 白癜風患者與健康對照腸道菌群差異菌分析Fig.3 Differences of the intestinal flora between vitiligo patients and healthy controls

LEfSe分析差異菌結(jié)果顯示(圖3b),念珠菌-糖鏈菌(Candidatus-Saccharibacteria)(LDA=2.54,P<0.05)在白癜風組富集。阿里松氏菌屬(Allisonella)(LDA=2.70,P<0.05)、特呂佩爾氏菌屬(Trueperella)(LDA=2.51,P<0.05)、幼嬰糞桿菌屬(Coprobacter)(LDA=2.26,P<0.05)、伊格爾茲氏菌科(Eggerthellaceae)(LDA=2.45,P<0.05)、棲白蟻菌屬(Isoptericola)(LDA=2.05,P<0.05)等在對照組富集。

2.4腸道微生物基因功能和代謝途徑 分析KEGG及KO分析提示白癜風患者中顯著富集的功能包括(圖4):NOD樣受體信號通路(Z=3.56,P<0.01)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Z=2.80,P<0.01)和嘌呤霉素生物合成(Z=2.34,P<0.05)。而在健康對照組中最豐富的功能是倍半萜和三萜生物合成(Z=-2.78,P<0.05)、吲哚二萜生物堿生物合成(Z=-2.58,P<0.05)、萜類主干生物合成(Z=-2.49,P<0.05)和n-聚糖生物合成(Z=-2.47,P<0.05)。

圖4 白癜風患者腸道菌群的基因功能分析Fig.4 Analysis of the intestinal flora gene functions in patients with vitiligo

代謝模塊分析腺苷甲硫氨酸合成和谷氨酸降解在兩組間差異有統(tǒng)計學意義;較對照組,白癜風組腺苷甲硫氨酸合成(Z=-2.47,P<0.05)和谷氨酸降解(Z=-2.24,P<0.05)通路水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(圖5a～5b)。

3 討論

腸道微生物在物質(zhì)代謝、能量吸收及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[6]。腸道微生物參與了多種皮膚相關(guān)疾病的發(fā)生,例如斑禿[7]、銀屑病[8]、特異性皮炎[9]等。腸道菌群在白癜風中的作用近來受到高度關(guān)注,目前已有的研究全部基于16sRNA擴增子測序技術(shù)。本研究采用的宏基因組測序技術(shù)可直接對DNA分子進行序列測定,獲取樣本中所有微生物的基因組信息,從而分析微生物的組成、功能特點和代謝特征。

本研究發(fā)現(xiàn)與健康對照相比,白癜風患者腸道菌群的α-多樣性降低,這與Bzioueche等[10]的研究一致,但與Ni等[11]的研究結(jié)果相反。進一步亞組分析,發(fā)現(xiàn)病程小于5年的白癜風患者腸道菌群α-多樣性顯著降低,提示腸道菌群伴隨白癜風發(fā)病多樣性顯著降低;病程的延長可能會導致腸道菌群在白癜風和正常對照組的腸道菌群趨于一致。本研究發(fā)現(xiàn)β-多樣性在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義,這與Bzioueche等[10]的研究結(jié)果一致;但Ni等[11]的研究發(fā)現(xiàn)主成分1(principal component analysis 1,PCA1)貢獻最大,達到24.53%,提示白癜風患者腸道群落結(jié)構(gòu)有差異。白癜風患者中豐度降低的腸道微生物包括產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)的多種菌屬,如擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)和梭菌屬(Clostridium)等[12]。SCFAs在維持腸道黏膜屏障的完整性和通透性中發(fā)揮重要作用。同樣豐度降低的菌屬譬如霍爾德曼穆爾菌屬(Holdemanella)可通過代謝低聚果糖產(chǎn)生長鏈脂肪酸發(fā)揮抗炎作用[13]。阿里松氏菌屬(Allisonella)可代謝產(chǎn)生組胺[14],組胺可抑制腸道微生物異位,促進腸黏膜修復。本研究發(fā)現(xiàn)上述菌屬與腸道屏障功能及具有腸道抗炎功能的腸道微生物相對豐度降低,提示腸道屏障功能破壞可能與白癜風發(fā)病相關(guān)。補充維持腸道屏障功能的益生菌可能有益于白癜風的輔助治療。

本研究結(jié)果顯示白癜風患者中4個菌屬腸道微生物相對豐度升高。既往研究提示這些菌屬可能與抑郁等精神疾病相關(guān):座便單胞菌屬(Sellimonas)在重度抑郁癥者腸道中高度富集[15]。巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)的相對豐度在便秘孤獨癥組中高于非便秘孤獨癥組[16]。一項大規(guī)模人群的隊列研究發(fā)現(xiàn)白癜風與抑郁癥高度相關(guān)[17]。本研究提示腸道菌群可能與白癜風患者的精神癥狀如抑郁表型高度相關(guān),其具體機制有待研究。LEfSe結(jié)果顯示,念珠菌-糖鏈菌(Candidatus-Saccharibacteria)在白癜風組富集。念珠菌-糖鏈菌是一種寄生菌,屬于糖細菌(TM7)分類中的一種, 可通過Ⅳ型菌毛可識別并附著于其細菌宿主[18]。TM7被檢測為健康人類口腔、胃、皮膚和腸道微生物群落的共生成員,在炎癥環(huán)境中相對活躍[19],提示炎癥也可能是白癜風的病理因素之一。

不同于16sRNA測序技術(shù),宏基因組學技術(shù)可以分析腸道細菌基因功能。KEGG分析顯示白癜風患者中NOD樣受體信號通路豐富。核定位富亮氨酸重復序列蛋白1 (nuclear localization leucine-rich-repeat protein 1,NLRP1)是NOD樣受體家族的成員。編碼NLRP1的核定位NLRP1基因的多態(tài)性與白癜風高度相關(guān)[20]。核定位富含亮氨酸重復序列蛋白3(nuclear localization leucine-rich-repeat protein 3,NLRP3)炎癥小體的NOD樣受體家族表達于角質(zhì)形成細胞。氧化應(yīng)激誘導角質(zhì)形成細胞中NLRP3炎癥小體激活可促進皮膚T細胞免疫反應(yīng),參與白癜風的發(fā)生[21]。由于NOD樣蛋白家族成員數(shù)量眾多,作為先天免疫調(diào)節(jié)因子的NOD樣受體成員可能成為研究白癜風發(fā)病機制的潛在靶點。

代謝模塊分析顯示白癜風患者腸道菌群甲硫氨酸合成和谷氨酸代謝通路水平降低。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸可通過降低細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平從而發(fā)揮抗炎作用。Marzabani等[23]對白癜風患者血清氨基酸代謝研究發(fā)現(xiàn)白癜風患者血清谷氨酸水平升高,認為谷氨酸是疾病進展的潛在生物標志物。谷氨酸通過線粒體膜運輸還原劑,通過蘋果酸/天冬氨酸穿梭調(diào)節(jié)糖酵解和細胞氧化還原狀態(tài)[24]。氧化應(yīng)激是白癜風發(fā)病的重要誘因之一,由此筆者推測腸道菌群代謝物可能通過影響全身氧化應(yīng)激狀態(tài)促進白癜風的病理進程。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)白癜風患者腸道微生物多樣性降低,微生物的相對豐度及菌群基因功能和代謝功能均發(fā)生改變。本研究為白癜風的發(fā)病機制研究及潛在治療策略提供重要的理論依據(jù)。