莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸對C57BL/6小鼠及SCF轉(zhuǎn)基因小鼠模擬白癜風(fēng)的作用

姜兆婷,張甲,王琪,賀晨卉,劉昕,周鈺奇,王博,堅哲

白癜風(fēng)是一種常見的表皮/黏膜黑素細(xì)胞丟失引起的色素脫失性皮膚病,其具體機制尚不明確,缺乏理想的動物模型制約著白癜風(fēng)研究。目前建立的動物模型主要包括轉(zhuǎn)基因小鼠模型、自身免疫誘導(dǎo)的小鼠模型和化學(xué)試劑誘導(dǎo)的小鼠模型等。其中,以莫諾苯宗為代表的化學(xué)試劑誘導(dǎo)的白癜風(fēng)樣小鼠模型具有造模周期短、組織病理學(xué)特征與人白癜風(fēng)相似度高等優(yōu)點,逐漸受到研究者們的青睞。莫諾苯宗是臨床常用的脫色劑,可引起接觸部位及遠(yuǎn)處非接觸部位色素脫失[1]。Zhu等[2]以莫諾苯宗誘導(dǎo)構(gòu)建的白癜風(fēng)樣小鼠模型,其涂抹與非涂抹部位可見毛發(fā)黑素含量減少及CD8+T細(xì)胞浸潤,與人白癜風(fēng)具有一定的相似性。然而,C57BL/6小鼠黑素細(xì)胞主要存在于毛囊中,表皮中并無黑素細(xì)胞分布,因此尚不能完全模擬人白癜風(fēng)的發(fā)病特點,此外該模型誘導(dǎo)時間長,停止涂藥后白毛復(fù)色較快,極大限制了此種模型的應(yīng)用。

維甲酸是一種維生素A的衍生物,可作為弱效脫色劑使用[3]。Kasraee 等[4]研究表明,莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸應(yīng)用于豚鼠10 d,涂抹部位即可出現(xiàn)脫色,黑素細(xì)胞數(shù)量也顯著減少。因此,本研究分析對比了40% 莫諾苯宗聯(lián)合0.1%維甲酸乳膏對C57BL/6和 SCF轉(zhuǎn)基因小鼠的脫色效果及脫色部位的病理特點。

1 材料與方法

1.1實驗動物 C57BL/6小鼠6周,雌性,購買于空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心,SCF轉(zhuǎn)基因小鼠6周,雌性,購買于美國杰克遜實驗室。

1.2主要儀器和試劑 莫諾苯宗(麥克林公司);乳膏基質(zhì)(廣州博新);DMSO(Sigma公司,美國);0.1% 維甲酸(迪維);黑色素染色試劑盒(貝索企業(yè));大鼠抗小鼠CD8(Abcam公司);兔抗小鼠CD49b(Abcam公司);兔抗小鼠DCT(Abcam公司);小鼠抗小鼠8-OHdG(Sata Cruz Biotechnology);激光共聚焦顯微鏡(美國蔡司公司);病理切片機(德國萊卡公司);HE全自動染色機(德國萊卡公司);倒置光學(xué)顯微鏡(德國萊卡公司);數(shù)字病理切片掃描儀(德國萊卡公司)。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組 C57BL/6小鼠15只,隨機分為三組,分別為對照組(Control)3只,莫諾苯宗組(MBEH)6只,莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸組(MBEH+RA)6只;SCF轉(zhuǎn)基因小鼠15只,分組同上。

1.3.2造模 小鼠背部取約2 cm×2 cm皮膚備皮,對照組除備皮外不予任何處理,莫諾苯宗組涂抹40%莫諾苯宗乳膏50 mg,聯(lián)合組涂抹40%莫諾苯宗乳膏50 mg、0.1%維甲酸乳膏20 mg,3 d 1次,共涂抹30 d。

1.3.3皮膚脫色觀察及評估 于3、7、14、21、28 d肉眼觀察小鼠毛發(fā)、皮膚顏色變化并拍照,進(jìn)行積分記錄。將小鼠脫色部位分為用藥部位和非用藥部位,每個部位總分5分。脫色面積評分標(biāo)準(zhǔn)為:0分為無脫色;1分為脫色面積0～10%;2分為脫色面積11%～25%;3分脫色面積26%～50%;4分為脫色面積51%～75%;5分為脫色面積76%～100%[2]。

1.3.4組織病理 于背部白斑明顯時(C57BL/6小鼠第14天,SCF轉(zhuǎn)基因小鼠第10天)取皮膚,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片后分別進(jìn)行HE染色,免疫組織化學(xué)染色,黑色素染色,免疫熒光染色。HE染色:脫蠟水化,蘇木素伊紅染色,中性樹脂封片;免疫組織化學(xué)染色:切片進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù),一抗為CD8(1∶200)、CD49b(1∶500),二抗為山羊抗兔/大鼠IgG-HRP,DAB顯色樹膠封片;黑色素染色:切片脫蠟,分別進(jìn)行硫酸亞鐵、鐵氰化鉀醋酸液、Van Gieson染色處理,樹膠封片;以上切片使用數(shù)字病理切片掃描儀對切片進(jìn)行掃描及數(shù)據(jù)分析。免疫熒光染色:切片脫蠟及抗原修復(fù),一抗(CD8 1∶200;DCT 1∶1 000;NK 1∶500;8-OHdG 1∶50),相應(yīng)的熒光二抗(1∶400)避光孵育,含Hoechest的封片劑封片,通過激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

2 結(jié)果

2.1莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可有效誘導(dǎo)兩種小鼠皮膚脫色 聯(lián)合組C57BL/6小鼠涂抹部位第7天可見毛發(fā)根部變白,14 d涂抹部位出現(xiàn)明顯白毛,非涂抹部位可見少許白毛,第21天與第30天僅觀察到少量白毛,考慮可能是此時小鼠未處于毛發(fā)生長期,毛發(fā)未完全長出,莫諾苯宗組涂抹部位第9天出現(xiàn)白毛,脫色發(fā)生時間較聯(lián)合組晚(t=3.13,P<0.01)。聯(lián)合組與莫諾苯宗組均于第25天開始復(fù)色(表1～2),有新生黑色毛發(fā)長出,兩組復(fù)色開始時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.11,P=0.29)。聯(lián)合組SCF小鼠涂抹部位第3天即出現(xiàn)白斑,非涂抹部位可見少許白斑,第14天白斑最為顯著,可見白毛;莫諾苯宗組涂抹部位第9天開始出現(xiàn)白毛,脫色發(fā)生時間較聯(lián)合組晚(t=7.93,P<0.000 1)。聯(lián)合組第14天開始復(fù)色,莫諾苯宗組第13天開始復(fù)色(表1～2),兩組復(fù)色開始時間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.86,P=0.41),見圖1。

The skin depigmentation of mice; The extent of monobenzone induced depigmentation on C57BL/6 mice; The extent of monobenzone combined with retinoic acid induced depigmentation on C57BL/6 mice; The extent of monobenzone induced depigmentation on SCF transgenic mice; The extent of monobenzone combined with retinoic acid induced depigmentation on SCF transgenic mice圖1 莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸對C57BL/6小鼠和SCF轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚脫色情況Fig.1 The skin depigmentation of monobenzone combined with retinoic acid on C57BL/6 mice and SCF mine

表1 兩種小鼠用藥部位出現(xiàn)脫色的時間比較Tab.1 Comparison of the depigmentation time in the two mice strains

表2 兩種小鼠用藥部位出現(xiàn)復(fù)色的時間比較Tab.2 Comparison of the repigmentation time in the two mice strains

2.2白癜風(fēng)樣小鼠脫色部位黑素細(xì)胞及黑素含量顯著減少 C57BL/6小鼠對照組及聯(lián)合組表皮均未見DCT+細(xì)胞,考慮可能是其背部皮膚中黑素細(xì)胞含量極少所致;SCF轉(zhuǎn)基因鼠對照組白斑處表皮層可見大量DCT+黑素細(xì)胞,聯(lián)合組表皮DCT+細(xì)胞數(shù)量顯著減少,提示黑素細(xì)胞丟失(圖2a)。黑色素染色結(jié)果顯示,聯(lián)合組SCF鼠表皮黑素含量較對照組顯著減少,聯(lián)合組C57BL/6小鼠毛囊中黑素含量較對照組顯著減少,提示毛囊黑素細(xì)胞丟失(圖2b)。以上結(jié)果表明,莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞丟失,從而導(dǎo)致皮膚脫色。

Immunofluorescence staining of DCT (×200); Melanin staining (×400)圖2 脫色部位黑素細(xì)胞和黑素減少Fig.2 Melanocyte and melanin reduced in the depigmentation site

2.3白癜風(fēng)樣小鼠脫色部位可見CD8+T細(xì)胞浸潤 HE染色結(jié)果顯示,聯(lián)合組C57BL/6與SCF小鼠脫色部位真皮淺層可見少至中量淋巴細(xì)胞浸潤,而對照組未見浸潤(圖3a)。免疫熒光與免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步表明,聯(lián)合組C57BL/6與SCF脫色部位表皮基底層與真皮淺層可見CD8+T細(xì)胞浸潤,而對照組未見浸潤(圖3b～c)。結(jié)果表明,莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可通過誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞浸潤增多,從而殺傷黑素細(xì)胞,導(dǎo)致皮膚脫色。

HE staining (×400); Immunofluorescence staining of CD8 (×200); Immunohistochemistry staining of CD8 (×400)圖3 脫色部位可見CD8+T細(xì)胞浸潤Fig.3 CD8+T cell infiltration at the depigmentation site

2.4白癜風(fēng)樣小鼠脫色部位可見NK細(xì)胞浸潤 聯(lián)合組C57BL/6與SCF小鼠脫色部位可見少量CD49b+的NK細(xì)胞浸潤(圖4a～b),主要分布在真皮淺層及中層,而對照組未見浸潤。綜上,莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可能也可通過誘導(dǎo)NK細(xì)胞誘導(dǎo)皮膚脫色。

Immunofluorescence staining of CD49b (×200); Immunohistochemistry staining of CD49b (×400)圖4 脫色部位可見NK細(xì)胞浸潤Fig.4 NK cell infiltration at the depigmentation site

2.5兩種小鼠脫色部位氧化應(yīng)激水平升高 脫色部位皮膚免疫熒光結(jié)果顯示,聯(lián)合組C57BL/6與SCF小鼠8-OHdG水平顯著高于對照組(圖5),表明莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可誘導(dǎo)小鼠脫色部位氧化應(yīng)激水平增高。

圖5 脫色部位氧化應(yīng)激水平升高 (Immunofluorescence staining of 8-OHdG×200)Fig.5 The oxidative stress level increased at the depigmentation site (Immunofluorescence staining of 8-OHdG×200)

3 討論

莫諾苯宗是一種常用的皮膚脫色劑,長期接觸可引起健康個體罹患白癜風(fēng)[5]。研究表明,莫諾苯宗與酪氨酸酶作用可形成醌-半抗原,一方面誘導(dǎo)黑素小體自噬和酪氨酸酶泛素化,增強黑素細(xì)胞的免疫原性,另一方面激活NLRP3炎癥小體,啟動NK細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng),加速白斑形成;同時,莫諾苯宗還可誘導(dǎo)活性氧生成,促進(jìn)黑素細(xì)胞分泌含有相關(guān)抗原的外泌體,增強局部免疫應(yīng)答;上述過程相互作用激活半抗原特異性CD8+T細(xì)胞對黑素細(xì)胞的殺傷[6-7]。維甲酸可通過損傷黑素細(xì)胞的谷胱甘肽依賴性防御機制[8]、降低黑色素生成活性[9],增加黑素細(xì)胞對莫諾苯宗的敏感性,增強莫諾苯宗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和脫色作用,發(fā)揮協(xié)同脫色效果。本研究發(fā)現(xiàn),莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸應(yīng)用于C57BL/6小鼠,涂藥部位在1周左右即出現(xiàn)白毛,非涂藥部位2周左右出現(xiàn)白毛,組織病理顯示表皮輕度增生,毛囊色素顯著減少,這與Zhu等[2]單獨使用莫諾苯宗構(gòu)建的白癜風(fēng)樣小鼠模型相比,造模時間進(jìn)一步縮短。表皮富含黑素細(xì)胞的SCF轉(zhuǎn)基因鼠在涂藥3天即可見到明顯的皮膚脫色,組織病理顯示表皮輕度增生,黑素細(xì)胞數(shù)目及表皮黑色素含量顯著較少,但是該模型需要不斷涂藥維持,否則易出現(xiàn)復(fù)色。

CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的黑素細(xì)胞殺傷是白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵效應(yīng)環(huán)節(jié)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn),莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸應(yīng)用于C57BL/6及SCF轉(zhuǎn)基因小鼠,真皮淺層均可見CD8+T細(xì)胞浸潤,與人類白癜風(fēng)皮損處CD8+T細(xì)胞浸潤特點一致,符合人類白癜風(fēng)的免疫反應(yīng)過程。Tulic等[12]研究顯示,白癜風(fēng)患者血清中NK細(xì)胞增加,通過分泌IFN-γ啟動CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn),在C57BL/6及SCF轉(zhuǎn)基因小鼠中聯(lián)合應(yīng)用莫諾苯宗和維甲酸,皮損局部真皮淺層可見較多NK細(xì)胞浸潤,這與van den Boorn等[13]報道一致,提示莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可啟動NK細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。

氧化應(yīng)激是白癜風(fēng)發(fā)生和建立持續(xù)自身免疫反應(yīng)的主要原因之一[10, 14]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),非節(jié)段型白癜風(fēng)患者血清中DNA氧化損傷副產(chǎn)物8-OHdG水平高于健康對照,血清中8-OHdG水平與疾病活動性和嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。在本研究發(fā)現(xiàn)莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸涂抹小鼠背部后,局部8-OHdG水平顯著升高,表明莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可增加皮膚局部的氧化應(yīng)激水平,進(jìn)一步激活自身免疫反應(yīng)。

綜上所述,本研究證明莫諾苯宗聯(lián)合維甲酸可在兩種小鼠中誘導(dǎo)脫色反應(yīng)。這種脫色作用主要通過誘發(fā)局部氧化應(yīng)激,激活NK細(xì)胞,進(jìn)一步活化CD8+T細(xì)胞,介導(dǎo)黑素細(xì)胞損傷而實現(xiàn)。由于野生型C57BL/6小鼠黑素細(xì)胞主要存在于毛發(fā)中,皮膚中含量極少,尚不能完全模擬人白癜風(fēng)的發(fā)病特點。因此,基于表皮富含黑素細(xì)胞的SCF轉(zhuǎn)基因鼠構(gòu)建的白癜風(fēng)樣動物模型可作為研究白癜風(fēng)發(fā)病機制、探索治療靶點和評判療效的備選模型。