Shh-BMSCs 外泌體調(diào)控miR-133a對脂多糖誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響*

賈祎佳 陸廷盛 陳啟鸰 楊建文 歐陽北平 楊再松 羅春山

(貴州省骨科醫(yī)院脊柱科,貴州 貴陽 550014)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是脊柱外科最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,致殘率高、破壞性強、恢復(fù)性差,極大損害患者自主生活能力,給其心理及家庭造成沉重負擔(dān)[1-2]。神經(jīng)元死亡及形態(tài)結(jié)構(gòu)受損是引發(fā)SCI患者感覺、運動及自主神經(jīng)功能障礙等的關(guān)鍵因素,缺血缺氧誘發(fā)的神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元形態(tài)損傷及死亡的主要病理機制,減輕神經(jīng)元炎性損傷是SCI后神經(jīng)功能修復(fù)的有效策略[3-4]。音猬因子(Sonic Hedgehog,Shh)是調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育和器官形成的重要因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后具有神經(jīng)保護作用,SCI后鞘內(nèi)注射Shh可通過減輕神經(jīng)炎癥而促使神經(jīng)功能恢復(fù)[5],骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)具有潛在的神經(jīng)保護特性,但直接進行移植存在難以存活、去分化、免疫排斥等風(fēng)險,而其分泌的外泌體作為一種包含多種微小RNA、蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物的囊泡狀小體,在細胞分化、存活、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,BMSCs外泌體及過表達Shh的BMSCs外泌體均可減少神經(jīng)元凋亡,對SCI具有保護作用,且后者作用更強[6]。miR-133a是組織細胞重要的炎性調(diào)節(jié)因子,其家族成員miR-133a-3p可靶向結(jié)合核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)阻斷其控制的炎癥信號,減輕對比劑腎病腎組織炎癥損傷[7],過度表達miR-133a-3可減輕脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活,降低促炎細胞因子表達[8],還可減少慢性縮窄性損傷大鼠炎癥因子產(chǎn)生,抑制脊髓神經(jīng)炎癥,改善大鼠神經(jīng)病理性疼痛[9],miR-133作為進化上保守的微小RNA,對其進行敲除時Shh表達廣泛下調(diào),激活Shh信號可挽救miR-133敲除導(dǎo)致的胚胎肌生成受損[10],推測miR-133a和Shh之間可能互相調(diào)控對方表達,Shh-BMSCs 外泌體可能通過調(diào)控miR-133a促使SCI后功能恢復(fù)。本文以LPS處理大鼠脊髓神經(jīng)元構(gòu)建SCI細胞模型,探討Shh-BMSCs 外泌體調(diào)控miR-133a對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠脊髓神經(jīng)元細胞(貨號CP-R144)、大鼠脊髓神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基(貨號CM-R144)、大鼠BMSCs(貨號CP-R131)、大鼠BMSCs完全培養(yǎng)基(貨號CM-R131)-武漢普諾賽生命科技有限公司;CCK-8細胞活力檢測試劑盒(貨號G021-1-2)購自南京建成生物工程研究所有限公司;Shh過表達質(zhì)粒、miR-133a inhibitor、miR-133a inhibitor陰性對照、miR-133a及U6、Shh、GAPDH引物、(FITC/PI雙染法)Annexin V凋亡檢測試劑盒(貨號E606336-0100)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(D731168)、大鼠白細胞介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒(貨號D731007)、大鼠白細胞介素IL-10 ELISA試劑盒(貨號D731011)、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒(貨號B639277)購自上海生工生物工程股份有限公司;兔源抗大鼠Shh抗體(貨號ab19897)、兔源抗大鼠ASC抗體(貨號ab180799)、兔源抗大鼠caspase-1抗體(貨號ab286125)、兔源抗大鼠GAPDH一抗(貨號ab181602)、兔源抗大鼠β-tublin Ⅲ抗體(貨號ab18207)、兔源抗大鼠NLRP3一抗(貨號ab263899)購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555(貨號P0179)-購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。全波長酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司-型號FlexA-200;流式細胞儀購自廣州吉源生物科技有限公司-型號CyFlow Cube8;倒置熒光顯微鏡購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司-型號MF-53N;實時熒光定量PCR儀購自美國美谷分子公司-型號ForeQuant F4/F6;基礎(chǔ)電泳電源、小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽均購自廣州道一科學(xué)技術(shù)有限公司-型號Basic 200、Di PES-5、Di TB-5;化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自森西賽智科技有限公司-型號ChampChemi500等。

1.2 方法

1.2.1 Shh-BMSCs外泌體制備 快速解凍購買的大鼠BMSCs,以其完全培養(yǎng)基于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行復(fù)蘇培養(yǎng),取傳到第3代的BMSCs接種在培養(yǎng)皿中,使用脂質(zhì)體2000并參照其說明書中步驟轉(zhuǎn)染Shh過表達質(zhì)粒,24 h后采用可去除外泌體的MEMα完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)BMSCs,48 h后收集培養(yǎng)基進行超高速離心,分離得到Shh-BMSCs外泌體,將其置于鎳網(wǎng),于室溫下干燥晾干[11]。

1.2.2 LPS和Shh-BMSCs外泌體最佳作用 濃度篩選快速解凍購買的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞,復(fù)蘇培養(yǎng)并傳代后接種在無菌96孔板中,每孔約含有1×104個細胞,培養(yǎng)24 h后分別以0、100、300、500、700、900 μg/mL的LPS處理[12],24 h后采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測各組細胞活力,公式為:細胞活力=(藥物組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%,分析得出IC50值,篩選出LPS最佳作用濃度。以500 μg/mL的LPS處理傳代的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)建立SCI細胞模型,采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測經(jīng)0、20、40、80、120、160 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理[11]24 h后的各組細胞活力,具體方法與上相同。

1.2.3 細胞分組處理及標(biāo)本收集 取傳代的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞接種在無菌的24孔板中,于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后隨機分為對照組、模型組、Shh-BMSCs外泌體組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor陰性對照組、Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組,對照組不做處理,其余各組以500 μg/mL的LPS處理誘導(dǎo)建立SCI細胞模型,同時Shh-BMSCs外泌體組以80 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理,miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor陰性對照組采用脂質(zhì)體2000并參照其說明書中步驟分別轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor及其陰性對照,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組以80 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理同時轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor,24 h收集各組細胞及其培養(yǎng)液。

1.2.4 檢測各組細胞凋亡情況 取1.2.3中收集的各組細胞,以PBS清洗后重懸,混勻后計數(shù),每組取約含5×105個細胞的細胞懸液離心,向細胞沉淀中加入Annexin V凋亡檢測試劑盒中染液,避光條件下做FITC/PI雙染處理,然后以PBS再次清洗細胞后通過流式細胞儀測定分析各組細胞凋亡率。

1.2.5 檢測各組細胞軸突長度 取傳代的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞接種在無菌的24孔板中(每孔中含有細胞載玻片),于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后按照1.2.3中方法進行分組處理24 h,以PBS清洗細胞后分別加入5%牛血清白蛋白、兔源抗大鼠β-tublin Ⅲ抗體溶液進行孵育,以PBS漂洗后加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的抗兔二抗孵育做免疫熒光染色,以PBS再次漂洗后,取出各組細胞爬片滴加抗熒光淬滅劑后封片,參照免疫熒光染色試劑盒說明指導(dǎo)于熒光顯微鏡下觀察,神經(jīng)元呈現(xiàn)紅色,任選3個視野拍照,使用Image J軟件中的Neuron J插件對圖像中軸突長度進行定量分析。

1.2.6 測定各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-10釋放水平 取1.2.3中收集的各組細胞培養(yǎng)液,以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,采用ELISA法檢測其中TNF-α、IL-1 β和IL-10水平,具體步驟參照各自ELISA試劑盒說明書中方法進行。

1.2.7 測定各組細胞miR-133a和Shh mRNA表達 取1.2.3中收集的各組細胞,采用Trizol試劑并參照其說明指導(dǎo)提取出各組總RNA,然后采用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒中試劑分別加入各基因引物及總RNA配制反應(yīng)體系,配制方法及反應(yīng)條件設(shè)置參照其試劑盒說明書指導(dǎo)進行,miR-133a選用U6做內(nèi)參,Shh選用GAPDH做內(nèi)參,實驗所得Ct值采用2-ΔΔCt算法做分析得出miR-133a和Shh mRNA表達,引物序列如下:miR-133a上游引物:5′-CTCGAGCT CAAGTAGGGATCCAGCATTGGTATGATAATT-3′,下游引物:5′-AGCGCTGCTCGAGGCAAGCTTT TATTTGATTATAATCAC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGCTGAGAACGGGAAGC-3′,下游引物:5′-CC ATGGTGGTGAAGACGC-3′;Shh上游引物:5′-AA AAGCTGACCCCTTTAGCC-3′,下游引物:5′-GAT GTCGGGGTTGTAATTGC-3′;U6上游引物:5′-GA CACGCAAATTCGTGAAGCG-3′,下游引物:5′-TC CAGTGCAGGGTCCGAG-3′。

1.2.8 檢測各組細胞Shh及NLRP3炎性通路蛋白水平 取1.2.3中收集的各組細胞,采用RIPA裂解液并參照其說明指導(dǎo)提取出各組總蛋白,然后采用改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒測量其濃度,具體方法參照其試劑盒說明書指導(dǎo)進行,根據(jù)測量結(jié)果每組取20 μg總蛋白沸水浴變性、120V恒壓跑電泳、40mA穩(wěn)流濕轉(zhuǎn),獲得按分子量大小分離開的蛋白承載在硝酸纖維膜上,將GAPDH、Shh、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白按照其分子量從膜上裁下,分別孵育3%牛血清白蛋白、均稀釋2000倍的一抗、稀釋1000倍的二抗,封閉后進行抗原抗體反應(yīng),滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯色蛋白條帶,采集其圖像后使用Image J軟件對其灰度進行定量,最后統(tǒng)計后得出各蛋白相對表達。

2 結(jié)果

2.1 LPS和Shh-BMSCs外泌體作用濃度確定 不同濃度LPS均可降低脊髓神經(jīng)元細胞活力(見圖1)。IC50值為(507.76±5.23) μg/mL,選擇接近IC50的500 μg/mL LPS處理脊髓神經(jīng)元細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度LPS對脊髓神經(jīng)元細胞活力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of LPS on the activity of spinal cord neurons注:與0 μg/mL LPS相比,①P<0.05。

不同濃度Shh-BMSCs外泌體均可提升LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞活力,在一定濃度范圍內(nèi),隨Shh-BMSCs外泌體濃度升高而作用增強,在濃度為80 μg/mL時,脊髓神經(jīng)元細胞活力進入平臺期,Shh-BMSCs外泌體對其的提升作用不再增強,因此選擇80 μg/mL Shh-BMSCs外泌體處理LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖2 不同濃度Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞活力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Shh BMSCs exosomes on the activity of spinal cord neurons induced by LPS注:與0 μg/mL Shh-BMSCs外泌體相比,①P<0.05。

2.2 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率降低(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率升高(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3、表1。

表1 各組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率和細胞軸突長度Table1 Apoptosis rate andLength of axons of spinal cord neurons in each group

圖3 流式細胞實驗檢測各組脊髓神經(jīng)元凋亡情況Figure 3 Detection of apoptosis of spinal cord neurons in each group by flow cytometry

2.3 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度降低(P<0.05)。見圖4、表1。

圖4 免疫熒光染色β-tublin Ⅲ檢測各組脊髓神經(jīng)元細胞軸突(1000×)Figure 4 Immunofluorescence staining β-Tublin Ⅲ to detect axons of spinal cord neurons in each group

2.4 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞炎癥因子TNF-α、IL-1 β和IL-10釋放水平的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平明顯升高(均P<0.05),IL-10釋放水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平降低(均P<0.05),IL-10釋放水平升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平升高(均P<0.05),IL-10釋放水平降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β和IL-10釋放水平均無明顯變化(均P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平升高(P<0.05),IL-10釋放水平降低(均P<0.05)。見表2。

表2 脊髓神經(jīng)元TNF-α、IL-1β和IL-10釋放水平Table 2 TNF-α, IL-1β and IL-10 release levels of spinal cord neurons in each group

2.5 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達均無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA相對表達Figure 5 Relative expression of miR-133a and Shh mRNA in spinal cord neurons of each group注:與對照組相比,①P<0.05;與模型組相比,②P<0.05;與Shh-BMSCs外泌體組相比,③P<0.05。

2.6 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達明顯降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組、Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組分別比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達升高(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達降低(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達升高(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞Shh、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達升高(P<0.05)。見圖6、表3。

表3 各組脊髓神經(jīng)元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關(guān)蛋白相對表達Table 3 Relative expression of Shh and NLRP3 inflammatory signal related protein in spinal cord neurons of each group

圖6 免疫印跡實驗檢測各組脊髓神經(jīng)元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關(guān)蛋白表達Figure 6 Expression of Shh and NLRP3 inflammatory signal related protein in spinal cord neurons of each group detected by Western blot注:A.對照組;B.模型組;C.Shh-BMSCs外泌體組;D.miR-133a inhibitor陰性對照組;E.miR-133a inhibitor陰性對照組;F.Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組。

3 討論

SCI其臨床主要以外科手術(shù)、物理治療、藥物治療等為主,還發(fā)展了基因治療、細胞移植治療等新型治療手法,但患者神經(jīng)功能的恢復(fù)并不理想,截至目前還沒有公認有效的治療手段,其最大的障礙在于神經(jīng)元的死亡和受損形態(tài)難以修復(fù),因而積極探索改善神經(jīng)元凋亡和形態(tài)功能的策略對于SCI患者神經(jīng)功能的修復(fù)意義重大[13-14]。炎癥是造成SCI后神經(jīng)元形態(tài)損傷和變性死亡的主要原因[3-4],因此本文以LPS處理大鼠脊髓神經(jīng)元構(gòu)建SCI細胞模型,結(jié)果顯示,以LPS處理大鼠脊髓神經(jīng)元細胞,可明顯降低其軸突長度及IL-10釋放水平,升高其凋亡率、TNF-α與IL-1 β釋放水平及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達,表明LPS可誘導(dǎo)神經(jīng)元促炎因子TNF-α、IL-1 β過量表達釋放,減少抗炎因子IL-10表達釋放,激活NLRP3炎性信號,造成神經(jīng)元炎癥損傷,導(dǎo)致其軸突受損變短,細胞大量凋亡,揭示SCI細胞模型構(gòu)建成功。

研究[15]顯示進行抗炎治療可增加SCI后神經(jīng)元的數(shù)量并改善其形態(tài),修復(fù)SCI大鼠運動功能,Shh可調(diào)控炎癥介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程,Shh可抑制炎癥,顯著減少SCI大鼠神經(jīng)元凋亡,進而修復(fù)SCI后神經(jīng)功能[5,16]。BMSCs分泌的外泌體可顯著增加SCI模型大鼠脊髓中Shh表達,修復(fù)脊髓神經(jīng)損傷,且BMSCs外泌體過表達Shh時對SCI修復(fù)效果更好[6],而在Shh沉默的大鼠中,BMSCs外泌體在SCI修復(fù)中基本完全無效[17]。本文研究結(jié)果表明,Shh-BMSCs外泌體可上調(diào)脊髓神經(jīng)元中Shh表達,促進抗炎因子表達,減少促炎因子產(chǎn)生,抑制NLRP3炎性信號激活,減輕神經(jīng)元炎癥損傷,修復(fù)神經(jīng)元軸突形態(tài),緩解LPS誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞凋亡,揭示Shh-BMSCs外泌體具有明顯的神經(jīng)保護作用。

miR-133a作為重要的炎性調(diào)節(jié)因子,可通過靶向下調(diào)NLRP3表達,抑制其炎性小體生成及其介導(dǎo)的促炎反應(yīng)和細胞熱下垂,降低炎性因子表達,減輕炎癥性細胞死亡,緩解腎組織、主動脈及心肌炎癥損傷[7,18-19]。研究[10]表明miR-133敲除時Shh表達廣泛下調(diào),激活Shh信號可逆轉(zhuǎn)敲除miR-133導(dǎo)致的細胞增殖、外基質(zhì)沉積和上皮化受損,由此可知miR-133a和Shh之間可能對對方表達有互相調(diào)控作用,但Shh-BMSCs 外泌體是否可調(diào)控miR-133a的表達,進而介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡,目前還不清楚。本研究結(jié)果顯示,Shh-BMSCs外泌體處理LPS誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元后,神經(jīng)元中miR-133a表達升高,以miR-133a inhibitor處理LPS誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元可加重神經(jīng)元炎性損傷,進一步增強其凋亡,表明miR-133a介導(dǎo)Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的抑制過程;以Shh-BMSCs外泌體和miR-133a inhibitor聯(lián)合處理LPS誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞,相比Shh-BMSCs外泌體單獨處理,可降低神經(jīng)元細胞軸突長度、IL-10釋放水平、Shh mRNA及蛋白表達,升高其凋亡率及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達,表明下調(diào)miR-133a表達可減弱Shh-BMSCs外泌體對NLRP3炎性信號的下調(diào)及炎癥反應(yīng)的抑制,拮抗其對神經(jīng)元形態(tài)的改善及凋亡的減輕作用,最終逆轉(zhuǎn)Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元的保護作用,揭示Shh-BMSCs 外泌體減輕LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡是通過上調(diào)miR-133a實現(xiàn)的。

4 結(jié)論

Shh-BMSCs外泌體可通過促進miR-133a表達而阻斷NLRP3炎性途徑傳導(dǎo),進而降低LPS誘導(dǎo)的促炎因子表達釋放,減輕脊髓神經(jīng)元細胞炎癥,阻止其發(fā)生凋亡,改善其軸突結(jié)構(gòu)損傷,最終起到明顯神經(jīng)保護作用。實驗結(jié)果為SCI后神經(jīng)元損傷修復(fù)提供了新的手法選擇,有利于SCI患者神經(jīng)功能恢復(fù)方法的改進與發(fā)展。