中醫(yī)心病濕證證候客觀化的研究現(xiàn)狀

蔡 靜,曾巧煌,歐曉敏,江 巍,3,呂渭輝,3,藍濤華,3

辨證論治在診斷、治療心血管疾病,改善生活質(zhì)量,維持心功能,降低再住院率方面有一定的優(yōu)勢。中醫(yī)證候客觀化是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進程中遇到的問題,將病證結(jié)合動物模型應用于中醫(yī)藥研究,從形態(tài)、功能等多方面闡述中醫(yī)藥治療的效果與原理,揭示中醫(yī)證候的本質(zhì)。因此建立一套既符合中醫(yī)辨證理論,又具有穩(wěn)定性、針對性及客觀性的病證結(jié)合動物模型的評價體系,以期為中醫(yī)心病濕證動物模型的構(gòu)建及中醫(yī)心病濕證研究提供思路,最終達到為臨床服務的目的。 為深入探討中醫(yī)藥在心血管疾病領(lǐng)域的作用機制,病證結(jié)合動物模型的構(gòu)建及客觀化評價是前提,建立及評價中醫(yī)心病濕證證候客觀化是研究關(guān)鍵?？偨Y(jié)歸納中醫(yī)心病濕證的微觀診斷指標、證候定量診斷、與他證的鑒別診斷等,探索心病濕證候的本質(zhì)及穩(wěn)定可靠的生物模型,可為中醫(yī)藥客觀化現(xiàn)代化研究提供依據(jù)。綜述冠心病、高血壓、心力衰竭3個心血管常見疾病探討中醫(yī)心病濕證的客觀化進展。

1 中醫(yī)心系疾病與濕邪

心系疾病病因病機復雜,歷代醫(yī)家對心系疾病病因病機及治療進行了探索。古代醫(yī)家早已意識到濕邪在心系疾病中的重要作用,《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中指出胸痹心痛的病機為“陽微陰弦”,陽微為本,為胸陽不足,陰弦為標,指陰寒痰濕偏盛?！稖夭l辨》中提到胸痹心痛的病機為“肺水克心”,“肺水”指外來濕邪,“克心”指克制心火,即病機為外濕抑制胸陽,胸陽不振發(fā)為胸痹心痛?！稘健ん@悸怔忡健忘門》中亦有“風寒冷濕閉塞諸經(jīng),令人怔忡”的記載?，F(xiàn)代發(fā)現(xiàn),六淫之濕具有病因、病理的雙重意義,濕邪作為致病物質(zhì)或致病條件,是物質(zhì)性、條件性與某些人體反應性的綜合概念,六淫致病的臨床表現(xiàn)包含了體質(zhì)、病種、致病因素等的綜合作用[1]。

從濕論治、從脾論治心系疾病的方式方法及相關(guān)中藥方劑療效顯著?！督饏T要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中記載了通陽化濕代表方劑栝蔞薤白半夏湯、枳實薤白桂枝湯、茯苓杏仁甘草湯;調(diào)脾胃以化濕代表方劑橘皮枳實生姜湯、人參湯及溫腎化濕的薏苡附子散等?！短交菝窈蛣┚址健酚涊d二陳湯通過化濕理脾治療痰濕所致的心悸。王守富等[2]從痰濕論治冠心病心絞痛,結(jié)果顯示,六君子湯或參苓白術(shù)散加減、逍遙散合半夏厚樸湯加減、理中丸合二陳湯、參附湯、冠心Ⅱ號合瓜蔞薤白半夏湯或《壽世保元雙合湯》加減、小陷胸湯合溫膽湯加減等補氣、行氣、溫陽、活血、清熱化痰之法。由此可見,在心系疾病病因病機及治療方式的探索中,濕邪致病、從濕論治及濕證證候客觀化是中醫(yī)心系疾病研究的關(guān)鍵。

2 中醫(yī)心系疾病濕證證候客觀化的研究現(xiàn)狀

證候是中醫(yī)治療的核心,準確辨出濕證是“對證下藥”的前提,“異病同治”關(guān)鍵在于對證的準確把握。中醫(yī)理論的辨證具有多樣性,證與證之間既交叉又獨立,準確評價濕證尤為重要。

2.1 濕證的生物學模型及客觀指標 系統(tǒng)生物學的不斷發(fā)展為中醫(yī)病證結(jié)合研究帶來了新思路和技術(shù)手段,中醫(yī)傳統(tǒng)理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學研究方法從組織、分子、免疫等方面探討中醫(yī)心病濕證的客觀化發(fā)展。其中生物學模型的構(gòu)建與科學評價、生物標志物研究尤其重要,且因臨床上濕證辨證多樣,濕證動物模型的造模方法復雜,現(xiàn)模擬臨床病因病機建立的濕證病證結(jié)合動物模型進行分析、歸納和總結(jié)。

2.1.1 單因素造模 李蓉[3]將昆明小鼠置于人工氣候箱中飼養(yǎng),其余時間按常規(guī)室溫飼養(yǎng),連續(xù)觀察7 d;模型組小鼠出現(xiàn)體重下降、腸道菌群失調(diào)、小腸炎性反應、組織結(jié)構(gòu)紊亂、水液代謝障礙、免疫系統(tǒng)紊亂等多方面改變,符合外感寒濕致病的病理表現(xiàn)。章敏[4]將Wistar大鼠置于人工氣候箱中飼養(yǎng),每日刺激8 h,持續(xù)觀察30 d;觀察到腸道菌群數(shù)量隨著濕度升高而增加,如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、軍團桿菌、大腸桿菌及真菌數(shù)量;同時,具有致病性的大腸桿菌數(shù)量增加,對機體有益的雙歧桿菌減少;出現(xiàn)機體免疫功能紊亂、胃腸激素失調(diào)、胃泌素減少,大鼠腎臟水通道蛋白2(AQP2)mRNA減少的情況。

2.1.2 復合因素造模 將復合因素造模法模擬臨床濕證病因病機的動物模型進行分析、歸納和總結(jié)。

2.1.2.1 濕熱證生物模型的評價指標 程方平等[5]采用新西蘭兔和Wistar大鼠造模,人工氣候箱模擬外濕,每次灌服54 °白酒5 mL+油脂10 mL/(2 kg·d)模擬內(nèi)濕,灌服大腸桿菌模擬客邪,造濕溫病模型;可見高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)增高。譚永振[6]采用SD大鼠構(gòu)造濕偏重組與熱偏重組模型,可見大鼠尿液中AQP2、p物質(zhì)(SP)70升高,胃竇勻漿胃竇SP及生長抑素(SS)含量降低,同時胃、十二指腸病理切片顯示,胃黏膜層有大量中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤,血管擴張充血,胃黏膜下層可見組織水腫,中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤明顯,十二指腸可見絨毛上皮細胞脫落、大量炎性細胞滲出。有研究使用人工氣候箱建立正常、濕和濕熱3種不同溫度和濕度的環(huán)境,結(jié)果顯示,飼養(yǎng)在濕熱環(huán)境中的小鼠接觸流感病毒時表現(xiàn)出免疫耐受性,身體無法有效清除病毒,導致持續(xù)感染,說明溫暖、潮濕的環(huán)境可能干擾了免疫反應和平衡[7]。有研究顯示,高濕、高溫環(huán)境導致體內(nèi)炎性細胞因子表達升高,造成Th17/Treg免疫失衡,抑制Treg成熟和分化,增加白細胞介素(IL)-2、IL-6等細胞因子表達,降低γ干擾素(IFN-γ)和IL-17A表達[8]。王婷等[9]將BALB/c小鼠置于人工氣候箱中模擬濕熱環(huán)境,灌胃致脾虛;腹腔注射脂多糖(LPS)工作液完成濕熱模型造模,結(jié)果顯示,INF-γ、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平均出現(xiàn)升高;濕熱模型腸道菌群含量出現(xiàn)不同程度增加;以脾陽虛為內(nèi)濕基礎(chǔ)的濕熱證,雙歧桿菌屬、乳桿菌屬含量減少,濕邪困擾為內(nèi)濕基礎(chǔ)的濕熱證雙歧桿菌屬、乳桿菌屬含量增多。

2.1.2.2 脾虛濕困生物模型的評價指標 朱壽光[10]強迫SD大鼠游泳15 min后灌胃液態(tài)豬油,灌蜂蜜模擬內(nèi)濕模型;胃泌素水平和胃壁黏液量下降,胃腸推進運動明顯減弱,小腸推進出現(xiàn)斷續(xù)現(xiàn)象,全血5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚醋酸(5-HIAA)含量及血清Na+-K+-三磷酸腺苷(ATP)酶降低。趙麗等[11]單日施加豬油脂,雙日上午在跑步機上跑步約30 min,以汗出喘息為止,下午喂飼甘藍進行造模;結(jié)果顯示,丙二醛和CD指標升高,過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)下降,上述物質(zhì)可能作為客觀評價指標。劉偉[12]將SD大鼠置于人工氣候箱中模擬外濕條件,給予單日禁食聯(lián)合4 ℃冰水灌胃,雙日給予充足飼料并給予豬油灌胃+4 cm水深,控制睡眠8 h造濕證模型;結(jié)果顯示,脾虛濕困大鼠臟器系數(shù)增加,血清電解質(zhì)水平紊亂,代謝異常,胰島素水平下降;脾臟及胸腺臟器系數(shù)降低,胸腺皮質(zhì)厚度及脾臟中央動脈淋巴鞘直徑、面積變小,血清IL-6升高,IgG含量減少;運用反證藥物平胃散治療該模型說明大鼠脾虛濕困造模成功。有研究顯示,利用8周的時間建立60只高脂飲食和力竭游泳的脾虛水濕證Wistar大鼠模型,貢獻基因主要集中在Fabp、SLC和AQP家族,即蛋白質(zhì)和多糖的組成對脾虛水濕證模型大鼠水液轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)作用顯著[13]。

2.1.3 濕證證候組學研究 系統(tǒng)生物學的研究方法與中醫(yī)整體概念的理論內(nèi)涵相似,為中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學提供了重要方法。通過代謝、蛋白、基因、轉(zhuǎn)錄等方面,探討證候的生物學基礎(chǔ),為證候的可分離性提供了生物學依據(jù)。將SD大鼠置于人工氣候箱模擬的高溫高濕環(huán)境中,除正常飲食外,濕阻證大鼠每日給予蜂蜜、豬油;采用濕阻證大鼠臟器組織等蛋白的半定量實時熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)測定熱休克蛋白,說明高溫高濕環(huán)境為濕熱證而非暑濕證;同時結(jié)果顯示,濕證大鼠腎、脾、胃組織中ATP儲存量減少,提示氧化應激、膜完整性、黑色素生物合成、離子通道活性和ATP代謝可能是濕證的標志[14-15]。臨床研究顯示,嚴格按照《治療血脂異常的中藥新藥臨床研究指導原則》篩選脾腎陽虛證與痰濕阻滯證病人,比較臨床指標總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、HDL-C,并與健康對照組相比,脾腎陽虛血脂異常病人和痰濕阻滯證血脂異常病人,差異有統(tǒng)計學意義;脾腎陽虛血脂異常病人、痰濕阻滯證血脂異常病人與健康對照組、痰濕阻滯證與脾腎陽虛血脂異常病人氨基酸代謝、脂代謝、碳水化合物代謝比較,差異有統(tǒng)計學意義;與脾腎陽虛病人相比,痰濕阻滯病人血脂異常代謝途徑不同:①丙酮酸代謝途徑;②甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑;③谷氨酰胺和谷氨酸代謝途徑;④丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑;⑤TG代謝途徑[13]。

2.2 濕證復合素造模情況(見表1)

表1 濕證復合素造模情況

3 中醫(yī)心系疾病濕證證候的研究現(xiàn)狀

病的概念反映了某一種疾病全過程的總體屬性、特征和規(guī)律;證是疾病過程中某一階段的病理概括,包括病變的部位、原因、性質(zhì)、正邪關(guān)系,因而證較癥狀可全面、深刻、準確地揭示疾病的本質(zhì)。病與證均能反映疾病的本質(zhì),病證結(jié)合的內(nèi)涵既體現(xiàn)在中醫(yī)現(xiàn)代化的進程。現(xiàn)代醫(yī)學的飛速發(fā)展使人們對疾病微觀探索掌握更加明確,病證結(jié)合將促進中西醫(yī)結(jié)合。中醫(yī)心系疾病濕證證候客觀化現(xiàn)狀見表2。

表2 中醫(yī)心系疾病濕證證候客觀化現(xiàn)狀

3.1 冠心病 有研究顯示,冠心病在不同地區(qū)病性要素占比不同,南方、北方、西北地區(qū)頻數(shù)居前3位的病性要素為血瘀、氣虛、痰濁,且近20年冠心病的常見證候依次為血瘀、氣虛、痰濁,與現(xiàn)代臨床對冠心病“本虛標實”的認知[17]基本一致。冠心病濕證客觀化臨床研究主要從“辨證”即診斷客觀化與“論治”即療效評價客觀化著手。

3.1.1 冠心病濕證客觀化的臨床研究 曲淼[18]研究顯示,氣滯痰阻證多在冠心病發(fā)作期,在冠心病痰阻心脈證臨床診斷方面除四診合參外,一些實驗檢測指標如RDW、HDL-C水平降低,hs-CRP、TC、TG、LDL-C水平升高可作為冠心病中醫(yī)辨證的客觀參考[19]。楊一格[20]從冠心病痰證病人AGEs出發(fā),發(fā)現(xiàn)病人血清AGEs及AGEs受體(RAGE)水平增加,相關(guān)基因RAGE mRNA和Fox1 mRNA表達水平更高;冠心病痰濁內(nèi)阻證病人從濕辨治發(fā)現(xiàn),治療組心絞痛癥狀、中醫(yī)證候療效、心電圖療效及血液流變學改善的總有效率高于對照組。朱璞玉等[21]研究發(fā)現(xiàn),冠心病痰證病人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-糖胺聚糖(GAG)通路可能是痰病變的特征信息,其中TGF-β1與生痰因子相關(guān),而GAG和蛋白聚糖(versican)可能為“痰”的物質(zhì)基礎(chǔ)。何浩強[22]研究顯示,冠心病穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互結(jié)證病人存在代謝組學差異表達,其通路與生物功能和氨基酸代謝、甘油磷脂代謝和類固醇激素生物合成相關(guān);多組學聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)趨化因子8(CXCL8)、CCL2、集落刺激因子-1(CSF1)、Serpin家族D成員1(SERPIND1)可作為生物標志物,提示免疫反應是冠心病穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互結(jié)證發(fā)生發(fā)展的生物學基礎(chǔ)之一。朱明丹等[23-24]通過血漿代謝組學發(fā)現(xiàn),冠心病痰濁阻滯證與能量代謝、脂質(zhì)代謝、糖代謝、氨基酸代謝紊亂密切相關(guān),其生物標志物可能是葡萄糖、花生四烯酸、亞油酸等代謝產(chǎn)物。張紅栓[25]研究冠心病痰濁證與血瘀證的區(qū)別,其中痰濁證病人尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸等含量較高,膽汁酸、組氨酸含量較低。張秀梅[26]對比痰濕瘀阻型及非痰濕瘀阻型冠心病病人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因多態(tài)性分布,結(jié)果顯示,痰濕瘀阻型DD基因型及D等位基因分布頻率高,可能是冠心病中醫(yī)辨證分型的基礎(chǔ)物質(zhì)。

3.1.2 冠心病濕證客觀化的基礎(chǔ)研究 高杉等[27-29]分別對Wistar雄性大鼠及載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立冠心病痰瘀互結(jié)證模型并進行評價,采用高脂飼料聯(lián)合結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立模型;使用心肌酶指標、血流變指標、血小板聚集指標評價模型;將模型用于發(fā)病機制的探討,結(jié)果顯示,大鼠心肌細胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和Bcl-2蛋白下調(diào),促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白上調(diào),激活PI3K/Akt通路,促進細胞凋亡。繼高脂喂養(yǎng)小型豬結(jié)合冠狀動脈球囊損傷左冠狀動脈前降支建立病證結(jié)合模型研究之后,有研究進行了方證分析,比較方證不相應的生脈膠囊,與痰瘀互結(jié)證對證的丹蔞片,結(jié)果顯示,丹蔞片可降低血脂代謝,縮小心肌梗死面積,降低主癥和兼癥評分等[30]。除對生物標志物分析外,方證相應可能對證候客觀化診斷、模型評價亦有一定的說服力。

3.2 心力衰竭濕證診斷的客觀化 Zhou等[31]收集了208例心力衰竭住院病人的臨床資料,總結(jié)中醫(yī)證候特點,結(jié)果顯示,痰濁證LVEF檢出率為50%,水濕阻滯組NT-proBNP較高。從證型分布與心功能分級方面分析,Miao等[32]分析134例慢性心力衰竭病人,結(jié)果顯示,中醫(yī)證型以氣虛血瘀型、痰瘀交織型、氣陰虛型、內(nèi)濕熱滯型和陽虛型為主,證型分布與紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級有關(guān)。Shi等[33]通過回顧分析1 036例病人,將慢性心力衰竭的證與NYHA心功能分級聯(lián)系起來,進一步發(fā)現(xiàn)與Ⅰ級、Ⅱ級病人相比,Ⅲ級、Ⅳ級病人陽虛、水濕發(fā)生率較高,痰濁發(fā)生率較低。Li等[34]回顧性分析1 451例慢性心力衰竭病人,結(jié)果顯示,男性病人以痰阻心脈氣虛血瘀證多見,女性病人多見心血瘀阻氣陰虛證。姜坤[35]收集并整理冠心病合并心力衰竭4個臨床階段的中醫(yī)四診信息和實驗室指標,結(jié)果顯示,心力衰竭濕阻氣結(jié)證與室壁瘤呈正相關(guān),與竇性心動過速、白細胞降低、心室容量升高、平板運動耗氧量>20 mL/(min·kg)、實際碳酸氫根<21.3呈負相關(guān)[5]。

3.3 高血壓

3.3.1 高血壓濕證客觀化的臨床研究 有研究顯示,高血壓中醫(yī)辨證分型與動脈血流動力學有關(guān),痰濕內(nèi)阻病人動脈血流動力減慢;痰濕內(nèi)阻大腦中動脈、大腦前動脈血管脈搏指數(shù)高于其他證型[36]。薛文靜[37]研究顯示,原發(fā)性高血壓痰濕壅盛證病變程度與ROCKⅡ、NF-κB p65和ROCKⅡ mRNA呈正相關(guān),且與ROCKⅡ密切相關(guān)。葛明立[38]研究顯示,載脂蛋白ε4等位基因可能與痰濕壅盛證具有一定的相關(guān)性。Zhang等[39]綜合了痰濕綜合征高血壓病人體重變化整合蛋白質(zhì)組學和代謝組學分析,公認的生物標志物磷脂酰膽堿(PC)、補體C3、C4a/C4b、α-2-巨球蛋白(A2M)和抗凝血酶(SERPINF1)是病人體重變化的強有力預測因子。吳天敏等[40]通過比較原發(fā)性高血壓痰濕壅盛型的相關(guān)指標,可見乳酸、絲氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸含量減少,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、LDL-C、丙酮含量增多。李小兵等[41]臨床研究發(fā)現(xiàn),血清sICAM1、sVCAM1在痰濕證病人中特異性升高,二者可作為原發(fā)性高血壓痰濕證辨證的客觀指標之一。

3.3.2 高血壓濕證客觀化的基礎(chǔ)研究 吳賽等[42]使用Wistar大鼠高脂飲食建立痰濕壅盛型高血壓模型,可見痩素可作為評價痰濕壅盛證高血壓大鼠模型的客觀指標之一;腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活和高瘦素血癥在痰濕壅盛型高血壓發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,NF-κB上調(diào)提示著機體的炎癥狀態(tài)聯(lián)合構(gòu)成了本證型的分子基礎(chǔ);本證型的病理機制可能與JAK2/STAT3通路、PI3K/Akt通路及NF-κB通路活化密切相關(guān)。姜凌宇等[43]采用相同的大鼠造模方法予以半夏白術(shù)天麻湯“以方測證”,結(jié)果證實,半夏白術(shù)天麻湯不僅可改善痰濕壅盛型高血壓的臨床癥狀,同時可降低血壓、血脂及改善胰島素抵抗等。姜月華等[44]利用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6Cnc小鼠25周,以體質(zhì)量、血壓均大于等于對照組平均值25%作為判定“痰濕壅盛型高血壓小鼠模型”成功的標準,經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)分析血漿代謝組變化,得出磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿可作為痰濕壅盛型高血壓小鼠模型的特征血漿代謝標志物;并通過京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,差異代謝物主要富集于膽堿代謝、促性腺激素釋放激素信號通路、氨基酸的合成、磷脂酶D信號途徑等及產(chǎn)熱、表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、NF-κB信號通路等。

4 小結(jié)與展望

在中醫(yī)證候方面,目前多模擬病因,恒溫箱的使用模擬外濕、高脂飲食模擬內(nèi)濕,結(jié)合多種力竭方式、禁食方式或藥物、生物致病因子的干預模擬脾虛。在病證結(jié)合模型的評價上,由于中醫(yī)心病濕證與病因、病理、免疫、生化、代謝等密切相關(guān),如何將諸多因素有機結(jié)合確定其證至關(guān)重要。臨床上證的發(fā)展是動態(tài)變化的,因此評價指標也是動態(tài)變化的。從動物模型的選擇、造模時間、飲食飼料的配方、用量用法及濕證動物模型的評價指標依賴于科研、臨床經(jīng)驗甚至是主觀感受。如何將科研、臨床經(jīng)驗整合,形成公認、穩(wěn)定、可重復性高的濕證生物模型建模方法及公認、科學的濕證生物模型的評價體系是今后研究的方向。病證結(jié)合的客觀化研究任重而道遠,為解決這個問題提出以下建議:首先,進一步完善中醫(yī)心病濕證的量化和診斷,建立統(tǒng)一、規(guī)范的診斷標準;其次,建立重復性好、公認的生物模型,找到特異度、靈敏度高的指標進行評價,同時不局限個別指標,從多個指標變化和相互關(guān)系以評價病證結(jié)合模型;最后,從中醫(yī)整體觀與病證結(jié)合的角度進行代謝組學、蛋白質(zhì)組學等的系統(tǒng)生物學研究,對參與疾病發(fā)生過程的信息物質(zhì)相互關(guān)系進行深入探討,揭示中醫(yī)心病濕證的本質(zhì)。