他克莫司激活JAKs/STATs信號通路對川崎病小鼠血管內(nèi)皮功能及心肌細胞凋亡的影響

婁 萍,趙 欣,趙 穎,張 丹

川崎病是一種皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征,并發(fā)癥表現(xiàn)為冠狀動脈和心肌損傷,主要病理改變?yōu)槿矸翘禺愋匝苎?肌原纖維斷裂及溶解,心肌細胞水腫、變性和壞死及炎性浸潤等[1]。相關研究顯示,川崎病可能與炎癥及免疫調(diào)節(jié)失衡有關,由于免疫細胞的過度激活,使產(chǎn)生多種細胞因子介導的促炎與抗炎反應調(diào)節(jié)失衡,增強心臟冠狀動脈損傷[2]。關于川崎病的臨床研究越來越多,但川崎病誘發(fā)心肌損傷的機制尚未明確。他克莫司是一種新型免疫抑制劑,通過與細胞質(zhì)內(nèi)免疫親和蛋白(macrophilin)結(jié)合抑制鈣磷酸酶的活性,并調(diào)控T細胞活化,抑制肥大細胞釋放細胞因子,可治療炎癥性皮膚疾病,目前他克莫司在臨床中廣泛用于器官移植和自身免疫系統(tǒng)疾病的治療[3]。酪氨酸激酶(JAKs)/信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)信號通路是細胞因子信號轉(zhuǎn)導的重要途徑,廣泛分布于多種組織細胞,發(fā)揮特異的生物學作用,在參與機體免疫及腫瘤發(fā)展等過程中發(fā)揮著關鍵的作用[4]。有研究表明,JAKs/STATs信號通路與心臟等疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切,介導了心肌細胞生長、存活,改善心血管疾病[5]。關于他克莫司治療川崎病的研究報道較少。本研究觀察他克莫司通過激活JAKs/STATs信號通路對川崎病小鼠血管內(nèi)皮功能及心肌細胞凋亡的影響,可為臨床治療川崎病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康級小鼠40只,雌雄各半,4～6個月齡,體質(zhì)量150～240 g,購自基爾頓生物科技(上海),嚴格按照《實驗動物管理條例》進行實驗,動物許可證號:SYXK(上):2019-0075,溫度15～18 ℃,濕度約為70%,每日12 h光照,喂養(yǎng)條件為自由攝取標準飼料,飲用干凈自來水。

1.2 實驗試劑與儀器 他克莫司(上海第一生化藥業(yè)有限公司),阿司匹林(廣州天心制藥廠),伊紅液(上海麥克林公司),白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),無水乙醇(桂林中輝科技發(fā)展有限公司),干酪乳酸桿菌菌種(重慶天圣制藥有限公司),心肌肌鈣蛋白I試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)試劑盒(南京建成生物工程研究所),FEITecnai G12型透射電鏡(美國強生公司),切片機(上海醫(yī)用儀器廠),多普勒超聲儀(日本Nikon公司),免疫印跡化學放光底物(北京化學試劑公司)。

1.3 動物模型建立 將干酪乳酸桿菌菌種(LCWE)接種于肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2 d,將培養(yǎng)基以3 000×g(重力加速度),離心30 min后棄上清,沉淀加入50 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS)過夜并裂解,以3 000×g離心裂解液30 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后加RNA酶200 μg/mL混勻,37 ℃孵育2 h,離心棄上清后重復3次,再加入DNA酶200 μg/mL混勻,7 ℃孵育4 h,離心棄上清后重復3次,最后沉淀中加入胰蛋白酶200 μg/mL,37 ℃孵育4 h,離心棄上清后重復3次,以PBS將沉淀重懸,超聲破碎儀冰上破碎2 h后5 ℃,8 000×g離心1 h,上清即為LCWE。采用比色法定量,并將LCWE終濃度稀釋為1 mg/mL后,小鼠腹腔注射5 mg/kg劑量為川崎病建模成功。

1.4 動物分組與給藥 所有小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為正常組、模型組、阿司匹林組、他克莫司組,每組10只小鼠。正常組和模型組采用10 mg/kg羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃,阿司匹林組采用阿司匹林50 mg/kg灌胃,他克莫司組采用他克莫司40 mg/kg灌胃,均每日1次,連續(xù)干預10 d。

1.5 組織提取 每組選取5只小鼠進行眼眶靜脈取血1 mL,于-80 ℃保存,用于生化指標檢測。將小鼠麻醉后,采用脊椎脫臼法處死小鼠后,在無菌條件下迅速剪開皮膚,取出心臟后置于生理鹽水中漂洗,采用5%多聚甲醛溶液進行固定,室溫保存,制作病理切片。

1.6 觀察指標

1.6.1 超聲心動圖檢測小鼠心臟功能 采用200 g/L烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠,備皮仰臥位固定,使用頻率為7.0 MHz的探頭對小鼠進行心臟超聲檢查,首先測量小鼠胸骨旁左心室短軸二維圖像,在乳頭肌水平位將M型取樣線與室間隔-左心室后壁連線垂直,獲得M型超聲心動圖,采用ASE法測量小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD),采用Teich-holtz公式計算左室射血分數(shù)(LVEF),LVEF(%)=[(LVEDD3-LVAWD3)/LVEDD3]×100%,其中LVAWD為左室前壁舒張末期厚度,每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個心動周期的平均值,超聲檢查操作及分析均采用雙盲法。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-6、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 各組小鼠眼眶取靜脈血1 mL后,以3 000 r/min離心15 min,留取上清液,在對應孔板中加入100 μL標準品工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育1 h,去板內(nèi)液體后加入50 μL生物素化抗體工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育1 h,去板內(nèi)液體后沖洗3次,洗滌結(jié)束后每孔加100 μL辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育30 min,取孔板反復沖洗板內(nèi)液體,洗滌結(jié)束后每孔加入100 μL底物溶液,進行37 ℃恒溫孵箱孵育15 min,每孔加入50 μL終止液,200 nm波長處檢測OD值,根據(jù)標準曲線和OD值計算IL-6、TNF-α、VEGF含量。

1.6.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 取小鼠心臟組織樣品后經(jīng)梯度濃度乙醇脫水,再置于二甲苯中透明,之后置入石蠟中包埋。使用切片機將組織切片,切片厚度為3 μm,染色前將石蠟切片置于二甲苯中脫去石蠟,采用10%中性甲醛固定后進行石蠟切片,依次由無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和80%乙醇梯度脫水后再用清水沖洗,在80 ℃烤箱中烘烤15 min后置于蘇木素中染色15 min,清洗后伊紅染色3 min,70 ℃烘箱烤干后用中性樹脂封片。血管組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.6.4 TUNEL檢測小鼠心肌細胞凋亡率 將包埋好的心肌組織石蠟切片用冰凍機進行連續(xù)切片后進行TUNEL染色,嚴格按照試劑盒說明進行操作,將冰凍切片室溫復溫30 min,使用冰丙酮固定5 min,5 ℃ PBS進行沖洗3次,每次5 min,10%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉15 min,加入TUNEL混合液室溫孵育1 h,5 ℃ PBS沖洗3次,每次5 min,熒光染料二脒基苯基吲哚(DAPI)核染1 min,4 ℃ PBS沖洗3次,每次5 min,切片染色后在顯微鏡下觀察,凋亡細胞核呈綠色熒光,采用Image Pro Plus 5.0軟件進行凋亡細胞計數(shù),在500倍顯微鏡下隨機取5個不同的視野,在每個視野中記錄凋亡心肌細胞數(shù)及心肌細胞總數(shù),計算心肌細胞凋亡率,取平均值。

1.6.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達 取小鼠心肌組織50 mg,加入0.15%胰蛋白裂解液,以4 000 r/min離心,10 min后取上清液,血清樣品中加入樣孔進行電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡15 min后PBS反復沖洗,每次5 min,分別加入JAK2(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000),辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶2 000),分別雜交后進行PBS沖洗,以β-actin為內(nèi)參指標,采用顯色劑進行顯色和灰度掃描分析掃描條帶,計算JAK2、STAT3蛋白表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組超聲心動圖改變 正常組小鼠心臟舒張功能正常、無障礙發(fā)生;模型組小鼠出現(xiàn)心臟舒張功能障礙,LVEDD增加,LVEF降低;他克莫司組LVEF有所提升,LVEDD相對減少;阿司匹林組小鼠心臟舒張功能略微緩解,LVEF、LVEDD改善。詳見圖1、表1。

表1 各組超聲心動圖LVEDD、LVEF比較(±s)

圖1 各組超聲心動圖改變

2.2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量比較 與正常組比較,模型組血清TNF-α、IL-6、VEGF含量升高(P<0.05);與模型組比較,他克莫司組血清TNF-α、IL-6、VEGF含量降低(P<0.05);與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量比較(±s) 單位:ng/mL

2.3 心肌組織HE染色 正常組小鼠心肌纖維排列整齊,細胞排列有序緊密,細胞核呈卵圓形,細胞質(zhì)鮮紅;模型組小鼠心肌纖維排列紊亂且心肌組織斷裂和溶解,間質(zhì)纖維化和組織壞死,細胞排列紊亂,出現(xiàn)水腫和壞死等,細胞核大小不均勻并有炎性浸潤;他克莫司組心肌斷裂組織及溶解有所緩解,細胞核排列趨于整齊,分布趨于有序、緊密;阿司匹林組心肌纖維排列紊亂現(xiàn)象有所緩解,部分區(qū)域仍有溶解及斷裂現(xiàn)象。詳見圖2。

圖2 各組心肌組織HE染色圖(×200)

2.4 各組小鼠心肌細胞凋亡率比較 與正常組比較,模型組小鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,他克莫司組小鼠心肌細胞凋亡率降低(P<0.05);與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.05)。詳見圖3、表3。

表3 各組心肌細胞凋亡率比較(±s) 單位:%

2.5 各組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白比較 與正常組比較,模型組心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達降低(P<0.05);與模型組比較,他克莫司組心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達升高(P<0.05);與他克莫司組比較,阿司匹林組心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達降低(P<0.05)。詳見圖4、表4。

表4 各組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白比較(±s)

圖4 各組JAK2、STAT3蛋白表達條帶圖

3 討 論

川崎病是一種免疫介導的急性全身疾病,免疫系統(tǒng)的高度活化和免疫損傷性血管炎是川崎病的特點[6]。他克莫司屬鈣調(diào)蛋白磷酸酶抑制劑,其免疫抑制作用機制與環(huán)孢素A相似,可介導內(nèi)皮功能,并抑制病灶部位新生血管生成[7]。細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細胞死亡,表現(xiàn)為凋亡中信號通路的啟動及相關基因表達的變化。有研究顯示,心肌細胞在某些病理狀態(tài)下發(fā)生凋亡,且細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展受多種基因調(diào)控,與相關信號的激活、轉(zhuǎn)導具有一定相關性[8]。通過超聲表現(xiàn)和組織聲學特性間的相互關系,不僅能測定臟器的大小、運動、結(jié)構(gòu)變化等,同時了解相關病理組織的改變及鑒別功能心肌的逆轉(zhuǎn)、炎性浸潤、纖維化等,在川崎病心肌診斷中具有重要意義[9]。本研究利用實時三維超聲心動圖對川崎病心肌功能的測定發(fā)現(xiàn),正常組小鼠心臟舒張功能正常且無障礙產(chǎn)生,模型組小鼠出現(xiàn)心臟舒張功能障礙,LVEDD增加,LVEF降低,經(jīng)他克莫司處理后的川崎病小鼠LVEF提升,LVEDD減少,經(jīng)阿司匹林處理后小鼠雖然心臟舒張功能略微緩解,LVEF、LVEDD略改善,但相對弱于他克莫司組。表明經(jīng)他克莫司干預后川崎病小鼠的心臟整體功能及局部收縮功能均可改善。

相關研究顯示,TNF-α、IL-6、VEGF等炎性因子在川崎病的發(fā)生發(fā)展、心肌損傷及內(nèi)皮功能中的表達具有重要的作用[10]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平較高;與模型組比較,他克莫司組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平降低;與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平升高,提示他克莫司可降低川崎病小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF表達。川崎病中相關因子通過增加細胞黏附分子表達,誘發(fā)血小板活化分子及IL-6等相關炎性因子釋放,并通過自分泌方式作用于單核巨噬細胞,釋放炎性介質(zhì)加劇炎癥反應,促進炎性細胞在機體內(nèi)黏附、浸潤及中性粒細胞脫顆粒、抗纖溶等,增加內(nèi)皮損傷及動脈粥樣硬化[11]。相關研究顯示,他克莫司通過抑制機體內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸發(fā)揮抗氧化作用,增加動脈血流量,增強心肌收縮功能,改善TNF-α、IL-6等表達,減輕炎癥反應[12]。他克莫司通過下調(diào)近端小管上皮細胞VEGF表達,降低單核細胞的趨化作用,減輕平滑肌細胞增生及血管壁厚度、管腔狹窄、閉塞等引起的心臟供血功能不足,改善川崎病所致的炎細胞浸潤及心肌細胞凋亡[13]。

川崎病引起的心肌細胞凋亡是受多種基因調(diào)控,其中凋亡加速基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2認為與細胞凋亡關系密切[14]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠心肌細胞凋亡率升高;與模型組比較,他克莫司組小鼠心肌細胞凋亡率下降;與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠心肌細胞凋亡率升高,提示他克莫司可減輕川崎病小鼠心肌細胞凋亡。川崎病中Bcl-2基因家族成員可能通過相互競爭形成同型或異型的二聚體調(diào)控線粒體變化,間接調(diào)節(jié)蛋白酶和核酸酶活性,雙向調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡[15]。Bax與相關凋亡基因結(jié)合形成異型二聚體使Bax失活,同時Bcl-2被磷酸化并從二聚體中釋放出來,游離的Bax可形成誘導細胞凋亡的同型二聚體,破壞線粒體膜功能,進而啟動Caspase酶系級聯(lián)反應,從而導致細胞凋亡[16]。有研究顯示,他克莫司具有抗低氧再給氧心肌細胞凋亡作用,其機制可能與清除氧自由基和一氧化氮有關,通過增強細胞凋亡抑制基因Bcl-2水平,可改善心臟收縮和舒張功能,增加冠狀動脈血流量,進而發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡的作用[17]。

JAKs/STATs信號通路是細胞因子信號轉(zhuǎn)導的重要途徑,參與機體的免疫調(diào)節(jié)、細胞活性、腫瘤發(fā)展等[18]。以往研究表明,JAK2、STAT3表達異常引起心肌營養(yǎng)因子和信號轉(zhuǎn)錄激活因子及內(nèi)皮功能改變,提示JAKs/STATs信號通路對川崎病引起的心肌功能發(fā)揮一定的干預作用[19]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達降低;與模型組比較,他克莫司組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達升高;與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達降低,提示他克莫司可提高川崎病小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達。相關研究顯示,STAT通過與酪氨酸相關受體結(jié)合,與JAK及受體上酪氨酸殘基發(fā)生反應,將吸引STAT結(jié)合到受體上,使磷酸化的JAK2、STAT3轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi),抑制川崎病發(fā)生發(fā)展[20]。有研究顯示,他克莫司可能通過多途徑調(diào)節(jié)細胞因子釋放和蛋白表達,減輕川崎病引起的機體不良反應,并介導JAKs/STATs使JAKs磷酸化下游的蛋白轉(zhuǎn)錄合成效應底物,抑制心肌細胞凋亡和促壞死因子[21]。

綜上所述,他克莫司可改善川崎病小鼠心臟功能及內(nèi)皮功能,降低心肌細胞凋亡,其作用機制可能與調(diào)控JAK2/STAT3信號通路有關。本研究存在一定的局限,今后應不斷完善,以期為臨床相關疾病的治療提供實驗依據(jù)。