微流控紙芯片顯色法檢測(cè)圖像處理方法的比對(duì)*

鄭志鴻,夏敏珠,李一冰,張 劍

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,陜西 西安 710021)

1990年Manz等首次報(bào)道提出微全分析系統(tǒng)(Micro totalanalysis system,μTAS),其最大限度地將分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移至便攜設(shè)備或芯片中[1]。微流控紙芯片法(Microfluidic paper-based analytical devices,μPADs)由Whitesides研究小組于2007年首次提出[2],是全微分分析方法的重要分支。該方法用紙張代替了玻璃、硅、高聚物等基底材料,通過(guò)各種加工技術(shù),在紙上加工出具有一定結(jié)構(gòu)的親水或疏水微細(xì)通道網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)分析器件,構(gòu)成了“紙上微型實(shí)驗(yàn)室”(lab-on-paper)[3]。目前,μPADs常用于定量分析,應(yīng)用最廣的為比色法等[4],通常以RGB均值表征顯色強(qiáng)度并將其用于定量分析[5-8]。RGB值是一種工業(yè)色彩模式,其中R、G、B分別代表紅、綠、藍(lán)即光的三原色,每種顏色強(qiáng)度值為0～255。生活中的任何色彩都可以通過(guò)專(zhuān)業(yè)儀器或RGB識(shí)別類(lèi)App直接掃描以獲取對(duì)應(yīng)的一組RGB值[9]。

研究致力于以Gamma灰度值為橋梁構(gòu)建μPADs定量分析新方法,從數(shù)據(jù)處理層面減小紙芯片定量分析誤差。Gamma灰度值是以純黑色為基準(zhǔn)值,某一灰度與之相對(duì)的飽和度,理論為0～255。Gamma灰度值并不局限于表示黑白色組的深淺,任何顏色都可以通過(guò)其RGB值計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的Gamma灰度值,同一顏色深淺可以用Gamma灰度值大小量化[10]。因此,Gamma灰度值也可以用于量化紙芯片分析檢測(cè)中顯色物質(zhì)顏色強(qiáng)度,目前未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):pH=7.2～7.4,廣州和為醫(yī)藥科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB或Ellman試劑):純度≥98%,半胱氨酸(Cys):純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司。

電子天平:ES1035A,天津市德安特傳感技術(shù)有限公司;iPhone XS Max手機(jī):A2104,1200萬(wàn)像素,美國(guó)蘋(píng)果公司;1號(hào)定性濾紙:英國(guó)Whatman公司;噴蠟打印機(jī):Xerox Phaser 8400,美國(guó)富士施樂(lè)集團(tuán)有限公司;熱壓機(jī):G311,福建阿普萊斯電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

研究以人體危險(xiǎn)因子Cys紙芯片分析檢測(cè)為例[11]。Cys與DTNB在紙芯片上反應(yīng),最終顯橙黃色,然后用手機(jī)對(duì)顯色的紙芯片拍照,再進(jìn)一步通過(guò)數(shù)碼測(cè)色器App(Copyright ?2001-2020 Apple lnc.)分析得到對(duì)應(yīng)的RGB值,對(duì)校正后的Gamma灰度值(Gray)計(jì)算見(jiàn)公式(1)。

(1)

式中:R、G、B分別代表紅、綠、藍(lán)的顏色強(qiáng)度。

現(xiàn)有的灰度值計(jì)算方法大都誤差較大,并不能滿足建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的精度要求,因此實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的灰度值經(jīng)過(guò)Gamma校正計(jì)算,精度可滿足建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,是目前最為準(zhǔn)確的灰度值計(jì)算方法[12]。以RGB均值和Gamma灰度值分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于檢測(cè)未知樣品濃度,并分析RGB均值法和灰度值法的優(yōu)劣。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 紙芯片的制作

用Inkscape 0.91App設(shè)計(jì)紙芯片結(jié)構(gòu)圖案,設(shè)計(jì)好的紙芯片用噴蠟打印機(jī)打印在定性濾紙上,然后于176.7 ℃下熱壓2 min,使濾紙表面粘附的蠟加熱熔化后滲入濾紙內(nèi)部,取出后冷卻至室溫。紙芯片設(shè)計(jì)圖見(jiàn)圖1。

圖1 紙芯片設(shè)計(jì)圖

由圖1可知,黑色部分為打印的疏水區(qū)域,白色圓孔直徑為6 mm。濾紙為載體的紙芯片,主要起到分離、吸附和攔截作用[6],使反應(yīng)只能在白色區(qū)域進(jìn)行,保證顯色的均勻性和上樣量的一致性。

1.3.2 溶液配制

精密稱(chēng)取0.060 51 g的Cys,用PBS(pH=7.2～7.4,20 mmol/L)溶解定容至50 mL容量瓶,得10 mmol/L Cys儲(chǔ)備液;用PBS稀釋Cys儲(chǔ)備液分別得0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別用PBS稀釋Cys儲(chǔ)備液至0.45、0.65 mmol/L得到樣品1和樣品2;精密稱(chēng)取0.100 00 g DTNB溶解于約15 mL PBS中,加入ρ(NaOH)=0.001 g/mL溶液調(diào)節(jié)pH=6.81至全溶,再定容至25 mL,得ρ(DTNB)=4 mg/mL溶液。

1.3.3 紙芯片上顯色反應(yīng)及數(shù)據(jù)處理

用移液器依次加載Cys與DTNB各3 μL至圖1紙芯片圓形反應(yīng)區(qū),兩者反應(yīng)2.5 min后手機(jī)拍照記錄結(jié)果;用數(shù)碼測(cè)色計(jì)App識(shí)別并記錄其對(duì)應(yīng)RGB值,每次在顯色區(qū)域中心附近隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)的RGB值。然后分別測(cè)量計(jì)算樣品1和2的RGB均值和Gamma灰度值,利用對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品1和2的濃度。樣品1和2各測(cè)量5次,分別取平均值作為最終測(cè)量濃度,并計(jì)算其絕對(duì)誤差、相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

RGB值和Gamma灰度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

c/(mmol·L-1)

由圖2可知,RGB均值法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=82.333x+27.06,R2=0.998 6,線性范圍為0.3～1 mmol/L;Gamma灰度值法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=77.976x+22.402,R2=0.999 4,線性范圍為0.2～1 mmol/L。運(yùn)用Gamma灰度值法量化紙芯片的顯色強(qiáng)度,線性關(guān)系優(yōu)于RGB均值法,R2增大了0.08%,線性范圍增加了14.29%。另外Gamma灰度值法從數(shù)據(jù)處理層面減小了微流控紙芯片定量分析的實(shí)驗(yàn)誤差。兩者均具有上樣量小,靈敏度高的特點(diǎn),且使用過(guò)程中無(wú)需大型儀器[13-15]。

2.2 誤差與分析

樣品1和2的實(shí)際濃度分別為0.45、0.65 mmol/L,測(cè)定誤差與偏差見(jiàn)表1。

表1 2種方法的誤差與精密度數(shù)據(jù)1)

由表1可知,其中樣品1為低濃度樣品,Gamma灰度值法和RGB均值法RSD均偏大,是由于溶劑打濕紙芯片后使背景值增加過(guò)大,且手機(jī)攝像頭采集精度有限,因此低濃度樣品顯色較淺時(shí),精密度會(huì)有所下降。

3 結(jié) 論

RGB均值法數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單,誤差較Gamma灰度值法稍大。Gamma灰度值法較為復(fù)雜,但線性關(guān)系更好,在實(shí)際應(yīng)用中均能滿足要求,可根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。2種方法均基于紙芯片的定量分析,具有上樣量小、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、便攜度高等諸多優(yōu)勢(shì)。使用過(guò)程中無(wú)需大型儀器,對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)速度快,具有較好的應(yīng)用前景。