不同產(chǎn)地野菊花的質(zhì)量分析

匡秀華,姜亞潔,2,張彩燕,3,谷亞慧,張 琪,樊克鋒,李利紅

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院,河南 鄭州 450046; 2.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北 邯鄲 056038; 3.江蘇沙鋼集團(tuán)有限公司,江蘇 張家港 215625)

野菊花是菊科植物野菊的頭狀花序。野菊花味苦、辛、微寒,歸肝、心經(jīng),具有清熱解毒、瀉火平肝的功效[1]?，F(xiàn)代藥理和中藥歸經(jīng)理論的研究表明,野菊花中主要含有黃酮類(如槲皮素、木犀草素、蒙花苷等)、揮發(fā)油、多糖等成分,具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化活性等作用[2-5]?！吨腥A人民共和國獸藥典》(2020版)[1]和《中華人民共和國藥典》(2020版)[6]均收錄了野菊花,表明了其較高的藥用價(jià)值。

隨著我國施行“獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)”,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的第194號 “退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種”公告。2013年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2038號公告將野菊花作為天然植物飼料原料收錄于《天然植物飼料原料目錄》,2018年我國頒布了《天然植物飼料原料通用要求國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 19424—2018)》[7]文件,中獸藥在臨床養(yǎng)殖中的應(yīng)用受到重視。野菊花作為天然植物飼料原料,其開發(fā)和利用也備受關(guān)注。但野菊花產(chǎn)地廣泛,質(zhì)量參差不齊,進(jìn)行野菊的質(zhì)量分析和鑒別工作是當(dāng)前的迫切需求。本試驗(yàn)從野菊花的外觀與性狀、顯微鑒別與薄層鑒別、水分、總灰分與酸不溶性灰分、蒙花苷含量測定等方面進(jìn)行分析,為天然植物飼料原料的質(zhì)控方法提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

分析天平(BSA224S- CW,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);生物顯微鏡(BX43,奧林巴斯(中國)有限公司);薄層色譜成像系統(tǒng)(GoodLook-1000,上海科哲生化科技有限公司);高效液相色譜儀(Ultimate-300,賽默飛世爾科技有限公司);野菊花對照藥材(AP80511,中國食品藥品檢定研究院);蒙花苷對照品(B20860-20 mg,中國食品藥品檢定研究院。)

按照北京中獸藥聯(lián)盟制定的《天然植物飼料原料團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定樣品規(guī)范》,征集13批次不同產(chǎn)地天然植物飼料原料野菊花,經(jīng)中獸藥教研室鑒定為正品。野菊花樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 13批野菊花樣品來源信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外觀與性狀

依照《天然植物飼料原料通用要求國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 19424—2018)》[7]的要求,從形狀、大小、表面、斷面、氣味等方面進(jìn)行觀察,同時(shí)要求藥材和飲片外觀不得有蟲蛀、發(fā)霉、其他物質(zhì)污染等異?，F(xiàn)象。

1.2.2 顯微鑒別與薄層鑒別

參照2020版《中華人民共和國獸藥典》[1]進(jìn)行顯微鑒別。參照2020版《中華人民共和國藥典》[6]進(jìn)行薄層鑒別。

1.2.3 水分

參照GB/T 6435《飼料中水分的測定》[8],采用直接干燥法測定樣品水分。

1.2.4 總灰分與酸不溶性灰分

參照2020版《中華人民共和國獸藥典》[1]進(jìn)行操作和檢測。

1.2.5 蒙花苷含量測定

參照2020版《中華人民共和國獸藥典》[1],采用高效液相色譜法(HPLC)測定蒙花苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地野菊花的外觀與性狀

不同產(chǎn)地的13批野菊花樣品粉碎前(圖1)與粉碎后(圖2)的外觀性狀差異較大。圖1為13批樣品粉碎前,形狀為類球型舌狀花,各樣品無明顯差異。質(zhì)地干燥易碎?；ò鸀辄S色至棕黃色,皺縮卷曲;有4～5個(gè)苞片,外苞片呈長條形,外表面有白毛。內(nèi)苞片橢圓形、無毛,芽底有殘梗。直徑約0.3～1 cm,3、6、11、13號樣品直徑較大,約0.5～1 cm,其余樣品直徑約0.3～0.5 cm。斷面有明顯紋理及光澤度。氣味芳香、略帶苦味。眼觀3、6、10、11、13號樣品有較多雜質(zhì)。所有樣品粉碎前無蟲蛀、無發(fā)霉、無污染。圖2為13批樣品粉碎后,黃棕色和黃白色,雖不同產(chǎn)地有明顯的外觀、色澤差異,但外觀、色澤與2020版《中國藥典》和2020版《中國獸藥典》要求基本一致。

圖1 不同產(chǎn)地13批野菊花樣品粉碎前外觀與性狀

圖2 不同產(chǎn)地13批野菊花樣品粉碎后外觀與性狀

2.2 不同產(chǎn)地野菊花的顯微鑒別

粉碎后的13批野菊花樣品顯微特征如下:花粉粒呈黃色、類球形,直徑20～33 μm(圖3A)。腺毛頭部鞋底形,4～8個(gè)細(xì)胞,兩面相對排列(圖3B)。T型毛很多,但大部分已斷。臂一長一短,是單細(xì)胞。壁稍厚或一側(cè)稍厚,密集分布在莖、莖葉表面(圖3C)。分泌道含黃色分泌物,直徑9～34 μm,周圍有一組導(dǎo)管,多見于花柱中部(花柱分叉以下)、藥隔中心和苞片(圖3D)。

2.3 不同產(chǎn)地野菊花薄層鑒別

蒙花苷對照品在紫外光燈(365 nm)下檢視出現(xiàn)一個(gè)點(diǎn)(圖4),1～13號野菊花樣品中,3、6、10、13號樣品在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上顯示的熒光斑點(diǎn)顏色較淡,11號樣品無熒光斑點(diǎn);其中4號樣品在展開時(shí),斑點(diǎn)擴(kuò)散,樣品3號受影響。

RM:蒙花苷對照品、RCD:野菊花對照藥材、1～13:13批不同產(chǎn)地的野菊花樣品圖4 不同產(chǎn)地野菊花樣品薄層圖譜

2.4 不同產(chǎn)地野菊花的水分測定

經(jīng)檢測可得(表2),13批不同產(chǎn)地野菊花樣品水分范圍在8.2%～10.7%,平均值為9.7%,其中6號樣品水分最大,12號樣品水分最小;以GB/T 6435《飼料中水分的測定》為標(biāo)準(zhǔn),13批樣品中6號和10號樣品水分超過10%。

表2 不同產(chǎn)地野菊花的水分檢測 %

2.5 不同產(chǎn)地野菊花的總灰分與酸不溶性灰分檢測

經(jīng)檢測(表3),13批不同產(chǎn)地野菊花樣品的總灰分范圍6.78%～8.90%,平均值為7.95%,其中1號最小,13號最大;酸不溶性灰分范圍0.27%～1.98%,平均值為0.96%,其中7號最小,11號最大。

表3 野菊花總灰分與酸不溶性灰分檢測結(jié)果 %

2.6 不同產(chǎn)地野菊花蒙花苷含量檢測

由圖5可知,蒙花苷對照品的保留時(shí)間約為13.3 min,13批樣品中有11批樣品在保留時(shí)間上出現(xiàn)蒙花苷的特征性峰(圖6)。

圖5 蒙花苷對照品HPLC圖譜

圖6 13批野菊花樣品HPLC疊圖

由表4可以看出13批樣品蒙花苷含量范圍為0.000%～2.1492%,平均值為0.9424%。13批樣品中有7批樣品蒙花苷含量超過0.80%,3、6、8、10、11、13號樣品的蒙花苷含量未超過0.80%,其中3號、11號樣品未檢測到蒙花苷。

表4 不同產(chǎn)地野菊花樣品中蒙花苷含量檢測 %

3 討論

本試驗(yàn)對不同產(chǎn)地的13批野菊花樣品進(jìn)行質(zhì)量分析,結(jié)果顯示,所有樣品的外觀與性狀與《中華人民共和國獸藥典》(2020版)標(biāo)準(zhǔn)基本一致。13批不同產(chǎn)地野菊花大小、顏色存在差異,可能受地域、海拔等多方面因素影響。自然條件下,植物生長發(fā)育、器官形成及次生代謝產(chǎn)物積累與生態(tài)因子密切相關(guān)[9]。野生菊花在海拔18 m～1083 m內(nèi)皆有分布,但植株形態(tài)差異較大[10],產(chǎn)區(qū)集中分布在大別山、伏牛山和秦嶺南部山脈的低海拔山區(qū),不同產(chǎn)地及海拔的自然環(huán)境的野菊花化學(xué)成分含量差異較大[11]。

蒙花苷的薄層鑒別過程中,因《中華人民共和國獸藥典》中使用的展開劑部分成分毒性較大,借鑒和采用《中華人民共和國藥典》中用乙酸丁酯-甲酸-水(2∶1∶1)的上層溶液為展開劑。研究表明,點(diǎn)樣量為1～5 μL時(shí)顯色效果較好,斑點(diǎn)清晰可見[12]。而本試驗(yàn)中,點(diǎn)樣量需增加至21 μL時(shí)熒光斑點(diǎn)清晰、易于觀察。因此,蒙花苷的薄層鑒別中點(diǎn)樣量需因樣品不同而調(diào)整。

毛佩芝[13]運(yùn)用烘干法測定144批野菊花水分含量范圍為7.41%～15.9%。本試驗(yàn)中13批野菊花樣品的水分范圍在8.2%～10.7%,平均值為9.7%,與其檢測結(jié)果相一致。此外,有研究報(bào)道52批野菊花的總灰分含量范圍為6.38%～8.00%,平均含量為7.23%,酸不溶性灰分含量為0.72%～1.76%,平均含量為1.22%[14]。本試驗(yàn)中13批不同產(chǎn)地野菊花樣品的總灰分含量范圍6.78%～8.90%,平均值為7.95%;酸不溶性灰分含量范圍0.27%～1.98%,平均值為0.96%,與文獻(xiàn)報(bào)道略有差異,可能是由于樣品批次較少,樣品產(chǎn)地不同及樣品品種差異等。

李浩文等[15]采用流動(dòng)相為0.05%磷酸溶液-乙腈,波長為334 nm,測得不同批次野菊花中蒙花苷含量范圍為0.417%～1.507%。武秀麗等[16]采用流動(dòng)相為乙腈-0. 02% 磷酸溶液,檢測波長為326 nm,檢測到39批次野生野菊花中蒙花苷的含量為0～15.40 mg/g。許雷等[17]以甲醇-水-冰醋酸(26:23:1)為流動(dòng)相,檢測波長為334 nm,檢測到50個(gè)野菊花樣品中蒙花苷含量在0～3.83%,合格率為56%。本試驗(yàn)中采用的流動(dòng)相和檢測波長同2020版《中國獸藥典》,測得13批野菊花樣品中蒙花苷平均含量為0～2.15%,與文獻(xiàn)報(bào)道類似。此外,在檢測蒙花苷的過程中,在水相中加入少量的磷酸,可以改善峰形,減少拖尾等問題;若同時(shí)升高柱溫、降低體積流量可以使相鄰色譜峰分離更好[18]。

2020版《中國獸藥典》和《中國藥典》中,以蒙花苷為定量定性的標(biāo)志物。對39批次野生野菊花按照2020版《中國藥典》進(jìn)行檢測,其中有9份樣品未檢測到蒙花苷[16]。本試驗(yàn)中也有2批樣品未檢測到蒙花苷,但用HPLC指紋圖譜法對29批野菊花樣品進(jìn)行檢測,檢測出綠原酸、咖啡酸和蒙花苷等7個(gè)化合物[19]。這提示,僅以蒙花苷含量來判定野菊花質(zhì)量不夠全面。運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析和Pearson相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)蒙花苷含量受年均氣溫、年均降水量、緯度與海拔等影響[20]。因此,建立合理、有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是評價(jià)野菊花作為天然植物飼料原料的重要前提之一。