氟中毒對(duì)肉雞促紅細(xì)胞生成素和紅細(xì)胞膜ATP酶的影響

劉玲玲,李德印,李先芳,沈永恕,張 磊

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院,河南 鄭州 450046)

氟是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一,在自然環(huán)境中廣泛存在,具有蓄積毒性,對(duì)動(dòng)物的危害主要表現(xiàn)在其對(duì)機(jī)體的多器官、多系統(tǒng)性損傷等,能造成多種機(jī)能和形態(tài)的異常改變[1,2]。近年來(lái),人畜氟中毒的報(bào)道日益增多,氟污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到當(dāng)?shù)匦笄莺腿祟惖慕】礫3]。大量研究表明,氟中毒會(huì)引起機(jī)體發(fā)生貧血[4,5],能夠顯著降低肉仔雞血細(xì)胞數(shù)、血清溶菌酶和補(bǔ)體C3、C4含量[6]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)作為調(diào)控紅細(xì)胞生成的重要糖蛋白激素,在抵抗外界因素對(duì)動(dòng)物機(jī)體紅細(xì)胞的損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7,8],目前有關(guān)氟中毒對(duì)肉雞EPO含量的影響尚未見(jiàn)報(bào)道,本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建肉雞氟中毒模型,觀察氟中毒對(duì)肉雞的血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響,探討氟中毒對(duì)肉雞紅細(xì)胞的毒性以及EPO在其致肉雞貧血中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

1日齡健康薩索肉雞購(gòu)自鄭州雪霞農(nóng)業(yè)科技有限公司;分析純氟化鈉(NaF)購(gòu)自于Sigma公司;煌焦油藍(lán)染液、Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒、Na+-K+-ATPase試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所;EPO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)ADL公司;全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀購(gòu)自深圳邁瑞醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方案

選取240只1日齡健康薩索肉雞,試驗(yàn)方法參考黃俊祥等[6]方法進(jìn)行,隨機(jī)分為4組,每組60只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧(F,11 mg/kg,以實(shí)際氟含量計(jì),下同),試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量的NaF:高氟1組(F,300 mg/kg)、高氟2組(F,600 mg/kg)、高氟3組(F,900 mg/kg),常規(guī)雛雞飼養(yǎng)管理,自由采食與飲水,分別于試驗(yàn)第14天、28天和42天進(jìn)行心臟采血用于檢測(cè)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血液中血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)等指標(biāo)。

1.3.2 網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)

心臟采血后,取一滴全血加入含有煌焦油藍(lán)染液的玻片上,混勻,室溫靜置5～10 min。取適量的混勻液制備血涂片,置于油鏡下觀察。選取紅細(xì)胞分布均勻且染色質(zhì)量較好的部分進(jìn)行計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)每1000個(gè)紅細(xì)胞中網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)目。

1.3.3 紅細(xì)胞膜的ATP酶活性檢測(cè)

采用無(wú)機(jī)磷比色法進(jìn)行紅細(xì)胞膜的ATP酶活性檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,分別檢測(cè)紅細(xì)胞膜的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性。

1.3.4 紅細(xì)胞滲透脆性的檢測(cè)

采用濃度梯度法測(cè)定紅細(xì)胞對(duì)不同濃度的低滲氯化鈉溶血的抵抗力,即紅細(xì)胞滲透脆性。取30 μL肝素抗凝血,分別加入到不同濃度(0.65%、0.60%、0.55%、0.50%、0.45%、0.40%、0.35%、0.30%、0.25%)的低滲氯化鈉溶液試管中,室溫靜置2 h后,于分光光度計(jì)510 nm波長(zhǎng)處比色,與完全溶血管進(jìn)行比較,計(jì)算溶血度。溶血的判定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)溶血的判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 促紅細(xì)胞生成素(EPO)含量的檢測(cè)

分離血清后,參考EPO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,將酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm,該條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度(OD)值,標(biāo)準(zhǔn)品濃度及OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中EPO的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件One way-ANOVA分析比較各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性,并用LSD法進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟中毒后血液學(xué)指標(biāo)的變化

如表2所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)第14天時(shí)高氟1組Hb升高,無(wú)顯著差異(P>0.05),HCT、MCV和MCHC降低,無(wú)顯著差異(P>0.05),MCH顯著降低(P<0.05);高氟2組HCT和MCHC顯著降低(P<0.05),MCV無(wú)顯著差異(P>0.05),Hb和MCH極顯著降低(P<0.01)。試驗(yàn)第28天和42天,除高氟2組在28天時(shí)MCV與對(duì)照組相比,無(wú)顯著降低(P>0.05)外,高氟1組和高氟2組其余血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01);試驗(yàn)期間,試驗(yàn)組血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比極顯著降低(P<0.01)。

表2 氟中毒后血液學(xué)指標(biāo)的變化

2.2 氟中毒后血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的變化

如表3所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)第14天時(shí)高氟1組血液網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05),高氟2組和高氟3組血液網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)降低,差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01);試驗(yàn)第28天和42天,各試驗(yàn)組血液網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比顯著或極顯著降低(P<0.01)。

表3 氟中毒后血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的變化 %

2.3 氟中毒后紅細(xì)胞膜ATP酶活性的變化

如表4所示,整個(gè)試驗(yàn)期間,與對(duì)照組相比,高氟1組紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性顯著降低(P<0.05),高氟2組和高氟3組紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性顯著降低(P<0.01)。

表4 氟中毒后紅細(xì)胞膜ATP酶活性的變化 U/mL

試驗(yàn)第14天,與對(duì)照組相比,高氟1組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低,無(wú)顯著差異(P>0.05),高氟2組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05),高氟3組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.01)。試驗(yàn)第28天,高氟1組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05),高氟2組和高氟3組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.01);試驗(yàn)第42天,各試驗(yàn)組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低(P<0.05)。

2.4 氟中毒后紅細(xì)胞滲透脆性的變化

如表5所示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)第14天,高氟1組紅細(xì)胞滲透脆性無(wú)顯著升高(P>0.05),高氟2組紅細(xì)胞滲透脆性顯著升高(P<0.05),高氟3組紅細(xì)胞滲透脆性顯著升高(P<0.01)。試驗(yàn)第28天,與對(duì)照組相比,高氟1組紅細(xì)胞滲透脆性顯著升高(P<0.05),高氟2組和高氟3組紅細(xì)胞滲透脆性顯著升高(P<0.01);試驗(yàn)第42天,各試驗(yàn)組紅細(xì)胞滲透脆性與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)。

表5 氟中毒后紅細(xì)胞滲透脆性的變化 g/L

2.5 氟中毒后促紅細(xì)胞生成素(EPO)含量的變化

如表6所示,試驗(yàn)第14天,與對(duì)照組相比,高氟1組血清EPO含量顯著升高(P<0.05),高氟2組和高氟3組血清EPO含量顯著降低(P<0.05或P<0.01);試驗(yàn)第28天和42天,各試驗(yàn)組血清EPO含量顯著降低(P<0.01)。

表6 氟中毒后促紅細(xì)胞生成素(EPO)含量的變化 mIU/mL

3 討論

研究證實(shí),氟在體內(nèi)的蓄積是引起機(jī)體代謝性貧血的原因之一[9,10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,氟中毒導(dǎo)致Hb含量顯著降低,結(jié)合王美玲等[11]報(bào)道的氟中毒會(huì)導(dǎo)致肉雞血液紅細(xì)胞數(shù)目的降低,表明氟中毒會(huì)引起肉雞發(fā)生貧血。高氟1組在染毒后第14天時(shí),引起肉雞血液紅細(xì)胞數(shù)目和網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目的上升,推測(cè)可能是由于過(guò)量氟的攝入,導(dǎo)致機(jī)體動(dòng)員其它血液儲(chǔ)備器官釋放紅細(xì)胞,同時(shí)骨髓新生成的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)會(huì)暫時(shí)升高。隨著染毒劑量的加大及持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),毒性作用超過(guò)了機(jī)體自身代償能力,導(dǎo)致機(jī)體紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量以及網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目會(huì)表現(xiàn)明顯降低,直接影響到機(jī)體的造血功能。

本研究數(shù)據(jù)表明,肉雞氟中毒降低了紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性,增加了紅細(xì)胞的滲透脆性,與多項(xiàng)研究結(jié)果一致[12-14]。細(xì)胞膜ATP酶活性受到抑制,一方面改變細(xì)胞膜的抗氧化酶系統(tǒng),引起機(jī)體細(xì)胞的ATP活力明顯下降;另一方面會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子與水分的調(diào)控失衡、膜電位的改變,最終紅細(xì)胞膜脆性明顯增大,加劇肉雞貧血的發(fā)生[15,16],這與本試驗(yàn)中Hb及滲透脆性的變化結(jié)果相一致。

EPO是一種由腎臟產(chǎn)生的調(diào)控紅細(xì)胞生成的糖蛋白激素,它能夠刺激并加快肉雞各發(fā)育階段的幼紅細(xì)胞分裂,促進(jìn)紅細(xì)胞成熟。另外,EPO還具有抗氧化,穩(wěn)定紅細(xì)胞膜的功能等作用[17]。氟中毒嚴(yán)重?fù)p傷了動(dòng)物機(jī)體的腎臟功能,從而影響了EPO的生成[18-20]。本試驗(yàn)中高氟1組隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng),肉雞血清EPO含量先略微增加后又降低,而高氟2組和3組血清EPO含量顯著降低,說(shuō)明肉雞血清EPO含量與染毒的劑量和中毒時(shí)間有密切關(guān)系,且氟在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)有較強(qiáng)的蓄積毒性。此外,EPO能夠平衡細(xì)胞膜內(nèi)外的正常滲透壓,血清中EPO減少會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的紅細(xì)胞膜流動(dòng)性降低,完整性被破壞,從而影響紅細(xì)胞的生成,加重肉雞的溶血性貧血癥狀。