基于濾紙片上浮法探究pH和底物濃度對H₂O₂酶促反應(yīng)的影響

董路遙 王穎 張志祥

摘要 優(yōu)化教材實(shí)驗(yàn)“探究 pH 對H2O2酶活性的影響”，并測量了不同濃度的H2O2底物對酶促反應(yīng)的影響，利用濾紙片上浮法測定酶促反應(yīng)速率，簡化實(shí)驗(yàn)步驟、放大實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，提高了實(shí)驗(yàn)成功率。結(jié)果顯示：H2O2酶的最適 pH在6.0左右，pH2.0環(huán)境下其活性完全喪失，pH10.0環(huán)境下活性降低且重新置于適宜 pH 環(huán)境后可部分恢復(fù)。一定范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度與 H2O2濃度呈正比。

關(guān)鍵詞? 濾紙片上浮法酶活性 H2O2酶

中圖分類號 G633.91???????????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

文件編號：1003-7586（2023）03-0070-03

“探究 pH 對 H2O2酶活性的影響”是人教版《必修1·分子與細(xì)胞》中“降低化學(xué)反應(yīng)活化能的酶”的重要實(shí)驗(yàn)，但教材只提出使用 H2O2酶和 H2O2作為實(shí)驗(yàn)材料，未具體說明實(shí)驗(yàn)如何操作、氣體如何收集等問題。浙教版教材則利用排水法收集氣體，通過不同 pH 下 O2釋放量來表征酶活性大小。然而，學(xué)生在實(shí)際操作中常會出現(xiàn)濾紙片粘貼不牢、氣體收集困難、組間現(xiàn)象差異不明顯等問題，實(shí)驗(yàn)成功率較低。

為使學(xué)生觀測到更明顯的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，以人教版教材“葉圓片上浮法探究光合作用強(qiáng)度”實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，將 H2O2酶通過吸附法固定在圓形濾紙片上，利用濾紙片上浮法探究酶促反應(yīng)速率。相比于排水集氣法，濾紙片上浮法將O2的生成速度轉(zhuǎn)化成濾紙片上浮速度，學(xué)生通過錄制視頻就能實(shí)現(xiàn)對多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察記錄，同時(shí)也能克服由于裝置氣密性、學(xué)生集氣熟練度等因素帶來的干擾。并且濾紙片形狀固定，材質(zhì)統(tǒng)一，可吸附的酶量相對恒定，實(shí)驗(yàn)的平行性較好，可重復(fù)性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1制備磷酸緩沖液和 H2O2溶液

將0.2 mol/L 磷酸二氫鈉、0.2 mol/L 磷酸氫二鈉和蒸餾水按一定比例配制成 pH 為2.0、4.0、5.0、6.0、7.0和10.0的磷酸緩沖液。將30%的 H2O2原液分別用蒸餾水稀釋至1.5%、2%和3%。

1.2酶的提取和固定化

將200 g 馬鈴薯和400 mL 20 mmol/L 磷酸二氫鉀置于破壁機(jī)中榨汁并過濾，濾液即為粗酶液。向含粗酶液的培養(yǎng)皿中投入直徑為1 cm 的圓形濾紙片，浸泡1 min，然后夾起濾紙片，靠在潔凈的試管壁上。

1.3酶促反應(yīng)的測定

1.3.1不同pH對H2O2酶活性的影響

取5個(gè)200 mL 規(guī)格的燒杯編號1～5，分別倒入50 mL pH 為4.0～8.0的磷酸緩沖液，再倒入等量1.5% H2O2溶液。向各燒杯中輕輕放入8片含酶濾紙片并用秒表計(jì)時(shí)。觀察濾紙片在燒杯內(nèi)的位置變化，記錄每片濾紙片從入水到出水的全部時(shí)長。

1.3.2不同濃度的H2O2對酶促反應(yīng)速率的影響

取3個(gè)200 mL 燒杯編號Ⅰ～Ⅲ，分別倒入50 mL 1.5%、2%和3%的 H2O2溶液，再倒入等量 pH 為6.0的磷酸緩沖液，向各燒杯中加入8片含酶濾紙片，記錄濾紙片的上浮時(shí)長。

1.3.3探究過酸或過堿對酶的影響是否可逆

取5個(gè)200 mL 燒杯編號 A～E，向各燒杯中均加入50 mL pH 為6.0的緩沖液和50 mL H2O2溶液。將含酶的濾紙片平均分為五組（每組8片），分別編號為a～e組，如表1進(jìn)行相關(guān)操作。接著，將a～e組濾紙片依次倒入 A～E 號燒杯中，記錄每片濾紙片上浮時(shí)長。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Excel計(jì)算每組濾紙片上浮的平均時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)差，并繪制曲線圖和柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1不同 pH 對H2O2酶活性的影響

由表2可知，22.3 s 時(shí)，pH 6.0組的濾紙片率先上浮，其余組的第一片濾紙片也在接下來的2～4秒內(nèi)上浮。在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，隨著pH 上升，濾紙片上浮的時(shí)間先下降后上升，說明 H2O2酶活性先升高后下降，當(dāng)pH為6.0時(shí)，濾紙片上浮時(shí)間最短，因此H2O2酶的最適pH在6.0左右。

基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，學(xué)生利用 Excel 軟件繪制上浮時(shí)間-pH 曲線圖（圖1），在提高數(shù)據(jù)處理能力的同時(shí)，通過認(rèn)別坐標(biāo)圖中橫縱坐標(biāo)含義、曲線趨勢等關(guān)鍵圖表元素增強(qiáng)了學(xué)生的識圖分析能力和邏輯推理能力，這為深入分析pH對酶活性的影響奠定了基礎(chǔ)。

2.2不同 H2O2濃度對反應(yīng)速率的影響

當(dāng) H2O2濃度為1.5%-3%時(shí)，濾紙片上浮時(shí)間與 H2O2濃度成反比，即 H2O2濃度越高，酶促反應(yīng)速度越快（圖2）。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，酶分子的活性中心未被底物全部飽和，所以隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率逐漸增大。

2.3探究過酸或過堿對酶的影響是否可逆

隨著實(shí)驗(yàn)的深入，有學(xué)生提出疑問：將過酸過堿條件下的酶重新置于最適 pH，其活性能否恢復(fù)？為進(jìn)一步研究酶的作用機(jī)理，學(xué)生組建興趣小組，增設(shè)了一組拓展實(shí)驗(yàn)。

表3數(shù)據(jù)顯示：（1）含酶濾紙片經(jīng)pH為2.0的緩沖液處理后未上浮，恢復(fù)至最適pH后也未能浮起。（2）含酶濾紙片經(jīng) pH 為10.0的緩沖液處理后仍有少量上浮，但上浮時(shí)間增加?；謴?fù)至最適pH后，濾紙片上浮數(shù)量增加，上浮時(shí)間縮短。但這些組的酶促反應(yīng)速率均低于 C 組，說明 H2O2酶在pH6.0時(shí)活性最強(qiáng)，在pH 為2.0條件下完全失活，但在pH 為10.0條件下相對耐受，恢復(fù)至合適pH 以后，其活性可以部分恢復(fù)，此結(jié)論與葛暄等的實(shí)驗(yàn)一致。

天然態(tài)酶分子（N）會經(jīng)過一系列相對穩(wěn)定的中間態(tài) U1、U2等，最終過渡到變性狀態(tài)，中間狀態(tài)時(shí)仍具部分活性，而且是可逆過程，只要除去不利因素，酶活性就可以恢復(fù)到原有狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)酶處于pH 為10.0的堿溶液中時(shí)，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的改變，只具有部分酶活性，但是此時(shí)仍處于相對穩(wěn)定的中間態(tài)，沒有達(dá)到變性態(tài)。因此將酶從 pH 為10.0的溶液中轉(zhuǎn)移至pH為6.0的溶液后，酶活性有一定程度的恢復(fù)，酶促反應(yīng)速度加快。而 A、B 組的酶置于 pH 為2.0的緩沖液后，酶分子越過中間態(tài)，直接到達(dá)變性態(tài)，完全失活，即使重新置于最適pH 中，酶活性也不能恢復(fù)。

3 實(shí)驗(yàn)反思

3.1優(yōu)化濾紙片處理，拍攝視頻回看計(jì)時(shí)

濾紙片上浮法相比排水集氣法操作更簡單，現(xiàn)象更直觀。但由于濾紙片上浮速度較快，計(jì)時(shí)可能出現(xiàn)誤差；不同組別先后處理產(chǎn)生的時(shí)間差也可能使土豆片久置，導(dǎo)致初始酶活性產(chǎn)生變化。因此可將所有濾紙片分別處理后分組晾掛在試管外壁上，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將所有晾有濾紙片的試管同時(shí)浸入 H2O2溶液中，利用相機(jī)拍攝濾紙片從杯底上浮至液面的全過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后回看視頻對各組進(jìn)行分別計(jì)時(shí)（圖3）。視頻計(jì)時(shí)保證了計(jì)時(shí)的準(zhǔn)確性和初始酶活性的一致性，也為教師的課堂教學(xué)提供了寶貴的實(shí)錄素材。

3.2合理確定固定化時(shí)間

固定化時(shí)間對酶活性的作用具有兩重性。延長固定化時(shí)間能增加H2O2酶的固定效果，使酶更充分的吸附在濾紙片上。然而，固定化時(shí)間過長，土豆勻漿中 H2O2酶被微生物分解，活性則會大大降低。因此，控制合理的固定化時(shí)間對于提高酶的吸附效率具有重要意義。土豆中的多酚氧化酶會引起多酚類物質(zhì)的逐漸氧化，使勻漿出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，隨固定時(shí)間的延長，褐色逐漸加深。因此在實(shí)際操作中，可根據(jù)土豆勻漿的顏色來確定何時(shí)終止固定過程。當(dāng)土豆勻漿顏色變?yōu)闇\紅棕色時(shí)，固定化效果最好。

3.3自主學(xué)習(xí)合作探究

實(shí)驗(yàn)過程中，教師引導(dǎo)學(xué)生圍繞學(xué)習(xí)目標(biāo)展開由淺入深，由表及里的探究活動，實(shí)現(xiàn)自主學(xué)習(xí)和合作探究的高度統(tǒng)一。預(yù)習(xí)時(shí)學(xué)生提問：為何將濾紙片浸泡在酶液中？教師可引導(dǎo)學(xué)生查閱選修中的固定化技術(shù)及相關(guān)資料對固定化方法進(jìn)行自主預(yù)習(xí)；實(shí)驗(yàn)后學(xué)生提問：過酸過堿條件下酶活性是否可逆？教師可引導(dǎo)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，合作開展探究，同時(shí)鼓勵學(xué)生自學(xué)Excel等軟件，小組互助對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)展開分析和解讀。由于課堂時(shí)間限制，學(xué)生只測量了 H2O2濃度為1%、2%和3%時(shí)的酶促反應(yīng)速度，具體的飽和底物濃度可由興趣小組在課后進(jìn)行深入探索?？傊瑢W(xué)生在課堂上出現(xiàn)的任何問題都可以成為課堂生成的資源，真正體現(xiàn)了以學(xué)定教，動態(tài)生成的教學(xué)理念。

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