miR-20a通過ATG16L1影響細(xì)胞自噬并參與調(diào)節(jié)雷公藤甲素肝毒性

張彩霞，王偉艷，李會芳，杜晨暉，劉 珊，魏硯明

miR-20a通過ATG16L1影響細(xì)胞自噬并參與調(diào)節(jié)雷公藤甲素肝毒性

張彩霞，王偉艷，李會芳，杜晨暉，劉 珊，魏硯明*[1]

山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619

觀察雷公藤甲素對miR-20a及自噬相關(guān)16樣蛋白L1（autophagy related 16 like protein1，ATG16L1）表達(dá)的影響，探討miR-20a對雷公藤甲素所致肝細(xì)胞毒性的調(diào)控作用。利用雷公藤甲素處理人正常肝細(xì)胞株HL7702和C57BL/6J小鼠，通過qRT-PCR和Western blotting檢測、ATG16L1及自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3II（microtubule-associated protein 1 light 3II，LC3II）的表達(dá)。利用雷公藤甲素和miR-20a模擬物或抑制物共同處理HL7702細(xì)胞，通過qRT-PCR和Western blotting檢測ATG16L1及LC3II的表達(dá)；CCK-8法檢測細(xì)胞存活率；試劑盒檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放量；ELISA檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）和Caspase-9的活性。雷公藤甲素顯著下調(diào)人正常肝細(xì)胞或小鼠肝組織中表達(dá)（＜0.05），上調(diào)ATG16L1和LC3II的表達(dá)（＜0.05）。miR-20a模擬物可抑制雷公藤甲素引起的ATG16L1、LC3II表達(dá)升高（＜0.05），進(jìn)一步降低細(xì)胞存活率（＜0.05），提高LDH釋放量（＜0.05），上調(diào)Caspase-3和Caspase-9活性（＜0.05），而miR-20a抑制物具有相反作用。miR-20a通過ATG16L1影響自噬過程，參與調(diào)節(jié)雷公藤甲素肝細(xì)胞毒性。

雷公藤甲素；肝細(xì)胞毒性；細(xì)胞自噬；miR-20a；ATG16L1；細(xì)胞凋亡

中藥引起的肝損傷是臨床上藥物肝損傷的重要病因之一。雷公藤甲素既是傳統(tǒng)中藥雷公藤Hook. f.的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)、抗血管生成、抑制細(xì)胞增殖及促細(xì)胞凋亡等藥理活性，也是引起肝臟毒性不良反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。研究表明有多種機(jī)制參與雷公藤甲素所致肝毒性，如藥物代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、免疫損傷、腸道菌群失調(diào)等[3]。此外，細(xì)胞自噬也被認(rèn)為是雷公藤甲素引起肝毒性的關(guān)鍵機(jī)制[4]。細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化高度保守并受嚴(yán)格調(diào)控的將底物運(yùn)送至溶酶體中降解的過程。雷公藤甲素可劑量相關(guān)性激活肝癌細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞死亡[5-6]。在正常肝細(xì)胞系中，雷公藤甲素通過促進(jìn)自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1的表達(dá)上調(diào)細(xì)胞自噬活性[7]。另外，雷公藤甲素處理可導(dǎo)致斑馬魚肝組織中自噬相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，）表達(dá)明顯升高[8]，引起小鼠肝組織中自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）堆積[9]。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平可能為抑制或減輕其肝毒性的潛在途徑。然而，目前對于雷公藤甲素調(diào)節(jié)肝細(xì)胞自噬的作用途徑及細(xì)胞自噬在雷公藤甲素肝毒性中的功能仍有待闡明。

小RNAs（miRNAs/miRs）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。通過與特定mRNA的3’-UTR結(jié)合，引起mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。miRNAs參與調(diào)控細(xì)胞分化、器官發(fā)育、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡等多種生理過程，其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物和藥物的治療靶點(diǎn)[10]。雷公藤甲素可以上調(diào)或下調(diào)多種miRNAs的表達(dá)，影響多條信號通路，實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗血管生成等多種藥理活性[11]。另外，miRNAs通過調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)基因或調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。

本課題組利用轉(zhuǎn)錄組測序觀察到雷公藤甲素能明顯下調(diào)正常肝細(xì)胞中miR-20a表達(dá)，并且Targetscan（http://www.targetscan.org/vert.72/）、miRDB（http://mirdb.org）網(wǎng)站預(yù)測ATG16L1為其下游靶點(diǎn)。由于ATG16L1是自噬小體形成所必需的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[13]，推測miR-20a可能作為雷公藤甲素的作用靶點(diǎn)，參與調(diào)控細(xì)胞自噬，并在雷公藤甲素肝毒性中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)擬觀察雷公藤甲素對正常肝細(xì)胞中miR-20a及其下游潛在靶點(diǎn)ATG16L1表達(dá)的影響，探討miR-20a對雷公藤甲素所致肝細(xì)胞毒性的調(diào)控作用，旨在為增進(jìn)對雷公藤甲素肝毒性作用機(jī)制的了解，尋找雷公藤甲素肝毒性的生物標(biāo)志物提供線索。

1 材料

1.1 細(xì)胞及動物

人正常肝細(xì)胞株HL-7702購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量16～18 g，6周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號2021DW207）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤甲素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號210607）購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；氯喹（批號C6628）購自美國Sigma公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（批號2307486）購自美國Thermo公司；BCA蛋白濃度試劑盒（批號20211101）購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶抑制劑（P1006）、RIPA蛋白裂解液（批號011921210824）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號AA128）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號MA0186-1-Nov-16G）購自大連美倫生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（批號JH620）購自日本同仁化學(xué)科技（上海）有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（批號20220319）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）試劑盒（批號C010-2-1），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）試劑盒（批號C009-2-1）購自南京建成生物工程研究所；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-9試劑盒（批號20211215）購自上海瓦蘭生物科技有限公司；ATG16L1 3’-UTR野生型（Wt）和突變型（Mut）熒光質(zhì)粒，由分別向pmirGLO熒光素酶載體XhoI/XbaI位點(diǎn)插入含有miR-20a預(yù)測靶序列（GCACTTT）及突變靶序列（TTGACCC）3’-UTR片段得到，由上海吉瑪基因有限公司提供；pCMV-FLAG-ATG16L1質(zhì)粒，向pCMV-Flag載體EcoRI/XhoI位點(diǎn)插入ATG16L1 cDNA序列得到，由PPL生物有限公司提供；pEGFP-N1-LC3質(zhì)粒受贈于山西中醫(yī)藥大學(xué)任晉宏博士；LC3II抗體（批號GR3338049-2）購自英國Abcam公司；ATG16L1抗體（批號H226AA0020）、Trizol試劑（批號G921KA7073）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（批號HCT4KA2901）、miRNA熒光定量PCR試劑盒（批號H712KA0769）、MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix（批號H525KA0190）、SGExcel FastSYBR qPCR預(yù)混液（批號I112KA3257）、miR-20a模擬物（mimics）、miR-20模擬物陰性對照（mimics NC）、miR-20a抑制物（inhibitor）、miR-20抑制物陰性對照（inhibitor NC）均由上海生工生物工程有限公司提供；實(shí)驗(yàn)中所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.3 儀器

Galaxy 170s CO2培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司）；Allegra X-30R型臺式冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；EasyWeLL系列JY98-IIIN型細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；倒置激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）；Power Wave全波長酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；Powercycler普通PCR儀（英國Analylik Jena公司）；FQD-96A型多功能實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增儀（杭州博日公司）；ImageQuant LAS 500化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GE公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HL7702細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2、95%空氣的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞及動物分組和給藥

取對數(shù)生長期的HL7702細(xì)胞，加入25、50、100 nmol/L雷公藤甲素處理24 h或用50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，檢測細(xì)胞存活率，并檢測和ATG16L1表達(dá)；根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明，將HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LC3質(zhì)粒24 h后，加入25、50、100 nmol/L雷公藤甲素處理24 h，檢測LC3點(diǎn)狀物的形成；設(shè)置對照組（僅加入培養(yǎng)基）、miR-20a mimics組、miR-20a mimics NC組，轉(zhuǎn)染24 h后，檢測miR-20a和ATG16L1表達(dá)；將miR-20a mimics、miR-20a mimics NC與ATG16L1 3’-UTR Wt、ATG16L1 3’-UTR Mut熒光質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染到HL7702細(xì)胞內(nèi)，檢測熒光強(qiáng)度；設(shè)置對照組（僅加入培養(yǎng)基）、雷公藤甲素組、雷公藤甲素＋miR-20a mimics組、雷公藤甲素＋miR-20a mimics NC組、雷公藤甲素＋miR-20a inhibitor組、雷公藤甲素＋miR-20a inhibitor NC組、雷公藤甲素＋miR-20a mimics＋ATG16L1組、雷公藤甲素＋氯喹（20 μmol/L）組，轉(zhuǎn)染miR-20a mimics、miR-20a inhibitor和50 nmol/L雷公藤甲素共同處理48 h，或轉(zhuǎn)染miR-20a mimics和50 nmol/L雷公藤甲素共同處理24 h后，轉(zhuǎn)染pCMV-FLAG-ATG16L1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，檢測細(xì)胞存活率、LDH釋放量，并檢測Caspase-3、Caspase-9活性和ATG16L1、LC3II蛋白表達(dá)。

將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對照組、雷公藤甲素組，每組6只，對照組ip 0.9%生理鹽水，雷公藤甲素ip 0.8 mg/kg雷公藤甲素，每2天注射1次，注射3次，末次給藥24 h后，分離血清，取肝組織，備用。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

將HL7702細(xì)胞接種到96孔板中，經(jīng)不同處理后，按照CCK8試劑盒說明書測得各孔吸光度（）值并計算細(xì)胞存活率。

2.4 RNA提取及qRT-PCR檢測

按照Trizol試劑說明書提取不同處理細(xì)胞和小鼠肝組織中的總RNA，分別使用miRNA第一鏈cDNA試劑盒和MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以為內(nèi)參，以為內(nèi)參，通過miRNA熒光定量PCR試劑盒和SGExcel FastSYBR qPCR預(yù)混液分別對和進(jìn)行定量分析。

2.5 蛋白提取及Western blotting檢測

細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，23號針頭反復(fù)吹打破碎細(xì)胞，或取適量小鼠肝組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，組織勻漿儀破碎后，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。將上清液與5×SDS上樣緩沖液混勻，95 ℃加熱5 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉1 h，加入ATG16L1、LC3II一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜后，加入二抗（1∶5000），室溫孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下進(jìn)行曝光，Image J軟件定量目的條帶。

2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察LC3點(diǎn)狀物

將轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LC3質(zhì)粒的HL7702細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后，DAPI溶液染細(xì)胞核，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3點(diǎn)狀物的形成。隨機(jī)選取5個視野不少于150個細(xì)胞，對其中含有≥5個LC3點(diǎn)狀物的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

將miR-20a mimics、miR-20a mimics NC分別和ATG16L1 3’-UTR Wt和Mut熒光質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HL7702細(xì)胞48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書測定熒光強(qiáng)度。

2.8 LDH釋放量檢測

HL7702細(xì)胞經(jīng)不同處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，2500 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書測定LDH釋放量。

2.9 Caspase-3和Caspase-9活性檢測

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，2500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS，利用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，4 ℃、3000 r/min離心5 min，按照ELISA試劑盒說明書測定Caspase-3和Caspase-9活性。

2.10 GOT和GPT活性檢測

按照GOT和GPT試劑盒說明書檢測小鼠血清中GOT和GPT活性。

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 雷公藤甲素降低HL7702細(xì)胞存活率

HL7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度的雷公藤甲素處理24 h后，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示雷公藤甲素可以顯著抑制細(xì)胞活力（＜0.05），且呈劑量相關(guān)性（圖1-A）。為了比較雷公藤甲素不同處理時間對細(xì)胞存活率的影響，HL7702細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，檢測HL7702細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示隨著處理時間延長，細(xì)胞存活率逐漸降低（＜0.05，圖1-B）。

3.2 雷公藤甲素對HL7702細(xì)胞miR-20a和ATG16L1表達(dá)的影響

HL7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度的雷公藤甲素處理24 h后，利用qRT-PCR和Western blotting檢測和ATG16L1的表達(dá)，結(jié)果顯示25 nmol/L雷公藤甲素處理的HL7702細(xì)胞中未觀察到和ATG16L1的表達(dá)有明顯變化（圖2-A），但隨著雷公藤甲素濃度的提高，的表達(dá)顯著降低（＜0.05），ATG16L1的表達(dá)顯著提高（＜0.05）。為了比較雷公藤甲素不同處理時間對和ATG16L1的表達(dá)，將HL7702細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素處理12、24、48 h后，檢測和ATG16L1的表達(dá)，結(jié)果顯示不同處理時間均引起表達(dá)顯著降低（＜0.05，圖2-B）；而在經(jīng)雷公藤甲素處理12 h的HL7702細(xì)胞中未觀察到mRNA和蛋白的表達(dá)有明顯變化，但雷公藤甲素處理24、48 h顯著提高mRNA和蛋白的表達(dá)（＜0.05）。

與對照組或0 h比較：*P＜0.05，圖2、4、5同

圖2 不同濃度 (A)或處理時間(B) 的雷公藤甲素對HL7702細(xì)胞miR-20a和ATG16L1表達(dá)的影響(, n = 3)

3.3 miR-20a靶向調(diào)節(jié)ATG16L1的表達(dá)

雙熒光素酶報告基因檢測（圖3-A）結(jié)果顯示，ATG16L1 3’-UTR Wt熒光質(zhì)粒與miR-20a mimics共轉(zhuǎn)染組相對熒光強(qiáng)度顯著低于miR-20a mimics NC（＜0.05），而Mut熒光質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組無明顯變化。HL7702細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后，ATG16L1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.05），而miR-20a mimics NC對ATG16L1表達(dá)量則無明顯影響（圖3-B）。以上結(jié)果說明，miR-20a能夠靶向結(jié)合于ATG16L1的3’-UTR，進(jìn)而抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后水平。

與ATG16L1 Wt＋mimics NC組比較：*P＜0.05；與對照組比較：#P＜0.05

3.4 雷公藤甲素對HL7702細(xì)胞自噬的影響

LC3II作為細(xì)胞自噬的底物，特異定位于自噬小體膜上，其表達(dá)量與自噬小體數(shù)量正相關(guān)。因此，LC3II常作為檢測自噬水平的標(biāo)志物[14-15]。HL7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度的雷公藤甲素處理24 h后，Western blotting檢測LC3II的表達(dá)，結(jié)果顯示50、100 nmol/L的雷公藤甲素顯著提高LC3II表達(dá)（＜0.05，圖4-A）。利用不同濃度的雷公藤甲素處理轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LC3質(zhì)粒的HL7702細(xì)胞24 h，觀察到雷公藤甲素可劑量相關(guān)性增加自噬小體點(diǎn)狀物的形成（＜0.05，圖4-B）。

自噬流是由吞噬泡組裝位點(diǎn)的形成、自噬小體的形成、自噬小體與溶酶體的融合及底物的降解等多個連續(xù)步驟組成的動態(tài)過程。自噬流活化引起的自噬小體形成增多或受阻引起的自噬小體降解抑制均能導(dǎo)致LC3II表達(dá)升高[16]。當(dāng)使用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬小體與溶酶體的融合時，如果雷公藤甲素能夠激活細(xì)胞自噬流，氯喹處理則進(jìn)一步增加LC3II表達(dá)，反之，氯喹處理對LC3II表達(dá)無明顯影響[17]。為了觀察雷公藤甲素對肝細(xì)胞中自噬流的影響，HL7702細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素單獨(dú)處理或和20 μmol/L氯喹共同處理24 h后，Western blotting檢測LC3II的表達(dá)，結(jié)果顯示，雷公藤甲素與氯喹共處理較雷公藤甲素單獨(dú)處理LC3II表達(dá)進(jìn)一步提高（＜0.05，圖4-C），表明雷公藤甲素可促進(jìn)細(xì)胞自噬流。

與雷公藤甲素組比較：#＜0.05

#< 0.05triptolide group

3.5 雷公藤甲素對小鼠血清中GOT、GPT活性及肝組織中miR-20a、ATG16L1與LC3II表達(dá)的影響

利用試劑盒檢測小鼠血清中GOT和GPT的活性，結(jié)果顯示與對照組比較，雷公藤甲素組小鼠血清中GOT和GPT活性顯著升高（＜0.05，圖5-A），表明肝毒性模型構(gòu)建成功。通過qRT-PCR和Western blotting檢測小鼠肝組織中、ATG16L1和LC3II的表達(dá)水平，結(jié)果顯示雷公藤甲素組顯著下調(diào)，mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05），LC3II蛋白表達(dá)升高（＜0.05，圖5-B、C）。

3.6 miR-20a對雷公藤甲素引起HL7702細(xì)胞自噬活化的影響

HL7702細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素單獨(dú)處理或轉(zhuǎn)染miR-20a mimics、miR-20a inhibitor共同處理24 h后，qRT-PCR和Western blotting檢測mRNA和LC3II的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-20a mimics顯著抑制雷公藤甲素引起的mRNA和LC3II表達(dá)升高（＜0.05），miR-20a inhibitor可進(jìn)一步促進(jìn)mRNA和LC3II表達(dá)上調(diào)（＜0.05），而miR-20a mimics NC或inhibitor NC則無明顯影響（圖6）。

圖5 雷公藤甲素對C57BL/6J小鼠肝功能指標(biāo)(A)、肝組織miR-20a及ATG16L1 mRNA表達(dá)(B) 和ATG16L1及LC3II蛋白表達(dá)(C) 的影響(, n = 3)

與雷公藤甲素組比較：*P＜0.05

3.7 miR-20a對雷公藤甲素引起HL7702細(xì)胞毒性的影響

LDH是細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑中的氧化還原酶，其釋放量反映細(xì)胞膜的完整性，是細(xì)胞毒性的重要指標(biāo)[18]；細(xì)胞凋亡是雷公藤甲素引起肝毒性的重要機(jī)制，其中Caspase-3和Caspase-9級聯(lián)活化反應(yīng)是凋亡過程中的關(guān)鍵信號通路[8]。HL7702細(xì)胞經(jīng)50 nmol/L雷公藤甲素單獨(dú)處理或與轉(zhuǎn)染miR-20a mimics、miR-20a inhibitor、FLAG-ATG16L1及20 μmol/L氯喹共同處理后，檢測細(xì)胞存活率、LDH釋放量、Caspase-3和Caspase-9活性。如圖7所示，與對照組比較，雷公藤甲素顯著降低細(xì)胞存活率（＜0.05），提高LDH釋放量（＜0.05），上調(diào)Caspase-3和Caspase-9活性（＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-20a mimics和雷公藤甲素共處理較雷公藤甲素單獨(dú)處理細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降（＜0.05），LDH釋放量進(jìn)一步增多（＜0.05），Caspase-3和Caspase-9活性顯著提高（＜0.05），陰性對照miR-20a mimics NC則無明顯影響；與轉(zhuǎn)染miR-20a mimics比較，轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor對細(xì)胞存活率、LDH釋放量、Caspase-3和Caspase-9活性具有相反效應(yīng)（＜0.05）。利用氯喹抑制自噬小體和溶酶體的融合[19]，干預(yù)細(xì)胞自噬過程可進(jìn)一步加劇雷公藤甲素肝細(xì)胞毒性（＜0.05）。而共轉(zhuǎn)染FLAG-ATG16L1則逆轉(zhuǎn)miR-20a mimics對雷公藤甲素對HL7702細(xì)胞存活率、LDH釋放量、以及Caspase-3和Caspase-9活性的影響（＜0.05）。

與雷公藤甲素組比較：*P＜0.05；與雷公藤甲素＋miR-20a mimics組比較：#P＜0.05

4 討論

多種miRNAs在雷公藤甲素的藥理作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。雷公藤甲素通過下調(diào)miR-155表達(dá)，引起SHIP1表達(dá)升高，從而抑制α-突觸核蛋白引起的炎癥因子釋放和小膠質(zhì)細(xì)胞活化[20]。雷公藤甲素可抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中miR-188表達(dá)上調(diào)，阻斷PTEN信號通路，逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[21]。另外，miRNAs與細(xì)胞自噬的起始、延伸及成熟等多個階段密切相關(guān)[22]。miR-376b可下調(diào)自噬關(guān)鍵基因和的表達(dá)，抑制自噬起始[23]。miR-181a和miR-630分別調(diào)節(jié)、表達(dá)，影響細(xì)胞自噬囊泡伸展階段[24]。miR-130則可通過靶向自噬小體-溶酶體融合關(guān)鍵基因人溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1，），參與調(diào)節(jié)融合過程[25]。作為miR-17-92簇的一員，miR-20a通過阻斷自噬相關(guān)基因和的表達(dá)，抑制缺氧引起的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬活化[26]。miR-20a也可負(fù)調(diào)控ATG7表達(dá)，阻斷細(xì)胞自噬，從而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖[27]。另外，mRNA也被證明為miR-20a的下游靶點(diǎn)。ATG16L1能夠與自噬起始過程中泛素樣結(jié)合系統(tǒng)中的ATG12-ATG5復(fù)合體非共價結(jié)合，在隔離膜的延伸及自噬小體雙層膜的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。miR-20a通過下調(diào)ATG16L1的表達(dá)抑制細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞中分枝桿菌的存活[29]。缺氧引起的miR-20a表達(dá)抑制能夠上調(diào)ATG16L1表達(dá)并誘導(dǎo)自噬活化，引起破骨細(xì)胞分化[30]。本研究中，雷公藤甲素在引起肝細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬活化的同時，能夠明顯降低正常肝細(xì)胞和肝組織中miR-20a的表達(dá)，上調(diào)ATG16L1的表達(dá)。雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-20a結(jié)合于ATG16L1的3’-UTR，并且miR-20a mimics或inhibitor能夠阻斷或進(jìn)一步促進(jìn)雷公藤甲素引起的肝細(xì)胞中ATG16L1及自噬標(biāo)記物L(fēng)C3II表達(dá)升高。因此，雷公藤甲素通過靶向調(diào)節(jié)miR-20a的表達(dá)，上調(diào)ATG16L1，從而引起細(xì)胞自噬活化。此外，Targetscan、miRDB網(wǎng)站預(yù)測自噬相關(guān)基因、UNC-51樣激酶1（UNC-51 like kinase 1，）、、等均為miR-20a下游潛在靶點(diǎn)，然而qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示雷公藤甲素對肝細(xì)胞中這些潛在靶點(diǎn)的表達(dá)無明顯影響，提示上述自噬相關(guān)基因可能在雷公藤甲素引起的肝細(xì)胞自噬活化過程中未發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，多種機(jī)制參與雷公藤甲素調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)。雷公藤甲素通過干預(yù)轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3的磷酸化，阻斷其于Smad4的結(jié)合及入核運(yùn)輸，從而抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）引起的miR-30表達(dá)下調(diào)[31]。雷公藤甲素還能夠抑制c-myc轉(zhuǎn)錄活性，阻斷miR-7-92和miR-106b-25的轉(zhuǎn)錄[32]。今后的工作將探討雷公藤甲素調(diào)節(jié)miR-20a表達(dá)的分子機(jī)制或信號通路。

細(xì)胞自噬對于細(xì)胞生存具有兩面性。正常條件下，細(xì)胞自噬活性維持在較低水平。外界刺激可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性，發(fā)揮降解蛋白質(zhì)或細(xì)胞器、維持代謝平衡和促細(xì)胞生存的功能。另一方面，過度活化的細(xì)胞自噬則導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，引起自噬性死亡[33]。本實(shí)驗(yàn)在體外條件下證明了利用miR-20a mimics或自噬抑制劑氯喹處理較雷公藤甲素單獨(dú)處理可進(jìn)一步降低正常肝細(xì)胞的存活率，促進(jìn)LDH釋放及細(xì)胞凋亡，加劇雷公藤甲素引起的肝細(xì)胞毒性，而miR-20a inhibitor則具有緩解雷公藤甲素肝毒性的效應(yīng)，說明細(xì)胞自噬是肝細(xì)胞受到雷公藤甲素處理時激發(fā)的一種保護(hù)性機(jī)制，而阻斷細(xì)胞自噬途徑則可能影響體內(nèi)活性氧或受損傷的細(xì)胞器清除能力，拮抗其對雷公藤甲素引起肝細(xì)胞凋亡的緩解作用，從而進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞毒性[34]。今后將嘗試在體內(nèi)條件下驗(yàn)證miR-20a是否通過自噬途徑對雷公藤甲素肝毒性發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)。過表達(dá)ATG16L1能夠部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-20a mimics對雷公藤甲素肝毒性的影響，一方面驗(yàn)證了ATG16L1在miR-20a調(diào)節(jié)雷公藤甲素肝毒性中發(fā)揮重要作用，另一方面說明miR-20a的其他潛在靶點(diǎn)可能參與了其對雷公藤甲素肝毒性的調(diào)節(jié)作用[26-27]。未來有必要探討miR-20a的其他下游靶基因是否在雷公藤甲素肝毒性中發(fā)揮作用。

綜上，本研究觀察了雷公藤甲素對正常肝細(xì)胞及小鼠肝組織中miR-20a及其下游靶基因表達(dá)的影響，結(jié)果驗(yàn)證了在體外條件下miR-20a通過ATG16L1影響自噬過程，并參與調(diào)節(jié)雷公藤甲素肝細(xì)胞毒性，為闡明雷公藤甲素肝毒性的作用機(jī)制及miR-20a作為雷公藤甲素肝毒性的新型生物標(biāo)記物提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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miR-20a regulates autophagy by targeting ATG16L1 and involved in triptolide-induced hepatotoxicity

ZHANG Cai-xia, WANG Wei-yan, LI Hui-fang, DU Chen-hui, LIU Shan, WEI Yan-ming

College of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To validate the effect of triptolide on miR-20a and autophagy related 16 like protein1 (ATG16L1) expressions and evaluate the regulatory role of miR-20a in triptolide-induced hepatotoxicity.HL7702 cells and C57BL/6J mice were treated with triptolide, and thenand ATG16L1 levels were detected by qRT-PCR and Western blotting. After HL7702 cells exposure to triptolide and simultaneous transfection with miR-20a mimics or inhibitor, ATG16L1 and microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3Ⅱ) expressions were detected by qRT-PCR and Western blotting; Cell survival rate was detected by CCK-8 method; The release of lactate dehydrogenase (LDH) was detected by kit; The activities of cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) and Caspase-9 were detected by ELISA.Triptolide significantly down-regulatedexpression in normal liver cells or mouse liver tissues (< 0.05), as well as upregulated ATG16L1 and LC3Ⅱ expressions (< 0.05). miR-20a mimics significantly reversed the elevated ATG16L1 and LC3Ⅱ expressions induced by triptolide (< 0.05), further exacerbated triptolide-elicited decrease in cell viability (< 0.05), increase in lactate dehydrogenase leakage and activation of apoptosis proteases Caspase-3 and Caspase-9 (< 0.05), whereas miR-20a inhibitor exhibited opposite effects.miR-20a plays a regulatory role on triptolide-mediated hepatotoxicity by targeting ATG16L1 to affect autophagy.

triptolide; hepatotoxicity; autophagy; miR-20a; ATG16L1; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4214 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.014

2023-02-09

山西省科技廳基礎(chǔ)研究課題資助項(xiàng)目（202103021224295）；山西中醫(yī)藥大學(xué)毒效關(guān)系研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2022TD1016）；山西中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新能力培養(yǎng)計劃“基礎(chǔ)研究專項(xiàng)”課題資助項(xiàng)目（2020PY-JC-17）

張彩霞，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮庐a(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用。E-mail: 2303537480@qq.com

通信作者：魏硯明，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥理與毒理研究。Tel: (0351)3179717 E-mail: weiyanming2005@aliyun.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]