散寒化濕顆粒HPLC特征圖譜研究

于桂芳，胡軍華，周 茆，周恩麗，戴翠紅，李海波，章晨峰，王振中，王團(tuán)結(jié)*，肖 偉*

散寒化濕顆粒HPLC特征圖譜研究

于桂芳1, 2, 3，胡軍華1, 2, 3，周 茆1, 2, 3，周恩麗1, 2, 3，戴翠紅1, 2, 3，李海波1, 2, 3，章晨峰1, 2, 3，王振中1, 2, 3，王團(tuán)結(jié)1, 2, 3*，肖 偉1, 2, 3*

1. 中藥制藥過程與智能制造技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中成藥智能制造技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 連云港 222001

建立散寒化濕顆粒（Sanhan Huashi Granules，SHG）的HPLC特征圖譜，并對全部特征峰進(jìn)行化學(xué)成分指認(rèn)和藥材來源歸屬，為其整體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。采用Waters Atlantis T3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為250 nm，建立SHG的HPLC特征圖譜。采用UHPLC-QTOF MS、NMR、對照品比對及定向分離技術(shù)對10個(gè)特征峰進(jìn)行了準(zhǔn)確的化學(xué)成分指認(rèn)并歸屬處方藥味來源，并對20批制劑進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)。建立了SHG的HPLC特征圖譜，10個(gè)特征峰得到明確化學(xué)成分指認(rèn)，分別為腺嘌呤（1號(hào)峰）、尿苷（2號(hào)峰）、鳥苷（3號(hào)峰）、肌苷（4號(hào)峰）、5-羥甲基糠醛（5號(hào)峰）、木蘭苷A（6號(hào)峰）、佛手酚-5--β--吡喃葡萄糖苷峰（7號(hào)峰）、紫花前胡苷（8號(hào)峰）、6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷（9號(hào)峰）、茴香酸對羥基苯乙酯（10號(hào)峰），并歸屬了特征峰處方藥味來源，分別為1號(hào)峰歸屬于麻黃、苦杏仁、羌活、廣藿香、蒼術(shù)、白術(shù)、焦六神曲、焦麥芽、地龍、徐長卿、葶藶子，2號(hào)峰歸屬于厚樸、羌活、廣藿香、佩蘭、蒼術(shù)、白術(shù)、地龍、徐長卿、葶藶子，3號(hào)峰歸屬于羌活、廣藿香、地龍、徐長卿、葶藶子，4號(hào)峰歸屬于地龍，5號(hào)峰歸屬于焦三仙（焦山楂、焦麥芽、焦六神曲），6號(hào)峰歸屬于厚樸，7～10號(hào)峰歸屬于羌活。20批制劑均符合特征圖譜的規(guī)定，批間一致性良好。所建立的SHG的HPLC特征圖譜方法簡便，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，初步描繪了SHG的整體化學(xué)成分特征，為進(jìn)一步提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也可為其他經(jīng)典名方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

經(jīng)典名方；散寒化濕顆粒；HPLC；特征圖譜；腺嘌呤；尿苷；鳥苷；肌苷；5-羥甲基糠醛；木蘭苷A；佛手酚-5--β--吡喃葡萄糖苷；紫花前胡苷；6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷；茴香酸對羥基苯乙酯

新型冠狀病毒肺炎疫情2020年開始席卷全球，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院仝小林院士基于寒濕疫理論和新冠肺炎核心病機(jī)與治法，擬定“中醫(yī)通治方”（又名寒濕疫方）。該方基于麻杏石甘湯等5個(gè)經(jīng)典名方化裁而成[1-2]，由厚樸、焦檳榔、煨草果、麻黃等20味藥組成，具有散寒化濕、宣肺透邪、辟穢化濁、解毒通絡(luò)的功效，用于寒濕郁肺所致疫病，癥見發(fā)熱、乏力、咳嗽等癥。臨床研究顯示具有預(yù)防及改善新冠癥狀、降低轉(zhuǎn)重率的療效，且安全性良好[3]，被納入國家衛(wèi)健委《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行）》第六至九版。

散寒化濕顆粒（Sanhan Huashi Granules，SHG）為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司將該方按照古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑注冊要求，研制開發(fā)成便于臨床大規(guī)模推廣使用的顆粒劑，并于2022年10月成功獲批上市，成為首個(gè)嚴(yán)格按照中藥3.2類新藥審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)獲批的治療新冠肺炎的中藥新藥。但截至目前，關(guān)于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究尚未見報(bào)道。中藥指紋/特征圖譜能夠較為全面地體現(xiàn)中藥復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)中[4-6]。

SHG處方藥味眾多、成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立SHG的特征圖譜，采用20批制劑生成對照特征圖譜，通過UHPLC-Q-TOF-MS對10個(gè)共有峰全部進(jìn)行化學(xué)成分指認(rèn)，并歸屬其處方藥味來源。此外還采用定向分離技術(shù)對其中3個(gè)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、文獻(xiàn)報(bào)道較少的特征峰進(jìn)行定向分離，進(jìn)而采用MS、NMR技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，首次將2D NMR技術(shù)應(yīng)用于特征峰7和10的結(jié)構(gòu)研究中。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC特征圖譜能夠較為科學(xué)全面地評(píng)價(jià)SHG的質(zhì)量，為其臨床有效和質(zhì)量可控提供保障，為水提工藝的中藥新藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)，亦可為《中國藥典》處方藥味的質(zhì)量控制提供有益補(bǔ)充。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Fisher Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀（DAD紫外檢測器），Agilent 1290型超高壓液相色譜儀（DAD紫外檢測器），Agilent 6538 Q-TOF-MS質(zhì)譜檢測器，電噴霧（ESI）離子源，均為美國安捷倫公司；Bruker AscendTM 400型超導(dǎo)核磁共振譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器），德國Bruker公司，5 mm核磁共振樣品管；Mettler Toledo XP6型電子分析天平，Mettler Toledo AL204型電子分析天平，德國梅特勒公司；KQ500DB型數(shù)控超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；Milli-Q型超純水儀，美國密理博公司。

1.2 試劑

甲醇、乙酸，均為色譜純，分別購自默克公司及賽默飛世爾科技有限公司；氘代二甲基亞砜（DMSO-D，氘代純度：99.8%），氘代氯仿（Chloroform-D，氘代純度：99.8%），均為青島騰龍微波科技有限公司；其他試劑均為分析純；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012）。

1.3 SHG

共20批，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為200201、200202、200203、200204、200205、200206、200207、200208、200209、200210、200211、200212、200213、200214、200601、200602、200603、210401、210402、210403，分別編號(hào)S1～S20。其中200201～200214、210402為臨床實(shí)踐批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱為Waters Atlantis T3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇- 0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，0%甲醇；5～25 min，0%～15%甲醇；25～60 min，15%～55%甲醇；60～75 min，55%～100%甲醇；75～80 min，100%甲醇；檢測波長為250 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。用于質(zhì)譜檢測時(shí)0.1%磷酸水溶液改為0.1%醋酸水溶液。

2.1.2 質(zhì)譜條件：電噴霧ESI離子源，正、負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為4000 V，霧化器壓力為344.738 kPa（50 psi），干燥氣體積流量10 L/min，干燥氣溫度350 ℃，源內(nèi)裂解電壓150 V，傳輸電壓65 V，質(zhì)量數(shù)掃描范圍/50～2000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 特征圖譜對照品溶液的制備 取紫花前胡苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成含紫花前胡苷0.15 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.2 特征峰指認(rèn)對照品溶液的制備

（1）單標(biāo)對照品儲(chǔ)備液的制備：分別取對照品適量，精密稱定，用50%甲醇制成含腺嘌呤、尿苷、鳥苷、肌苷、5-羥甲基糠醛、木蘭苷A、佛手酚-5-- β--吡喃葡萄糖苷、紫花前胡苷、6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷、茴香酸對羥基苯乙酯（用甲醇為溶劑）各200 μg/mL的溶液，即得單標(biāo)對照品儲(chǔ)備溶液。

本區(qū)位于燕山山地和太行山山地，是京津冀的生態(tài)屏障，也是平原地區(qū)眾多城市的水源涵養(yǎng)區(qū)。植被退化，水土流失嚴(yán)重，水源涵養(yǎng)能力差。主導(dǎo)基礎(chǔ)功能為水源涵養(yǎng)和土壤保持，水土保持的重點(diǎn)是建設(shè)生態(tài)清潔小流域，通過生態(tài)修復(fù)、生態(tài)治理和生態(tài)保護(hù)三道防線，調(diào)節(jié)徑流、涵養(yǎng)水源、改善水質(zhì)、控制面源污染；同時(shí)要維護(hù)和提高土地生產(chǎn)力，減少入庫泥沙，加強(qiáng)土壤保持功能。

（2）單標(biāo)對照品溶液的制備：精密量取各單標(biāo)對照品儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇稀釋為約含茴香酸對羥基苯乙酯5 μg/mL，腺嘌呤、尿苷、鳥苷、佛手酚- 5--β--吡喃葡萄糖苷各20 μg/mL，5-羥甲基糠醛、肌苷、木蘭苷A、紫花前胡苷、6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷各40 μg/mL的溶液，即得各單標(biāo)對照品溶液。

（3）混合對照品溶液的制備：精密量取各單標(biāo)對照品儲(chǔ)備溶液適量至同一量瓶中，用50%甲醇稀釋得混合對照品溶液，質(zhì)量濃度同單標(biāo)對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

（1）SHG供試品溶液的制備：取本品適量，混勻，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，超聲處理（功率500 W、頻率40 kHz）30 min，搖勻，離心，取上清液，即得。

（2）各藥味供試品溶液的制備：取19個(gè)處方藥味（石膏除外）各1 g，參照SHG的制備工藝及供試品溶液制備方法，制得各藥味的供試品溶液。

2.3 特征圖譜的建立

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)為200602的SHG，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并取1份空白溶劑（水）按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件分別進(jìn)行檢測。經(jīng)考察，空白溶劑對供試品溶液的測試不存在干擾，專屬性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)200602）SHG，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄所得色譜圖。以紫花前胡苷為參照峰（分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有），計(jì)算主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算相應(yīng)的RSD。結(jié)果顯示，各主要色譜峰相對保留時(shí)間的RSD不高于0.10%，相對峰面積的RSD不高于1.20%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜的技術(shù)要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)200602）SHG，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)行檢測，每份樣品進(jìn)樣1次，記錄所得色譜圖。以紫花前胡苷為參照峰，計(jì)算主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算相應(yīng)的RSD。結(jié)果顯示，各主要色譜峰相對保留時(shí)間的RSD不高于0.33%，相對峰面積的RSD不高于2.55%，表明方法重復(fù)性良好，符合特征圖譜的技術(shù)要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)200602）SHG，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC色譜條件分別于制備后0、3、6、9、12、18、24、30、36 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣1次進(jìn)行檢測，記錄所得色譜圖。以紫花前胡苷為參照峰，計(jì)算主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，并計(jì)算相應(yīng)的RSD。結(jié)果顯示，各主要色譜峰相對保留時(shí)間的RSD不高于0.40%，相對峰面積的RSD不高于2.90%，表明供試品溶液常溫下在36 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，符合特征圖譜的技術(shù)要求。

2.3.5 多批次測定及對照特征圖譜生成 取20批SHG，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備各批次供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行檢測，并記錄生成的HPLC特征圖譜，將20批特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)系統(tǒng)（2012）”，選定10個(gè)共有峰為特征峰，生成對照特征圖譜（R），并計(jì)算各批次特征圖譜中各特征峰的相對保留時(shí)間，結(jié)果見圖1和表1。

根據(jù)多批次結(jié)果，擬定SHG特征圖譜標(biāo)準(zhǔn)：供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)10個(gè)特征峰，與參照物峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時(shí)間，應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)。相對保留時(shí)間規(guī)定值為0.11（峰1）、0.27（峰2）、0.36（峰3）、0.38（峰4）、0.41（峰5）、0.84（峰6）、0.92（峰7）、1.00［峰8（S）］、1.19（峰9）、1.29（峰10）。結(jié)果顯示，20批制劑的批間一致性良好，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.4 特征峰的化學(xué)成分指認(rèn)和組方藥味相關(guān)性研究

取“2.2.2”及“2.2.3”項(xiàng)下各對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測條件分別進(jìn)行HPLC及UPLC-Q-TOF-MS測定，對照品及供試品溶液的正、負(fù)總離子流圖及紫外色譜圖見圖2、3。

質(zhì)譜信息結(jié)合化合物色譜行為、對照品比對并參考相關(guān)文獻(xiàn)完成10個(gè)特征峰指認(rèn)，并歸屬處方藥味來源，結(jié)果見圖4和表2。指認(rèn)的特征峰依次為腺嘌呤（1號(hào)峰）、尿苷（2號(hào)峰）、鳥苷（3號(hào)峰）、肌苷（4號(hào)峰）、5-羥甲基糠醛（5號(hào)峰）、木蘭苷A（6號(hào)峰）、佛手酚-5--β--吡喃葡萄糖苷（7號(hào)峰）、紫花前胡苷（8號(hào)峰）、6′--(反式阿魏酰基)-紫花前胡苷（9號(hào)峰）及茴香酸對羥基苯乙酯（10號(hào)峰），其中腺嘌呤歸屬于麻黃、苦杏仁、羌活、廣藿香、蒼術(shù)、白術(shù)、焦六神曲、焦麥芽、地龍、徐長卿、葶藶子多味藥材，尿苷歸屬于厚樸、羌活、廣藿香、佩蘭、蒼術(shù)、白術(shù)、地龍、徐長卿、葶藶子多味藥材，鳥苷屬于羌活、廣藿香、地龍、徐長卿、葶藶子多味藥材，肌苷歸屬于地龍，5-羥甲基糠醛歸屬于焦三仙（焦山楂、焦六神曲、焦麥芽），木蘭苷A歸屬于厚樸，佛手酚-5--β--吡喃葡萄糖苷、紫花前胡苷、6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷及茴香酸對羥基苯乙酯4個(gè)成分歸屬于羌活。

圖1 20批制劑的HPLC特征圖譜及其對照特征圖譜(R)

表1 20批制劑的相對保留時(shí)間

圖2 混合對照品溶液(A)及供試品溶液(B)的總離子流圖(ESI?和ESI?)及紫外色譜圖(UV)

2.5 3個(gè)特征峰的定向分離及結(jié)構(gòu)確證

2.5.1 3個(gè)特征峰的定向分離 制備色譜柱為Waters Atlantis T3 C18（250 mm×50 mm，10 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，0%甲醇；5～25 min，0%～15%甲醇；25～60 min，15%～55%甲醇；60～75 min，55%～100%甲醇；75～80 min，100%甲醇；檢測波長為250 nm；進(jìn)樣量為10 mL；體積流量為15 mL/min；進(jìn)樣質(zhì)量濃度為200 mg/mL；出峰收集，結(jié)合分析型液相進(jìn)行峰確認(rèn)。合并多次收集的3個(gè)成分，進(jìn)一步純化后待用。

1-腺嘌呤 2-尿苷 3-鳥苷 4-肌苷 5-5-羥甲基糠醛 6-木蘭苷A 7-佛手酚-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 8-紫花前胡苷 9-6′-O-(反式阿魏?；?-紫花前胡苷 10-茴香酸對羥基苯乙酯

圖4 SHG及19個(gè)處方藥味的HPLC圖

2.5.2 3個(gè)特征峰的結(jié)構(gòu)確證 采用NMR（1H- NMR、13C-NMR、DEPT、COSY、HSQC、HMBC）測定，結(jié)合MS結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2，氫譜及碳譜數(shù)據(jù)如下。

峰7的1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.38 (1H, d,= 9.8 Hz, H-3), 8.49 (1H, dd,= 9.8, 0.5 Hz, H-4), 7.49 (1H, s, H-8), 7.33 (1H, dd,= 2.3, 0.9 Hz, H-9), 8.03 (1H, d,= 2.3 Hz, H-10), 4.95 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 3.40 (1H, m, H-2′), 3.28 (1H, m, H-3′), 3.20 (1H, m, H-4′), 3.35 (1H, m, H-5′), 3.74 (1H, ddd,= 11.6, 5.0, 1.8 Hz, H-6′), 3.51 (1H, m, H-6′), 5.65 (1H, d,= 5.7 Hz, 2′-OH), 5.08 (1H, d,= 5.3 Hz, 3′-OH), 5.17 (1H, d,= 4.9 Hz, 4′-OH), 4.68 (1H, dd,= 6.1, 5.1 Hz, 6′-OH);13C-NMR (400 MHz, DMSO-6): 160.54 (C-2), 113.25 (C-3), 140.61 (C-4), 108.00 (C-4a), 152.25 (C-5), 115.64 (C-6), 157.63 (C-7), 95.47 (C-8), 147.67 (C-8a), 105.95 (C-9), 146.97 (C-10), 104.43 (C-1′), 74.29 (C-2′), 76.65 (C-3′), 70.16 (C-4′), 77.95 (C-5′), 61.32 (C-6′). 質(zhì)譜、氫譜及碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16-18]，判斷特征峰7為化合物佛手酚-5--β--吡喃葡萄糖苷，分子結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

表2 SHG中10個(gè)特征峰的UHPLC-QTOFMS鑒定

“/”表示該模式下質(zhì)譜幾乎無響應(yīng)

“/” indicates that there is almost no MS response in this mode

峰9的1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.16 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 7.82 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 7.39 (1H, s, H-5), 6.74 (1H, s, H-8), 3.22 (2H, d,= 9.1 Hz, H-9), 4.90 (1H, d,= 8.6 Hz, H-10), 1.31 (3H, s, H-12), 1.12 (3H, s, H-13), 4.50 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′), 2.94 (1H, m, H-2′), 3.18 (1H, m, H-3′), 3.09 (1H, m, H-4′), 3.48 (1H, m, H-5′), 4.39 (1H, dd,= 11.6, 1.9 Hz, H-6′), 4.17 (1H, dd,= 11.7, 7.7 Hz, H-6′), 7.16 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′′), 6.69 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′′), 6.88 (1H, dd,= 8.2, 1.8 Hz, H-6′′), 7.46 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7′′), 6.34 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8′′), 4.86 (1H, d,= 4.8 Hz, 2′-OH), 5.02 (1H, d,= 4.9 Hz, 3′-OH), 5.18 (1H, d,= 5.4 Hz, 4′-OH), 9.57 (1H, s, 4′′-OH), 3.75 (3H, s, 3′′-OCH3);13C- NMR (400 MHz, DMSO-6): 160.88 (C-2), 111.46 (C-3), 144.98 (C-4), 112.74 (C-4a), 124.43 (C-5), 125.69 (C-6), 163.37 (C-7), 97.29 (C-8), 155.43 (C-8a), 29.67 (C-9), 90.05 (C-10), 77.66 (C-11), 23.55 (C-12), 21.31 (C-13), 97.63 (C-1′), 73.88 (C-2′), 77.13 (C-3′), 70.95 (C-4′), 73.86 (C-5′), 64.14 (C-6′), 125.82 (C-1′′), 111.73 (C-2′′), 148.30 (C-3′′), 149.83 (C-4′′), 115.82 (C-5′′), 123.45 (C-6′′), 145.53 (C-7′′), 114.61 (C-8′′), 166.90 (C-9′′), 56.09 (3′′-OCH3)。質(zhì)譜、氫譜及碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，判斷特征峰9為化合物為6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷，分子結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

圖5 3個(gè)特征峰的結(jié)構(gòu)

峰10的1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.97 (2H, d,= 9.0 Hz, H-2, 6), 6.91 (2H, d,= 9.0 Hz, H-3, 5), 7.14 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.78 (2 H, d,= 8.6 Hz, H-3′, 5′), 2.99 (2H, t,= 7.0 Hz, H-7′), 4.45 (2H, t,= 7.0 Hz, H-8′), 7.26 (1H, s, 4′-OH), 3.85 (3H, s, 4-OCH3);13C-NMR (400 MHz, DMSO-6): 122.72 (C-1), 131.61 (C-2, 6), 113.63 (C-3, 5), 163.37 (C-4), 131.61 (C-6), 166.42 (C-7), 130.15 (C-1′), 130.12 (C-2′, 6′), 115.38 (C-3′, 5′), 154.27 (C-4′), 115.38 (C-5′), 34.43 (C-7′), 65.47 (C-8′), 55.43 (4-OCH3)。質(zhì)譜、氫譜及碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，判斷峰10為化合物茴香酸對羥基苯乙酯，分子結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

SHG依據(jù)原方臨床用藥方式及經(jīng)典名方注冊申報(bào)要求采用水提工藝制備，主要含極性較大的化學(xué)成分，因此，采用對該類成分具有較好保留的Waters Atlantis T3 C18色譜柱；采用DAD檢測器對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)250 nm下色譜峰較豐富，響應(yīng)較好，且基線較為平穩(wěn)，因此采用250 nm作為檢測波長；對比流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液及甲醇-0.1%磷酸水溶液的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇由于洗脫能力較乙腈稍弱，對于該方中極性較大的成分分離效果較好，因此，選擇甲醇- 0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。柱溫、體積流量、色譜柱及液相品牌等系統(tǒng)考察結(jié)果顯示該方法耐用性良好。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑、提取方式及提取時(shí)間的提取效果。結(jié)果以水為提取溶劑色譜圖25 min之前的極性較大的色譜峰較豐富，響應(yīng)較均勻；超聲與回流色譜峰的豐富程度與響應(yīng)無明顯差異；提取30 min即可提取充分。結(jié)合水提工藝特點(diǎn)及操作的簡便性，選擇水為溶劑，超聲提取30 min。

3.3 特征峰與功效關(guān)聯(lián)性分析

君藥厚樸中的水溶性成分magnoloside A（木蘭苷A，峰6）具有抑制平滑肌痙攣的作用以及顯著的抗氧化活性[10,20]；臣藥羌活中的香豆素類成分佛手酚-5--β--吡喃葡萄糖苷（峰7）、紫花前胡苷（峰8）及6′--(反式阿魏?；?-紫花前胡苷（峰9）是羌活祛風(fēng)解表的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中紫花前胡苷具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛活性[21]；臣藥焦三仙炮制過程中產(chǎn)生的新物質(zhì)5-羥甲基糠醛（峰5）具有抗炎、抗菌等生物活性[22-23]；佐藥地龍中的腺嘌呤（峰1）、鳥嘌呤（峰2）、鳥苷（峰3）、肌苷（峰4）、尿苷（峰2）等核苷類成分具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗菌等多種生物活性，且含量較高[24-25]。

綜上所述，SHG特征圖譜中的特征峰是其潛在的藥效物質(zhì)，與其功能主治具有一定的關(guān)聯(lián)性，具體研究有待后續(xù)進(jìn)一步通過藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)基于SHG的水提工藝特點(diǎn)開展特征圖譜相關(guān)研究，建立的特征圖譜較全面地反映了該方的整體化學(xué)信息，為其質(zhì)量的科學(xué)合理評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。但是由于時(shí)間關(guān)系，本研究僅對10個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)，后續(xù)還需進(jìn)行更加系統(tǒng)的化學(xué)成分辨識(shí)，并對功效成分進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，以期揭示SHG的作用機(jī)制，并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供更完善的參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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HPLC characteristic chromatogram of Sanhan Huashi Granules

YU Gui-fang1, 2, 3, HU Jun-hua1, 2, 3, ZHOU Mao1, 2, 3, ZHOU En-li1, 2, 3, DAI Cui-hong1, 2, 3, LI Hai-bo1, 2, 3, ZHANG Chen-feng1, 2, 3, WANG Zhen-zhong1, 2, 3, WANG Tuan-jie1, 2, 3,XIAO Wei1, 2, 3

1. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. National & Local Joint Engineering Research Center of TCM Intelligent Manufacturing Technology, Lianyungang 222001, China

To establish the characteristic chromatogram of Sanhan Huashi Granules (散寒化濕顆粒, SHG) by HPLC, identify the components of all characteristic peaks and the origin of medicinal materials,so as to provide reference for its overall quality control.The separation was developed on Waters Atlantis T3 C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) by gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid and the analytes were detected at 250 nm. The column temperature was 30 ℃ and the flow rate was at 1.0 L/min. The 10 characteristic peaks were chemically identified by UHPLC-QTOF MS, NMR, reference substance and directional separation, which were also assigned to individual herbs. Furthermore,the consistency of 20 batches of preparations was evaluated.The HPLC characteristic chromatogram of SHG was established. The consistency of 20 batches was good.Ten characteristic peaks [adenine (peak 1), uridine (peak 2), guanosine (peak 3), inosine (peak 4), 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde (peak 5), magnoloside A (peak 6), bergaptol-5--β--glucopyranoside (peak 7), nodakenin (peak 8), 6′--feruloylnodakenin (peak 9), 4-hydroxyphenethylanisate (peak10)] were chemically identified and assigned to individual herbs [peak 1originated from Mahuang(), Kuxingren (), Qianghuo (et, NRR),Guanghuoxiang (, PH), Cangzhu (, AR), Baizhu (, AMR), Jiaoliushenqu ((CMMF), Jiaomaya (, CHFG), Dilong (), Xuchangqing (et, CPRR) and Tinglizi (, DSLS), peak 2 originated from Houpo (, MOC),NRR, PH, Peilan (),AR,AMR,, CPRR and DSLS, peak 3originated from NRR,PH,, CPRR and DSLS, peak 4 originated from, peak 5 originated from, CHFG andCMMF, peak 6 originated from MOC,peak 7—10 originated from NRR].The established HPLC characteristic chromatogram method of SHG was simple, stable and repeatable, and the characteristics of the chemical composition of SHG were preliminarily described. It lays a foundation for the promotion of its quality standard, and also provides a reference for the quality standard research of other classical famous prescriptions.

classical famous prescription; Sanhan Huashi Granules; HPLC; characteristic chromatogram; adenine; uridine; guanosine; inosine; 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde; magnoloside A; bergaptol-5--β-glucopyranoside; nodakenin; 6′--feruloylnodakenin; 4-hydroxyphenethylanisate

R283.6

A

0253 - 2670(2023)13 - 4168 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.010

2023-01-16

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“公共安全風(fēng)險(xiǎn)防控與應(yīng)急技術(shù)裝備”重點(diǎn)專項(xiàng)—散寒化濕顆粒治療新冠肺炎的新藥創(chuàng)制示范研究（2022YFC 0868300）

于桂芳（1983—），女，碩士，高級(jí)工程師/副主任中藥師，從事中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。Tel: 15189010279 E-mail: gfyu100@126.com

通信作者：肖 偉（1959—），男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤巹?chuàng)制、制藥工程學(xué)。Tel: (0518)81152337 Fax: (0518)81152327 E-mail: kanionlunwen@163.com

王團(tuán)結(jié)（1986—），男，碩士，高級(jí)工程師，從事中藥新藥研發(fā)。Tel: 15062986099 E-mail: union_wang@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]