TRIP13基因新突變導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯為特征的女性不孕

呂香江，郭靜，林戈,

基因新突變導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯為特征的女性不孕

呂香江1，郭靜2，林戈1,2

1. 中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410078 2. 中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院，長(zhǎng)沙 410008

卵母細(xì)胞成熟阻滯(oocyte maturation arrest，OMA)是指卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程異常而導(dǎo)致的卵母細(xì)胞成熟障礙的一種罕見(jiàn)的臨床現(xiàn)象，也是女性原發(fā)性不孕的原因之一。這類患者臨床上常表現(xiàn)為：反復(fù)促排卵后無(wú)法獲得成熟卵子，并且未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后仍不能成熟。迄今研究發(fā)現(xiàn)、和基因突變與OMA有關(guān)，但是有關(guān)OMA的遺傳學(xué)分子因素及機(jī)制研究仍不完整。本研究通過(guò)收集臨床上輔助生殖助孕過(guò)程中35名反復(fù)出現(xiàn)OMA的原發(fā)不孕女性患者的外周血，提取其基因組DNA進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析，對(duì)疑似致病突變進(jìn)行驗(yàn)證及家系共分離分析，發(fā)現(xiàn)先證者1的基因9號(hào)外顯子存在純合突變c.859A>G，突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)編碼的287位的氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(p.Ile287Val)；先證者2的基因1號(hào)外顯子存在純合突變c.77A>G，突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)編碼的26位的氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼?p.His26Arg)；先證者3的基因的4號(hào)和12號(hào)外顯子存在復(fù)合雜合突變c.409G>A和c.1150A>G，c.409G>A突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)編碼的137位的氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)樘於０?p.Asp137Asn)，c.1150A>G突變導(dǎo)致對(duì)應(yīng)編碼的384位的氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楦拾彼?p.Ser384Gly)，三名患者所攜帶的突變均引起基因編碼的TRIP13蛋白發(fā)生錯(cuò)義突變。其中3個(gè)突變位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。此外，通過(guò)在HeLa細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染四個(gè)突變質(zhì)粒，并進(jìn)行體外免疫印記實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些突變會(huì)造成不同程度的TRIP13蛋白表達(dá)的增加以及細(xì)胞增殖速率異常。本文總結(jié)了既往研究報(bào)道的基因突變位點(diǎn)，豐富了致病基因突變譜，為進(jìn)一步研究基因?qū)е翺MA的致病機(jī)制及臨床的診斷和治療提供了依據(jù)。

卵母細(xì)胞成熟阻滯；；減數(shù)分裂；女性不孕

卵母細(xì)胞成熟阻滯(oocyte maturation arrest，OMA)是女性不孕的一種常見(jiàn)病因，患者因卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程異常導(dǎo)致卵母細(xì)胞停留在GV期(germinal vesicle)或MI期(metaphase I)而不能形成成熟卵子[1]。在臨床輔助生殖技術(shù)中，體外成熟(maturation，IVM)技術(shù)可以在體外模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟環(huán)境，將未成熟的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)至MII期(metaphase II)，移植后使患者獲得成功妊娠[2]，但仍有很多患者無(wú)法通過(guò)輔助生殖技術(shù)解決不明原因的卵子不熟問(wèn)題。

本文報(bào)道了3例因卵母細(xì)胞成熟阻滯導(dǎo)致不孕的患者，通過(guò)全外顯子組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)她們都攜帶基因突變，患者1攜帶基因純合錯(cuò)義突變c.859A>G(p.Ile287Val)，患者2攜帶基因純合錯(cuò)義突變c.77A>G(p.His26Arg)，患者3攜帶基因復(fù)合雜合錯(cuò)義突變c.409G>A (p.Asp137Asn)和c.1150A>G(p.Ser384Gly)。通過(guò)對(duì)HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些突變均導(dǎo)致HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白表達(dá)增加，此外，進(jìn)一步細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明突變使得HeLa細(xì)胞增殖速率出現(xiàn)了不同程度的異常。最后，本文總結(jié)了既往文獻(xiàn)報(bào)道的基因突變位點(diǎn)和臨床表型譜。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及臨床資料收集

患者1，女性，28歲，原發(fā)不孕8年。患者2，女性，30歲，原發(fā)不孕4年。患者3，女性，29歲，原發(fā)不孕2年。患者均就診于中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院。在獲得中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)倫理號(hào)：LL-SC-2018-009)后，收集患者的病史、促排方案、助孕周期與結(jié)局等臨床資料；同時(shí)經(jīng)患者及家屬知情同意后，收集患者及親屬外周血。

1.2 全外顯子組測(cè)序及家系驗(yàn)證

收集患者及親屬外周血，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen，德國(guó))提取基因組DNA樣本。將患者外周血中提取的基因組DNA送至武漢希望組生物科技有限公司進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析。利用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序，獲得100×的測(cè)序reads。將reads進(jìn)行基因組匹配、摳取變異、過(guò)濾去除低質(zhì)量的變異位點(diǎn)，保留高質(zhì)量的變異位點(diǎn)。將高質(zhì)量的變異位點(diǎn)與對(duì)照人群中的變異位點(diǎn)進(jìn)行比較，篩選在對(duì)照人群中沒(méi)有或罕見(jiàn)的變異位點(diǎn)；再結(jié)合變異位點(diǎn)所在序列的保守性和突變有害性預(yù)測(cè)，對(duì)可疑突變位點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)先級(jí)排序。針對(duì)排序靠前的變異，再進(jìn)行Sanger驗(yàn)證。如果Sanger測(cè)序結(jié)果與全外顯子組測(cè)序結(jié)果一致，將該變異作為候選致病突變進(jìn)行下一步分析。

1.3 突變位點(diǎn)的致病性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變位點(diǎn)發(fā)生的頻率進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用REVEL軟件，Polyphen2、Mutation Taster工具對(duì)突變位點(diǎn)的致病性進(jìn)行預(yù)測(cè)；根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics，ACMG)發(fā)布的最新版基因變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南將檢測(cè)到的變異分類為“致病性變異”、“疑似致病性變異”、“臨床意義未明變異”、“疑似良性變異”或“良性變異”。使用UGENE軟件對(duì)不同物種基因突變位點(diǎn)所在序列進(jìn)行保守性分析。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載TRIP13蛋白的氨基酸序列，將四個(gè)突變位點(diǎn)的氨基酸分別改成突變后的氨基酸，利用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模工具預(yù)測(cè)野生型(wild-type，WT)和四個(gè)突變蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，選擇同一模板且建模質(zhì)量高的的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，然后使用PyMol軟件對(duì)野生型和突變型蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。本文選擇5vqa.1.A模板，覆蓋序列大于99.5%，相似度高；通過(guò)GMQE(global model quality estimate)值和QMEANDisCo Global值評(píng)估預(yù)測(cè)模型質(zhì)量，數(shù)值越接近1建模質(zhì)量越好，本文預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)GMQE值為0.8，QMEANDisCo Global值為0.76±0.05，為較高質(zhì)量預(yù)測(cè)模型。

1.4 構(gòu)建突變質(zhì)粒

野生型質(zhì)粒由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建，將基因全長(zhǎng)編碼序列克隆到帶有FLAG標(biāo)簽的pENTER載體中。通過(guò)SnapGene軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建4種突變質(zhì)粒的雙向引物，使用Mut Express II快速突變?cè)噭┖?Vazyme，南京)分別向野生型質(zhì)粒中引入4個(gè)突變(c.77A>G，c.409G>A，c.859A>G，c.1150A>G)。按照突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)所示反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)野生型質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后去除原始模板并重組質(zhì)粒，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到4種突變質(zhì)粒。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HeLa細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM (Invitrogen，美國(guó))培養(yǎng)基中，并放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

使用GeneTwinTM基因轉(zhuǎn)染試劑(Biomed，北京)將野生型質(zhì)粒和4個(gè)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。具體步驟如下：在6孔板的每個(gè)孔中各接種1～2×105個(gè)HeLa細(xì)胞，24 h后(細(xì)胞密度在70%～90%時(shí))，將2 μg質(zhì)粒DNA和50 μL DMEM培養(yǎng)基混勻制成DNA稀釋液，并將6 μL轉(zhuǎn)染試劑GeneTwinTM和44 μL opti-MEM (Invitrogen，美國(guó))混勻制成GeneTwinTM稀釋液。將GeneTwinTM稀釋液加到DNA稀釋液中，吹打混勻后，室溫放置5 min，獲得100 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物。最后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物直接加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕搖細(xì)胞板混勻，轉(zhuǎn)染48 h后收樣。

1.6 免疫熒光(immunofluorescence)實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞接種在玻片上。接種24 h后轉(zhuǎn)染野生型和突變質(zhì)粒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收細(xì)胞進(jìn)行處理。在室溫下用4%多聚甲醛固定液固定30 min，并用0.1% Triton X-100滲透15 min。之后用含5% BSA的PBS封閉30 min，將樣品與FLAG抗體(Invitrogen，美國(guó)) 4℃孵育過(guò)夜，抗體稀釋度為1∶500。PBS洗滌3次后，加入熒光二抗(Invitrogen，美國(guó))避光孵育1 h，二抗稀釋度為1∶1000，并用DAPI (Invitrogen，美國(guó))染細(xì)胞核。最后在正置熒光生物顯微鏡(ZEISS，德國(guó))下成像拍片。

2017年12月公布的《普通高中語(yǔ)文課程標(biāo)準(zhǔn)》第一次明確了語(yǔ)文學(xué)科核心素養(yǎng)的地位與內(nèi)涵。新課程標(biāo)準(zhǔn)要求語(yǔ)文教育“以核心素養(yǎng)為本，推進(jìn)語(yǔ)文課程深層次的改革”①，并明確語(yǔ)文核心素養(yǎng)“主要包括語(yǔ)言建構(gòu)與運(yùn)用、思維發(fā)展與提升、審美鑒賞與創(chuàng)造、文化傳承與理解四個(gè)方面”②。語(yǔ)文核心素養(yǎng)更為注重學(xué)生的主動(dòng)性，為作文自改教學(xué)策略的探索，提供了新的方向。

1.7 蛋白質(zhì)印記(Western blot)實(shí)驗(yàn)

用RIPA裂解緩沖液(強(qiáng))裂解轉(zhuǎn)染野生型和突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞，離心后取上清液與4×上樣緩沖液混合并在95℃加熱使蛋白質(zhì)變性。通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用5%的脫脂牛奶封閉1 h，將PVDF膜與FLAG抗體4℃孵育過(guò)夜，抗體稀釋度為1∶1000。最后用TBST (含1% Tween-20)洗滌3次后，用二抗(Invitrogen，美國(guó))室溫孵育1 h并進(jìn)行顯影，二抗稀釋度為1∶5000。

1.8 細(xì)胞增殖(cell proliferation)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(上海李記科技有限公司，上海)進(jìn)行檢測(cè)。使用96孔板進(jìn)行接種，將轉(zhuǎn)染了野生型質(zhì)?；蛲蛔冑|(zhì)粒的HeLa細(xì)胞分別接種到培養(yǎng)板上，每種質(zhì)粒的細(xì)胞接種30個(gè)孔，每個(gè)孔接種1000個(gè)細(xì)胞。6 h后，在每種質(zhì)粒的5個(gè)重復(fù)孔中分別加入10微升CCK8(cell counting kit)待測(cè)藥物孵育2 h，用多功能微孔板檢測(cè)器(BIOTEK，美國(guó))測(cè)量每個(gè)孔在450 nm處的吸光度。在第一次測(cè)量吸光度后的24 h、48 h、72 h、96 h、120 h各檢測(cè)一次，每次測(cè)量5個(gè)重復(fù)孔。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 9軟件以及統(tǒng)計(jì)分析方法Student’s-test和方差分析處理數(shù)據(jù)，<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 患者的臨床表現(xiàn)

本研究納入的研究對(duì)象主要病例信息如下：

患者1，28歲，女，原發(fā)不孕8年。在ICSI (intracytoplasmic sperm injection)中使用降調(diào)節(jié)短效長(zhǎng)方案獲得17枚卵母細(xì)胞，其中3枚卵退化，剩余14枚卵均不成熟，均停留在MI期，且經(jīng)體外成熟培養(yǎng)(IVM)后仍未成熟。

患者2，30歲，女，原發(fā)不孕4年，嘗試了3次體外助孕。第一次體外受精(fertilization，IVF)中使用降調(diào)節(jié)短效長(zhǎng)方案獲得2枚卵母細(xì)胞，均不成熟；第二次IVF中使用降調(diào)節(jié)短效長(zhǎng)方案獲得11枚卵母細(xì)胞，其中10枚卵子都未成熟；第三次的ICSI中使用拮抗劑方案獲得7枚卵母細(xì)胞，均未成熟，其中4枚阻滯在GV期，3枚阻滯在MI期。

患者3，29歲，女，原發(fā)不孕2年。在兩個(gè)IVF周期中，第一次使用拮抗劑方案獲得了21枚卵母細(xì)胞，其中19枚卵母細(xì)胞未成熟，另外2枚卵成熟但未受精；第二次使用拮抗劑方案獲得了23枚卵母細(xì)胞，均未成熟(表1)。

表1 患者的臨床特征

2.2 全外顯子組測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)患者攜帶TRIP13基因突變

患者全外顯子組測(cè)序分析和Sanger驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)：家族1的先證者基因9號(hào)外顯子上攜帶純合突變c.859A>G(p.Ile287Val)，患者的父母均攜帶c.859A>G雜合突變，符合常染色體隱性遺傳致病模式(圖1，A和B)。c.859A>G突變表現(xiàn)為基因9號(hào)外顯子的859位點(diǎn)的腺嘌呤突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤，從而引起錯(cuò)義突變，對(duì)應(yīng)編碼的287位的氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(p.Ile287Val)。該突變位點(diǎn)位于基因序列的ATP酶結(jié)構(gòu)域上，且該位點(diǎn)氨基酸在6個(gè)不同物種中高度保守(圖1E)；查閱gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)，該位點(diǎn)在人群中突變的頻率為0(表2)；根據(jù)ACMG對(duì)基因變異的致病性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定該變異為臨床意義未明變異(PM1+PM2+PP3)；使用REVEL功能學(xué)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)，其結(jié)果為0.687，低于預(yù)測(cè)軟件的參考閾值0.75(表3)。家族2的先證者基因1號(hào)外顯子上攜帶純合突變c.77A>G(p.His26Arg)，患者父母和兄弟均未攜帶該位點(diǎn)的突變。c.77A>G突變表現(xiàn)為基因1號(hào)外顯子的77位點(diǎn)的腺嘌呤突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤，從而引起錯(cuò)義突變，對(duì)應(yīng)編碼的26位的氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼?p.His26Arg)，該位點(diǎn)的突變已有文獻(xiàn)報(bào)道[6,16]。該突變位點(diǎn)位于基因序列的N端，且該位點(diǎn)氨基酸在5個(gè)不同物種中保守，在小鼠()中不保守；該位點(diǎn)在人群中突變的頻率為0；ACMG評(píng)級(jí)為致病(PM2+PP5+BP1+ BP4)；REVEL軟件致病性預(yù)測(cè)結(jié)果為0.17，低于預(yù)測(cè)軟件的參考閾值0.75。家族3的先證者基因4和12號(hào)外顯子上攜帶復(fù)合雜合突變c.409G> A (p.Asp137Asn)和c.1150A>G(p.Ser384Gly)。其中，c.409G>A突變遺傳自父親，c.1150A>G突變遺傳自母親，且父母均為雜合突變，符合常染色體隱性遺傳致病模式。c.409G>A突變表現(xiàn)為基因4號(hào)外顯子的409位點(diǎn)的鳥(niǎo)嘌呤突變?yōu)橄汆堰?，從而引起錯(cuò)義突變，對(duì)應(yīng)編碼的137位的氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)樘於０?p.Asp137Asn)；c.1150A>G突變表現(xiàn)為基因12號(hào)外顯子的1150位點(diǎn)的腺嘌呤突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤，從而引起錯(cuò)義突變，對(duì)應(yīng)編碼的384位的氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楦拾彼?p.Ser384Gly)。c.409G>A突變位點(diǎn)位于基因序列的N端，且該位點(diǎn)氨基酸在5個(gè)不同物種中保守，在雞()中不保守；該位點(diǎn)在人群中突變的頻率為0；ACMG評(píng)級(jí)為臨床意義未明變異(PM2+PP3)；REVEL軟件致病性預(yù)測(cè)結(jié)果為0.616，低于預(yù)測(cè)軟件的參考閾值0.75。c.1150A>G突變位點(diǎn)位于基因序列的C端，且該位點(diǎn)氨基酸在6個(gè)不同物種中高度保守；該位點(diǎn)在人群中突變的頻率為0；ACMG評(píng)級(jí)為臨床意義未明變異(PM2+PP3)；REVEL軟件致病性預(yù)測(cè)結(jié)果為0.823，高于預(yù)測(cè)軟件的參考閾值0.75。通過(guò)PolyPhen2和Mutation Taste工具對(duì)四個(gè)突變位點(diǎn)的致病性預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

PyMol軟件對(duì)比結(jié)果顯示這四種錯(cuò)義突變使得TRIP13蛋白結(jié)構(gòu)中氨基酸間的氫鍵發(fā)生了改變；另外，突變p.His26Arg中由于氫鍵的改變使得該位點(diǎn)氨基酸與與原有相連接的氨基酸斷開(kāi)并且與其他位點(diǎn)的氨基酸形成新的連接，突變p.Asp137Asn和p.Ile287Val中由于氫鍵的增加使得該位點(diǎn)氨基酸與其他位點(diǎn)的氨基酸形成新的連接。編碼TRIP13蛋白的26位氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼?p.His26Arg)，突變前的組氨酸與編碼TRIP13蛋白71位氨基酸的谷氨酰胺之間有一個(gè)氫鍵，與72位的絲氨酸有兩個(gè)氫鍵，與133位的組氨酸有一個(gè)氫鍵，突變后形成的精氨酸與TRIP13蛋白72位氨基酸的絲氨酸之間的一個(gè)氫鍵斷開(kāi)，與133位的組氨酸相連接的氫鍵斷開(kāi)，另外與編碼TRIP13蛋白71位氨基酸的谷氨酰胺、72位的絲氨酸以及104位的谷氨酸形成新的氫鍵(圖1C)；編碼TRIP13蛋白的137位氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)樘於０?p.Asp137Asn)，突變前的天冬氨酸與周圍氨基酸均未形成氫鍵，突變后形成的天冬酰胺與編碼TRIP13蛋白134位氨基酸的甘氨酸形成新的氫鍵；編碼TRIP13蛋白的287位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸(p.Ile287Val)，突變前的異亮氨酸只與編碼TRIP13蛋白283位氨基酸的谷氨酰胺之間有一個(gè)氫鍵，突變后形成的纈氨酸與編碼TRIP13蛋白290位氨基酸的組氨酸形成新的氫鍵；編碼TRIP13蛋白的384位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楦拾彼?p.Ser384Gly)，突變前的絲氨酸與編碼TRIP13蛋白387位氨基酸的纈氨酸之間有兩個(gè)氫鍵，與388位亮氨酸有一個(gè)氫鍵，突變后形成的甘氨酸與編碼TRIP13蛋白387位氨基酸的纈氨酸之間的一個(gè)氫鍵斷開(kāi)。同時(shí)，對(duì)比結(jié)果顯示四個(gè)突變對(duì)TRIP13蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)都有一定的影響(圖1D)。我們推測(cè)，這些突變可能通過(guò)影響蛋白內(nèi)部的氫鍵結(jié)合造成了不同程度蛋白結(jié)構(gòu)的改變。

表2 3例患者TRIP13基因突變位點(diǎn)的信息

表3 3例患者TRIP13基因突變位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)

*變異評(píng)級(jí)(ACMG分級(jí))是根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的最新版基因變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南判定變異評(píng)級(jí)。

2.3 蛋白定量實(shí)驗(yàn)證明突變HeLa細(xì)胞TRIP13蛋白表達(dá)上升

為了進(jìn)一步明確基因突變位點(diǎn)的致病性，本研究在HeLa細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染了攜帶FLAG標(biāo)簽的c.77A>G、c.409G>A、c.859A>G、c.1150A>G突變質(zhì)粒。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)這四種突變對(duì)TRIP13蛋白在HeLa細(xì)胞中的定位未造成明顯改變：攜帶野生型與突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2A)。此外，免疫印記結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)TRIP13蛋白豐度都有所上升(圖2B)。經(jīng)進(jìn)一步定量分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染c.77A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白約是轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白的1.5倍(=0.027)；轉(zhuǎn)染c.409G>A突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白約是轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白的1.5倍(=0.0045)；轉(zhuǎn)染c.859A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白顯著增加，約是轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白的2.5倍(=0.0107)；轉(zhuǎn)染c.1150A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白顯著增加，約是轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白的2倍(=0.0444)(圖2C)。

A：先證者家系圖譜；B：家系突變位點(diǎn)基因檢測(cè)結(jié)果；C：TRIP13蛋白氨基酸和氫鍵的變化，紅色名稱表示發(fā)生突變的氨基酸，黑色箭頭表示變化后的氫鍵，黑色名稱表示突變后與該位點(diǎn)相連的氨基酸；D：TRIP13蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，黑色箭頭指向的位置表示突變氨基酸的位置；E：突變位點(diǎn)保守性分析及基因突變位置。

圖2 TRIP13基因突變位點(diǎn)致病性分析

A：體外轉(zhuǎn)染不同突變質(zhì)粒對(duì)TRIP13蛋白在HeLa細(xì)胞中的定位影響；B：免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同突變對(duì)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中TRIP13蛋白水平的影響；C: 圖B中TRIP13蛋白表達(dá)豐度的相對(duì)定量分析。D：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同突變對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001；****：<0.0001。

2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示突變HeLa細(xì)胞增殖速率異常

有研究報(bào)道基因在各種人類腫瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[11,12,17]。為了驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的四個(gè)基因突變是否會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，本研究對(duì)轉(zhuǎn)染野生型和突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染c.77A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染120 h后增殖速度顯著下降(<0.0001)；轉(zhuǎn)染c.409G>A突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞增殖速率幾乎無(wú)變化；轉(zhuǎn)染c.859A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染120 h后增殖速度顯著增加(<0.0001)；轉(zhuǎn)染c.1150A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染120 h后增殖速度有一定的下降(=0.0047)。經(jīng)進(jìn)一步將四個(gè)突變與對(duì)照組在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖影響進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染c.77A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72～120 h內(nèi)與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒相比增殖速度顯著下降(<0.0001)；轉(zhuǎn)染c.859A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72～96 h內(nèi)細(xì)胞增殖速度顯著增加(=0.0003)，轉(zhuǎn)染96～120 h內(nèi)細(xì)胞增殖速度也顯著增加(<0.0001)；轉(zhuǎn)染c.1150A>G突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染96～120 h內(nèi)增殖速度有所下降(=0.0038)(圖2D)。這些結(jié)果提示基因突變?cè)谝欢ǔ潭壬嫌绊懥思?xì)胞周期進(jìn)程。

2.5 TRIP13基因不同位點(diǎn)突變引起不同疾病

結(jié)合本文新發(fā)現(xiàn)的病例信息，本研究總結(jié)了2007～2020年已報(bào)道的基因引起不同疾病的突變位點(diǎn)，匯總突變位點(diǎn)的具體信息如表4所示。TRIP13蛋白由432個(gè)氨基酸組成，包含N末端，C末端和一個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域。目前總共有13個(gè)突變位點(diǎn)，其中4個(gè)突變位于N末端，5個(gè)突變位于ATP酶結(jié)構(gòu)域以及4個(gè)突變位于C末端。涉及到的病種包括：腎母細(xì)胞瘤(Wilms tumors)；由卵母細(xì)胞成熟阻滯導(dǎo)致的女性不孕癥；由合子卵裂失敗(zygotic cleavage failure，ZCF)導(dǎo)致的女性不孕癥。

3 討論

卵母細(xì)胞成熟阻滯是女性原發(fā)性不孕的病因之一，在輔助生殖過(guò)程中，這類患者的卵母細(xì)胞在卵泡刺激素和人絨毛膜促性腺激素給藥后仍處于未成熟狀態(tài)，停留在GV和MI期[19]。已有許多研究報(bào)道了與卵母細(xì)胞成熟阻滯有關(guān)的基因：基因突變會(huì)破壞卵母細(xì)胞減數(shù)分裂微管形成和紡錘體組裝，使卵母細(xì)胞停滯在MI期，導(dǎo)致女性不孕[20]；基因突變會(huì)使卵母細(xì)胞出現(xiàn)大極體，對(duì)稱分裂和異常紡錘體等形態(tài)學(xué)缺陷而使其阻滯在GV期，從而導(dǎo)致女性不孕[7,21,22]。2020年Zhang等[6]報(bào)道了五例因基因突變導(dǎo)致人類卵母細(xì)胞成熟阻滯的純合或復(fù)合雜合錯(cuò)義致病突變。隨后，本課題組在2022年報(bào)道了三例因純合錯(cuò)義突變導(dǎo)致合子卵裂失敗的病例[16]。本文發(fā)現(xiàn)了來(lái)自三例患者基因中的導(dǎo)致人類卵母細(xì)胞成熟阻滯的四個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)突變位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

表4 TRIP13基因突變位點(diǎn)總結(jié)

基因在有絲分裂和減數(shù)分裂發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在有絲分裂中，TRIP13蛋白可以聯(lián)合p31comet以及ATP，解聚有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合體(mitotic checkpoint complex，MCC)，沉默檢查點(diǎn)功能，促進(jìn)有絲分裂進(jìn)程[23]。TRIP13蛋白在減數(shù)分裂中促進(jìn)帶有HORMA結(jié)構(gòu)域的蛋白HORMADs在染色體上的積累和去除，調(diào)節(jié)DNA斷裂的修復(fù)和染色體重組過(guò)程[24,25]。因此TRIP13可能通過(guò)不同途徑在有絲分裂和減數(shù)分裂中發(fā)揮不同作用。此外，與基因有關(guān)的人類疾病的報(bào)道中，有研究發(fā)現(xiàn)基因純合無(wú)義突變或剪接突變會(huì)引發(fā)腎母細(xì)胞瘤[18]，且腎母細(xì)胞瘤相關(guān)的突變導(dǎo)致TRIP13蛋白完全不表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯的不同位點(diǎn)的錯(cuò)義突變均使得TRIP13蛋白表達(dá)增加，而這三名患者并未發(fā)現(xiàn)與腎母細(xì)胞瘤相關(guān)的疾病。這提示不同疾病的產(chǎn)生可能與突變導(dǎo)致的蛋白表達(dá)的差異程度有關(guān)。另外，基因突變導(dǎo)致女性不孕的表型中，除了卵母細(xì)胞成熟阻滯外，也發(fā)現(xiàn)了不同的表型：例如基因復(fù)合雜合錯(cuò)義突變c.77A>G(p.His26Arg)和c.1258A>G(p. Lys420Glu)導(dǎo)致合子卵裂失敗。以上這些研究在一定程度上驗(yàn)證了基因不同位置的突變對(duì)蛋白表達(dá)和功能的影響會(huì)造成個(gè)體表型的差異。

是一種AAA+ATP酶，在包括睪丸，卵巢在內(nèi)的各種組織中表達(dá)[25,26]?；虻耐蛔?cè)诨蛐蛄械腃端和N端以及ATP酶結(jié)構(gòu)域上均有發(fā)生，在女性中導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯或者合子卵裂失敗。迄今為止已發(fā)現(xiàn)5種與卵母細(xì)胞成熟阻滯有關(guān)的基因突變，分別是c.77A>G(p.His26Arg)、c.518G>A(p.Arg173Gln)、c.907G>A(p.Glu303Lys)、c.592A>G(p.Ile198Val)、c.739G>A(p.Val247Met)，以及3種與合子卵裂失敗有關(guān)的基因突變，分別是c.77A> G(p.His26Arg)、c.1141G>A(p. Glu381Lys)和c.1258A> G(p. Lys420Glu)[6,16]。本文中發(fā)現(xiàn)了患者1存在純合錯(cuò)義突變c.859A>G(p.Ile287Val)以及患者3存在復(fù)合雜合突變c.409G>A(p.Asp137Asn)以及c.1150A>G(p.Ser384Gly)，均為基因新發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯的致病位點(diǎn)。本研究中在家族2的先證者中發(fā)現(xiàn)基因純合錯(cuò)義突變c.77A>G(p.His26Arg)，既往有關(guān)的兩篇研究中也都曾報(bào)道過(guò)基因在這一位點(diǎn)的錯(cuò)義突變。這提示基因的第77位堿基可能是基因中導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯的高發(fā)位點(diǎn)?？偟膩?lái)說(shuō)，目前為止發(fā)現(xiàn)的所有基因突變?cè)斐傻牟辉斜硇椭校?0%的基因突變與卵母細(xì)胞成熟阻滯相關(guān)，30%的突變導(dǎo)致合子卵裂失敗。

基因在各種人類腫瘤中高表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要功能[11,12]。已有研究證實(shí)在膀胱癌組織樣本中的基因表達(dá)顯著升高；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因的過(guò)表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)G2/ M期的細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力以及集落形成能力，敲低會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡[17]。另外也有研究表明與正常卵巢細(xì)胞系相比，上皮性卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3，HEY和OVCAR-3)中的表達(dá)顯著上調(diào)；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默上皮性卵巢癌細(xì)胞中的可抑制細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞侵襲和遷移[27]。在對(duì)細(xì)胞增殖的探討中發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞增殖過(guò)程出現(xiàn)不同程度的異常，這說(shuō)明基因在不同位點(diǎn)的突變確實(shí)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響不一致，因此導(dǎo)致的細(xì)胞增殖過(guò)快或過(guò)慢都會(huì)影響細(xì)胞正常分裂，這可能是造成卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程阻滯的原因。

卵母細(xì)胞成熟阻滯是女性不孕的主要原因之一，目前針對(duì)卵母細(xì)胞成熟阻滯導(dǎo)致的不孕問(wèn)題，除了體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞和接受卵母細(xì)胞捐獻(xiàn)之外，沒(méi)有其他有效的治療手段[28]。越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注對(duì)突變患者的卵子進(jìn)行非基因編輯的分子干預(yù)，期望能夠逆轉(zhuǎn)卵母細(xì)胞成熟阻滯的表型。之前的研究報(bào)道了將正常的的cRNA注射到基因純合錯(cuò)義突變患者的卵母細(xì)胞中，可以在一定程度上挽救卵母細(xì)胞停滯的表型：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有注射cRNA的MI卵母細(xì)胞都排出了第一極體，相比之下，未注射的卵母細(xì)胞即使在長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍處于MI階段[6]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為攜帶致病突變的不孕患者提供了一種可能的治療方法，但未來(lái)仍應(yīng)在小鼠或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中仔細(xì)評(píng)估其有效性和安全性。

綜上所述，本文報(bào)道了三例攜帶基因突變的女性不孕患者，三名患者均表現(xiàn)為卵子不熟，其卵母細(xì)胞阻滯在GV或MI期。其中，突變c.859A>G(p.Ile287Val)，c.409G>A(p.Asp137Asn)和c.1150A>G(p.Ser384Gly)均為新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了這些突變能夠影響TRIP13蛋白表達(dá)，使得TRIP13蛋白不同程度的異常增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程紊亂。本研究擴(kuò)充了關(guān)于人類卵母細(xì)胞成熟阻滯的致病圖譜，為女性不孕患者的診斷、遺傳咨詢提供了重要的依據(jù)，同時(shí)也將有助于提高人們對(duì)人類卵母細(xì)胞成熟阻滯致病機(jī)制的理解。

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Novel mutations inlead to female infertility with oocyte maturation arrest

Xiangjiang Lv1, Jing Guo2, Ge Lin1,2

Oocyte maturation arrest (OMA) refers to a rare clinical phenomenon of oocyte maturation disorder caused by abnormal meiosis, which is also one of the primary causes of female infertility. The clinical manifestations of these patients are often characterized with failure to obtain mature oocytes after repeated ovulation stimulation and/or inducedmaturation. To date, mutations in,andhave been demonstrated to be associated with OMA, but studies on the genetic-based factors and mechanisms of OMA are still incomplete. In this study, peripheral blood from 35 primary infertile women characterized with recurrent OMA during assisted reproductive technology (ART) were subjected to whole-exome sequencing (WES). By using Sanger sequencing and co-segregated analysis, we identified four pathogenic variants in. Proband 1 had a homozygous missense mutation of c.859A>G appeared on the 9th exon, which resulted in substitution of Ile287 to valine (p.Ile287Val); proband 2 had a homozygous missense mutation of c.77A>G on the 1st exon, which resulted in substitution of His26 to arginine (p.His26Arg); and proband 3 had compound heterozygous mutations of c.409G>A and c.1150A>G on the 4th and 12th exon, which resulted in the substitutions of Asp137 to asparagine (p.Asp137Asn) and Ser384 to glycine (p.Ser384Gly) in the encoded protein respectively. Three of these mutations have not been reported previously. Further, transfection of plasmids harboring the respective mutatedin HeLa cells resulted in changes in TRIP13 expression and abnormal cell proliferation as demonstrated by western blotting and cell proliferation assay respectively. This study further summarizes themutations reported previously and expands the mutation spectrum ofpathogenic variants, thereby providing a valuable reference for further research on the pathogenic mechanism of OMA associated withmutations.

oocyte maturation arrest;; meiosis; female infertility

2023-02-01;

2023-03-30;

2023-04-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81901473)和中信湘雅生殖遺傳?？漆t(yī)院院內(nèi)項(xiàng)目(編號(hào)：YNXM-201810)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81901473), and the Scientific Research Foundation of Reproductive and Genetic Hospital of China International Trust Investment Corporation (CITIC) Xiangya (No. YNXM-201810)]

呂香江，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：遺傳學(xué)。E-mail：lvxiangjiang@163.com

林戈，博士，研究員，研究方向：遺傳學(xué)。E-mail: linggf@hotmail.com

郭靜，博士，副研究員，研究方向：生殖醫(yī)學(xué)。E-mail: 815457238@qq.com

10.16288/j.yczz.23-022

(責(zé)任編委: 谷峰)