植物質(zhì)體基因工程調(diào)控元件研究進(jìn)展

于一凡，歐陽臻，郭娟，趙瑜君，黃璐琦

植物質(zhì)體基因工程調(diào)控元件研究進(jìn)展

于一凡1,2，歐陽臻2，郭娟1，趙瑜君1，黃璐琦1,2

1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，科技部與國家中醫(yī)藥管理局道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700 2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

隨著植物合成生物學(xué)的發(fā)展，質(zhì)體逐漸成為許多具有商業(yè)價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物和治療性蛋白異源生產(chǎn)的理想平臺(tái)。與核基因工程相比，質(zhì)體基因工程在外源基因高效表達(dá)和生物安全性等方面具有其獨(dú)特優(yōu)勢。然而，外源基因在質(zhì)體系統(tǒng)中的組成型表達(dá)或?qū)χ参锷L不利，因此需進(jìn)一步挖掘、設(shè)計(jì)調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因的精準(zhǔn)調(diào)控。本文概述了質(zhì)體基因工程調(diào)控元件的研究進(jìn)展，內(nèi)容包括操縱子設(shè)計(jì)與優(yōu)化思路、多基因共表達(dá)調(diào)控策略及新型表達(dá)調(diào)控元件的挖掘等，為植物合成生物學(xué)的發(fā)展提供參考。

植物合成生物學(xué)；質(zhì)體基因工程；遺傳轉(zhuǎn)化；操縱子；調(diào)控元件

質(zhì)體基因工程的發(fā)展歷程最早可追溯到20世紀(jì)80年代。1987年，Daniell等[1]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA體外處理的黃瓜()白色體可吸收來自細(xì)菌的基因和藍(lán)藻的基因，且能夠在體內(nèi)表達(dá)這些基因。早期的質(zhì)體基因工程涉及復(fù)雜的質(zhì)體分離與體外培養(yǎng)過程，操作難度較大[1～3]，基因槍的出現(xiàn)簡化了該操作流程，質(zhì)體基因工程也由此進(jìn)入了新的發(fā)展階段[4,5]。1988年，Boynton等[4]將野生型基因整合至該基因突變型萊茵衣藻()的葉綠體基因組中，使萊茵衣藻恢復(fù)正常的光合作用功能，首次實(shí)現(xiàn)了質(zhì)體基因工程在單細(xì)胞真核生物中的應(yīng)用。1990年，Svab等[6]報(bào)道了煙草()質(zhì)體基因組的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，標(biāo)志著高等植物質(zhì)體基因工程的開端，此后Svab等[7]將壯觀霉素抗性基因靶向整合至煙草質(zhì)體基因組，得到了同質(zhì)化的轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草品系并能夠以母系遺傳的方式穩(wěn)定遺傳給子代，為高等植物質(zhì)體基因工程的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

在過去的一個(gè)世紀(jì)中，雜交育種是栽培作物獲得理想農(nóng)藝性狀的主要手段。隨著基因工程的興起，使得轉(zhuǎn)基因作物較傳統(tǒng)栽培作物更易獲得理想農(nóng)藝性狀，在提升產(chǎn)量的同時(shí)降低農(nóng)藥的使用量，這極大促進(jìn)了生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。然而，大部分轉(zhuǎn)基因作物通過核基因工程實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化，存在外源基因表達(dá)量低或生物安全問題[8]。質(zhì)體基因工程可以有效避免上述情況的發(fā)生，在同質(zhì)化的轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞中，外源基因高達(dá)10,000個(gè)拷貝，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)[9]。更重要的是，質(zhì)體基因組的母系遺傳特性能夠有效減少或消除外源基因通過花粉逃逸的可能性[10]。

質(zhì)體(plastid)包括葉綠體、色質(zhì)體(或稱有色體)和白色體，根據(jù)內(nèi)共生學(xué)說，質(zhì)體起源于與真核宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)共生相互作用的藍(lán)細(xì)菌，因而質(zhì)體在基因轉(zhuǎn)錄及翻譯等方面具有原核特性，且在漫長的進(jìn)化過程中，大部分原先存在于質(zhì)體基因組中的基因已轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，僅有少部分基因保留在質(zhì)體基因組[11～15]。植物葉綠體基因組是一個(gè)大小約為 150 kb的環(huán)狀分子，包含120～130個(gè)基因，其中大部分基因與光合作用或葉綠體基因表達(dá)(即編碼核糖體的RNA和蛋白質(zhì)亞基、RNA聚合酶亞基和tRNA)相關(guān)[8]。葉綠體作為植物重要的代謝合成中心，可通過光合作用將太陽能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。此外，葉綠體還參與核酸、氨基酸、脂肪酸以及次生代謝產(chǎn)物的生物合成，是植物生長發(fā)育過程中重要的細(xì)胞器[16,17]。隨著高通量測序技術(shù)不斷升級(jí)迭代，已有越來越多物種的葉綠體基因組信息被揭示[18]，這在一定程度上也促進(jìn)了質(zhì)體基因工程的持續(xù)發(fā)展。隨著研究的不斷深入，開展質(zhì)體基因工程的高等植物數(shù)量已十分可觀，如煙草[7]、擬南芥()[19]、馬鈴薯()[20]、番茄()[21]、大豆()[22]、萵苣()[23]和黃花蒿()[24]等。相比于其他高等植物物種，煙草具有產(chǎn)量高、質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系成熟、遺傳操作簡便等優(yōu)勢[25]，且開展以煙草為底盤的質(zhì)體基因工程研究可以有效降低對(duì)食物鏈的污染，因此煙草已成為當(dāng)前質(zhì)體基因工程的模式植物。

由于質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)具有原核表達(dá)特性，具備相對(duì)獨(dú)立的區(qū)室，擁有豐富的代謝模塊，這些特性使質(zhì)體成為代謝工程及合成生物學(xué)的理想受體[26～30]。截至目前，質(zhì)體基因工程已廣泛應(yīng)用于性狀改良、生物醫(yī)藥以及合成生物學(xué)等領(lǐng)域，并取得了豐碩的研究成果[27,28,31～34]。與此同時(shí)，質(zhì)體基因工程也為質(zhì)體系統(tǒng)的RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白翻譯機(jī)制、調(diào)控元件篩選與鑒定等研究領(lǐng)域提供了幫助[35～40]。近年來，質(zhì)體基因工程主要致力于質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體(圖1)的設(shè)計(jì)方案優(yōu)化(表1)，其中選擇穩(wěn)定且具有高效轉(zhuǎn)錄、翻譯能力的表達(dá)調(diào)控元件是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的關(guān)鍵[40]，但外源基因的組成型高效表達(dá)會(huì)對(duì)植物的生長和發(fā)育造成代謝負(fù)擔(dān)。為了最大程度地避免這種負(fù)面影響，需要采用適當(dāng)?shù)暮铣刹倏v子構(gòu)建策略實(shí)現(xiàn)外源基因在特定時(shí)期或空間的表達(dá)[40]。因此，本文對(duì)質(zhì)體基因工程的表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行了總結(jié)，并重點(diǎn)介紹了近5年質(zhì)體基因工程合成操縱子構(gòu)建策略的最新研究進(jìn)展。

1 啟動(dòng)子

1.1 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與類型

高等植物的質(zhì)體中含有兩種類型啟動(dòng)子：PEP (plastid-encoded RNA polymerase)型/NEP (nuclear- encoded RNA polymerases)型，PEP型啟動(dòng)子能夠被質(zhì)體基因組編碼的rpoA、rpoB、rpoC1和 rpoC2亞基組成的細(xì)菌型RNA聚合酶核心識(shí)別，在結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌σ70型啟動(dòng)子非常相似，在–35區(qū)和–10區(qū)均含有保守序列[46,47]，因此在大腸桿菌中也能正常發(fā)揮作用。NEP型啟動(dòng)子由核基因組編碼的噬菌體型RNA聚合酶識(shí)別[48]，大多數(shù)都包含一個(gè)核心的序列基序(YRTA)，與植物線粒體基因組中啟動(dòng)子的共有序列十分相似[49]。從轉(zhuǎn)錄水平來看，NEP型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率似乎要弱于PEP 型啟動(dòng)子[50]，因此，絕大多數(shù)質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究會(huì)優(yōu)先選擇PEP型啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)。

圖1 質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體結(jié)構(gòu)示意圖

黑色方框：左右兩側(cè)質(zhì)體同源重組序列，用于外源蛋白質(zhì)合成操縱子的定向整合；綠色方框：代表啟動(dòng)子區(qū)域；紅色方框：5′UTR區(qū)域；黃色方框：3′UTR區(qū)域。啟動(dòng)子可以是質(zhì)體啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，用于調(diào)控目的基因的表達(dá)。當(dāng)使用IEE元件表達(dá)多個(gè)基因時(shí)，目的基因2前應(yīng)含有SD(Shine-Dalgarno)序列。

表1 近5年常用表達(dá)調(diào)控元件在質(zhì)體基因工程中的應(yīng)用

1.2 啟動(dòng)子的應(yīng)用

1.2.1 外源基因高效表達(dá)

自從P與P被應(yīng)用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究以來[7,51]，這兩條啟動(dòng)子已經(jīng)成為近幾十年合成操縱子構(gòu)建中最常用的兩個(gè)高效啟動(dòng)子[24,32,33,52～55]。啟動(dòng)子P源自于16S rDNA基因，該啟動(dòng)子能夠以極高速率驅(qū)動(dòng)核糖體RNA操縱子轉(zhuǎn)錄，是高等植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化活性最強(qiáng)的啟動(dòng)子[34]。De Cosa等[54]利用P啟動(dòng)子，將細(xì)菌操縱子整合至煙草質(zhì)體基因組，外源蛋白在成熟葉片中的表達(dá)量占植物總可溶性蛋白的45.3%，即使在老化的白色葉片中也保持著極為穩(wěn)定的積累水平(46.1%)。值得注意的是，由于rRNA自身不能夠被翻譯，故在選用P作為啟動(dòng)子時(shí)，需要添加適當(dāng)?shù)姆g起始信號(hào)，用以保證外源蛋白的積累[56,57]。

基因在葉綠體中翻譯效率最高，且通過改變光照強(qiáng)度能夠調(diào)控該基因的表達(dá)[58,59]。Boyhan等[60]將胰島素原葉綠體操縱子分別整合至煙草和萵苣質(zhì)體基因組，并使用基因的啟動(dòng)子P驅(qū)動(dòng)胰島素原葉綠體操縱子的表達(dá)。胰島素原在成熟煙草和萵苣葉片中的積累水平分別占葉片總蛋白(total leaf protein，TLP)的47%和53%，在衰老干燥的萵苣葉片中，胰島素原的積累水平仍高達(dá)約40% TLP。

1.2.2 植物遺傳改良

在光合作用中，起固定CO2作用的關(guān)鍵酶核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)是決定碳同化速率的關(guān)鍵酶。通過提高位于葉綠體中的光合酶Rubisco的CO2固定來提高碳同化速率是提升作物產(chǎn)量的有效策略之一[61]。植物Rubisco是一種16蛋白復(fù)合物，由核基因編碼的8個(gè)小亞基和葉綠體基因編碼的8個(gè)大亞基構(gòu)成，小亞基與大亞基的相互作用會(huì)對(duì)Rubisco的CO2固定產(chǎn)生影響，因此對(duì)其改造包括核轉(zhuǎn)化和質(zhì)體轉(zhuǎn)化兩個(gè)方面[62～66]。Martin-Avila等[31]首先沉默煙草的核基因，之后利用煙草內(nèi)源啟動(dòng)子P，將4種合成操縱子(-、-、-和-rbcS)靶向整合至轉(zhuǎn)基因煙草RNAi-的葉綠體基因組，獲得4種轉(zhuǎn)基因煙草品系，分別表達(dá)不同馬鈴薯Rubisco小亞基(葉肉小亞基pS1、pS2、pS3以及馬鈴薯毛狀體pST亞基)組成的植物同源Rubisco，其中pS3 亞基降低了Rubisco的積累水平，但提高了其羧化比率及羧化效率，pST亞基降低了Rubisco的羧化比率及羧化效率，并嚴(yán)重影響了轉(zhuǎn)基因煙草的光合作用及生長發(fā)育。通過該研究，作者明確了改善馬鈴薯 Rubisco催化作用的小亞基的氨基酸組成，證實(shí)優(yōu)化操縱子設(shè)計(jì)可以提高外源基因在葉綠體中的表達(dá)水平，并為Rubisco的基因工程改良提供了有效的生物工程基礎(chǔ)。

此外，由于Rubisco本質(zhì)上是一種催化效率低的酶，使用效率更高的外源Rubisco取代植物內(nèi)源Rubisco，也是提高光合作用效率和作物產(chǎn)量的有效方法。然而，Rubisco的表達(dá)和組裝需要分子伴侶，缺乏分子伴侶會(huì)阻礙葉綠體中功能性外源Rubisco的有效生產(chǎn)。因此，Chen等[67]利用煙草內(nèi)源啟動(dòng)子P，將能夠串聯(lián)表達(dá)和基因的合成操縱子靶向整合至煙草葉綠體基因組，成功在煙草葉綠體中表達(dá)了來源于那不勒斯鹵硫桿菌()的外源Rubisco。值得注意的是，轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草能夠高效表達(dá)功能性的外源Rubisco16 蛋白復(fù)合物，約占野生型煙草Rubisco含量的40%，且不需要外源分子伴侶。外源Rubisco顯示2倍以上的羧化率，并使得轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草與野生型具有相似的自養(yǎng)生長率。這項(xiàng)研究表明，用效率更高的外源Rubisco取代植物內(nèi)源Rubisco，具有可行性，并為通過Rubisco的基因工程改良提升作物光合作用效率和生長率的研究提供技術(shù)支撐。

治療前后237例使用萬古霉素且行血藥濃度監(jiān)測的患者的腎功能指標(biāo)（Scr、BUN、胱抑素C）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

2 非質(zhì)體特異性調(diào)控序列

由于質(zhì)體基因表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，因此5′UTR和3′UTR對(duì)于維持mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率尤為重要。迄今為止，已篩選出多條5′UTR序列[56,68～70]并廣泛應(yīng)用于質(zhì)體基因工程研究，如1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶基因()的5′UTR[19,31]、葉綠體D1蛋白基因()的5′UTR[52,71]、ATP合酶β亞基基因()的5′UTR[31,72]以及來自T7噬菌體基因 10 的先導(dǎo)序列T7L[24,33,73]。近5年來，大部分涉及外源蛋白的高效積累的質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究均使用了T7L[24,33,73]，由于該序列所包含的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及SD序列能夠介導(dǎo)外源基因在大腸桿菌中的高效翻譯[56,57]，且眾多表達(dá)調(diào)控元件的組合中，P啟動(dòng)子序列與5′UTR序列T7L的組合能夠有效保證目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，故使用頻率較高。當(dāng)前應(yīng)用較為廣泛的3′UTR序列主要有基因的3′UTR[55,74]、基因的3′UTR[75,76]、基因的3′UTR[77,78]以及來自大腸桿菌操縱子的終止序列T[19,45]。

2.1 5′UTR的結(jié)構(gòu)與功能

質(zhì)體中存在兩種翻譯方式，二者的區(qū)別在于是否具有SD序列依賴性。常見的翻譯起始方式依賴于SD序列，該序列位于起始密碼子上游 4～9個(gè)核苷酸的保守區(qū)域[35]；另一種翻譯起始方式與SD序列無關(guān)，而是由mRNA特異性翻譯激活蛋白與5′UTR結(jié)合并將核糖體30S亞基引導(dǎo)至AUG起始密碼子?；谠吮磉_(dá)系統(tǒng)的翻譯機(jī)制，通常認(rèn)為SD序列依賴性的翻譯效率總體上要高于SD序列非依賴性的翻譯效率，但目前仍沒有相關(guān)研究對(duì)兩種翻譯起始方式進(jìn)行系統(tǒng)比較。

由于70S細(xì)菌型核糖體是質(zhì)體中蛋白質(zhì)的生物合成場所[79]，因此5′UTR序列和結(jié)構(gòu)很大程度上決定了SD序列依賴性翻譯的速率[36]。最近的研究表明[35]，SD序列與16S rRNA 3′末端序列結(jié)合的強(qiáng)弱與翻譯效率有關(guān)，并且這種結(jié)合會(huì)顯著影響二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的mRNA的翻譯效率，但對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差的mRNA的翻譯效率影響較小。因此，結(jié)合強(qiáng)度并不是決定SD序列依賴性翻譯速率的唯一性因素，質(zhì)體基因的表達(dá)主要受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響[80,81]。

2.2 5′UTR的應(yīng)用

2.2.1 提高重組蛋白表達(dá)量

Zhou等[32]檢測了4種來自質(zhì)體轉(zhuǎn)基因的HIV (human immunodeficiency virus)抗原結(jié)合操縱子(、、-和-)的表達(dá)，其中表達(dá)量最高的操縱子將p24蛋白序列N端與Nef蛋白序列C端融合，并利用啟動(dòng)子P與T7L組合驅(qū)動(dòng)，使蛋白產(chǎn)物的積累水平高達(dá)植物總蛋白的40%，是以往常規(guī)核轉(zhuǎn)化生產(chǎn)p24研究的100倍，且p24-Nef 融合蛋白的過表達(dá)僅對(duì)植物表型造成了輕微的影響，該研究揭示了質(zhì)體基因工程在高水平生產(chǎn)藥物蛋白上的巨大潛力。此外，Oey等[9]使用同樣的方式將充分優(yōu)化后的合成操縱子整合到葉綠體基因組中，使PlyGBS裂解酶的表達(dá)水平達(dá)到了植物總可溶性蛋白的70%以上，這是迄今為止在植物中實(shí)現(xiàn)的最高外源蛋白表達(dá)水平，在葉片發(fā)育和衰老過程中該蛋白在葉綠體中仍保持穩(wěn)定，且蛋白表達(dá)量始終維持在較高水平。

2.2.2 提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量

青蒿素是目前治療瘧疾的首選藥物，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法是世界衛(wèi)生組織推薦的瘧疾治療的最佳療法。為了滿足全世界范圍內(nèi)對(duì)青蒿素不斷增長的需求，F(xiàn)uentes等[73]開發(fā)了一種新的合成生物學(xué)方法，首先將青蒿酸生物合成的關(guān)鍵酶基因以及整合到葉綠體基因組，進(jìn)而將影響青蒿酸通量的相關(guān)酶基因及進(jìn)行核轉(zhuǎn)化，最終獲得了青蒿酸含量達(dá)120 mg/kg鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)的煙草品系，該品系所表達(dá)的葉綠體操縱子利用萊茵衣藻啟動(dòng)子CrP和CrP，分別與T7L組合，以多順反子的形式驅(qū)動(dòng)青蒿酸生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了將次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑從原植物向高生物量作物的轉(zhuǎn)移。

光系統(tǒng)是由蛋白質(zhì)和葉綠素等光合色素組成的復(fù)合物，是將吸收的太陽能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的功能單位，包括光系統(tǒng)I(PS I)和光系統(tǒng)II(PS II)。葉綠體基因編碼PS II反應(yīng)中心D2蛋白，細(xì)胞核編碼的Nac2蛋白可與基因mRNA的5′UTR特異性結(jié)合，二者的相互作用是維持基因mRNA穩(wěn)定性及PS II反應(yīng)中心D2蛋白正常表達(dá)所必需的。Dinc等[82]將轉(zhuǎn)質(zhì)體萊茵衣藻基因的5′UTR 替換為基因的5′UTR，并利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子MetE驅(qū)動(dòng)核基因的表達(dá)。使用維生素對(duì)轉(zhuǎn)質(zhì)體萊茵衣藻進(jìn)行處理后，MetE啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性被抑制，導(dǎo)致基因mRNA和編碼蛋白的水平逐漸下降，進(jìn)一步抑制了葉綠體的翻譯活性；使用維生素處理轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞后的48～96 h，葉綠素a與葉綠素b含量的比值顯著降低，可變熒光(Fv)與最大熒光(Fm)的比率顯著下降，轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞停止生長。此外，轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞低溫?zé)晒獍l(fā)射光譜中PS I的發(fā)射峰發(fā)生了藍(lán)移(blue shift)，與PS I的發(fā)射熒光(N700 nm)強(qiáng)度相比，PS II的發(fā)射熒光(686 nm)強(qiáng)度有所下降。該研究表明，通過在生長培養(yǎng)基中添加維生素對(duì)轉(zhuǎn)質(zhì)體萊茵衣藻的葉綠體翻譯進(jìn)行可逆性抑制，可以用來研究光合復(fù)合物在膜中的相對(duì)穩(wěn)定性。

2.3 3′UTR的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用

質(zhì)體基因編碼區(qū)下游的3′UTR通常包含一段能夠在轉(zhuǎn)錄后折疊成穩(wěn)定莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，這種結(jié)構(gòu)可以有效避免3′→5′核糖核酸外切酶對(duì)mRNA 的降解[83]，但不同于真核系統(tǒng)中的終止子或細(xì)菌中的終止序列，這種結(jié)構(gòu)在質(zhì)體中并不具備轉(zhuǎn)錄終止功能[84]，而是作為轉(zhuǎn)錄加工識(shí)別位點(diǎn)以及起到維持轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性的作用[85]。

此前已有多項(xiàng)研究探究了不同3′UTR對(duì)葉綠體基因組中報(bào)告基因表達(dá)的影響[69,86]。其中Tangpha-tsornruang等[86]比較了不同3′UTR對(duì)煙草葉綠體中外源基因表達(dá)的影響，分別將來自煙草葉綠體基因編碼區(qū)下游的T、T、T和T以及大腸桿菌操縱子的終止子序列T置于綠色熒光蛋白基因()的下游，在含有P-- T操縱子的轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草中mRNA的積累水平是含有T和T操縱子的4倍，所有轉(zhuǎn)基因煙草都積累了大約相同水平的GFP，占總可溶性蛋白的0.2%，說明翻譯受到轉(zhuǎn)錄豐度以外其他因素的影響。以上研究表明，3′UTR會(huì)對(duì)RNA的積累水平產(chǎn)生影響，但對(duì)蛋白積累水平的影響有限。

3 新型表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的開發(fā)與應(yīng)用

3.1 多基因共表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)

在設(shè)計(jì)構(gòu)建復(fù)雜生物合成途徑的操縱子時(shí)，往往需要將多條途徑的相關(guān)基因構(gòu)建至載體上，這可能會(huì)重復(fù)使用表達(dá)調(diào)控元件，同時(shí)也會(huì)提高載體構(gòu)建的難度。而在質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)中，以單一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)多條基因的轉(zhuǎn)錄較為常見[87,88]，這種特性為研究人員在質(zhì)體中構(gòu)建復(fù)雜生物合成途徑提供了可能。與細(xì)菌以多順反子為單位直接進(jìn)行翻譯不同，質(zhì)體中的多順反子會(huì)被加工成單順反子，但順反子間的加工是否能夠促進(jìn)操縱子中所有基因的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究[36,89]。

當(dāng)前比較成熟的構(gòu)建策略是在合成操縱子序列中添加能夠?qū)⒍囗樂醋蛹庸ば纬蓡雾樂醋拥谋磉_(dá)調(diào)控元件。Zhou等[37]首次鑒定出了這種順反子間表達(dá)元件(IEE)，該元件的序列長度僅為50 bp，位于-基因間隔區(qū)，序列中含有RNA結(jié)合蛋白HCF107的識(shí)別位點(diǎn)，該元件有效改善了多順反子中某個(gè)順反子表達(dá)水平過低的情況，也為多基因合成操縱子在葉綠體中的表達(dá)提供了有效工具。因此在異源生物合成途徑的質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究中被廣泛使用[26,33,73,74,90,91]。

為了避免過度重復(fù)使用單一元件，Legen等[92]測試了5個(gè)含有五肽重復(fù)蛋白(pentatricopeptide repeat，PPR)結(jié)合位點(diǎn)的 sRNA 序列，發(fā)現(xiàn)其中5種sRNA 能夠穩(wěn)定其下游基因的轉(zhuǎn)錄本并提高其蛋白的表達(dá)水平，說明這些sRNA與IEE一樣能夠用于葉綠體多順反子操縱子的構(gòu)建。值得注意的是，這種元件與核編碼PPR蛋白的結(jié)合除了會(huì)影響多順反子mRNA的加工之外，也可以提高翻譯效率和/或影響 mRNA 穩(wěn)定性，但是這些元件是如何增加外源基因表達(dá)的尚不明確。Macedo-Osorio等[38]測試了來自-、-、-、-和-葉綠體操縱子的基因間隔區(qū)序列，并將這些間隔區(qū)序列構(gòu)建至--雙順反子操縱子基因之間。盡管所有的轉(zhuǎn)質(zhì)體細(xì)胞系都具有卡那霉素抗性，但只有其中兩條間隔區(qū)(-和-的基因間隔區(qū))序列能夠介導(dǎo)細(xì)胞系中的表達(dá)。

3.2 誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)

盡管葉綠體內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子可以實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)，但是隨著質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)某些外源蛋白或異源合成途徑在葉綠體中的過度表達(dá)可能會(huì)對(duì)植物本身的生長發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響[93～98]。為了能夠精細(xì)調(diào)控外源基因在葉綠體中的表達(dá)水平，就需要開發(fā)特異性誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件，這類元件通過特定的物理或化學(xué)方式誘導(dǎo)后，不僅能夠大幅降低持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生的負(fù)面影響，還能根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮O(shè)計(jì)需求在特定時(shí)間啟動(dòng)或停止外源基因的表達(dá)。

3.2.1 核誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)

近年來植物質(zhì)體基因工程誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的開發(fā)已日趨成熟(表2)，其中核基因工程誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)動(dòng)態(tài)表達(dá)范圍高，在未誘導(dǎo)狀態(tài)下，表達(dá)泄漏較少。一種常見的策略是將融合了質(zhì)體定位信號(hào)的外源基因由誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)在細(xì)胞核中表達(dá)，該基因編碼蛋白與質(zhì)體基因組內(nèi)源調(diào)控元件特異性結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)調(diào)控元件下游基因的表達(dá)。另一種策略是在細(xì)胞核中利用誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)可與非質(zhì)體特異性調(diào)控元件結(jié)合的外源基因編碼蛋白，進(jìn)而增強(qiáng)調(diào)控元件下游基因的表達(dá)。

Rojas等[71]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核基因組編碼的PPR蛋白被乙醇誘導(dǎo)表達(dá)后，能夠與葉綠體mRNA的5′UTR特異性結(jié)合，進(jìn)而穩(wěn)定mRNA的結(jié)構(gòu)，并通過提高翻譯效率增強(qiáng)外源基因的表達(dá)。Yu等[99]在此基礎(chǔ)上開發(fā)了基于此元件的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含了玉米()葉綠體的PPR10變體與基因上游的同源結(jié)合位點(diǎn)。由于馬鈴薯內(nèi)源PPR10蛋白不識(shí)別該位點(diǎn)，因此GFP在葉片中的表達(dá)水平較低。當(dāng)PPR10變體在塊莖特異性啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)時(shí)，GFP的積累水平占總可溶性蛋白的1.3%，因此，該系統(tǒng)能夠增加非光合質(zhì)體中外源基因的表達(dá)，但不會(huì)干擾葉片中的葉綠體基因表達(dá)。

表2 近5年開發(fā)的新型誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)

Rochaix等[100]建立了-葉綠體基因誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，其中銅離子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Cyc6驅(qū)動(dòng)核基因的表達(dá)，該基因編碼一種靶向葉綠體的蛋白質(zhì)，特異性作用于葉綠體基因的5′UTR，是保持基因mRNA和光系統(tǒng)II穩(wěn)定性所必需的。當(dāng)有銅離子存在時(shí)，基因的表達(dá)被抑制，導(dǎo)致基因的mRNA穩(wěn)定性降低，當(dāng)沒有銅離子存在時(shí)，基因發(fā)生表達(dá)，進(jìn)而提高了基因的mRNA穩(wěn)定性及其蛋白的表達(dá)水平。通過用的5′UTR替換其他質(zhì)體基因的5′UTR，理論上可將這種誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)用于任何質(zhì)體基因的表達(dá)調(diào)控研究。

此外，Carrera-Pacheco等[72]還開發(fā)了用于調(diào)控質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)的增強(qiáng)子TDA1，該增強(qiáng)子由核基因組編碼，其C端(cTDA1)可通過與5′UTR的相互作用促進(jìn)的翻譯。該研究將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子HSP70A-RBCS2驅(qū)動(dòng)的cTDA1在萊茵衣藻細(xì)胞核中表達(dá)，將5′UTR調(diào)控的基因在萊茵衣藻質(zhì)體中表達(dá)；通過對(duì)萊茵衣藻進(jìn)行特定的熱休克及光照處理后，檢測到萊茵衣藻中GFP的表達(dá)水平最高增長了約1.9倍，表明GFP的表達(dá)水平與cTDA1的積累水平有關(guān)。

3.2.2 質(zhì)體誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)

質(zhì)體基因工程可高效表達(dá)異源蛋白，避免基因沉默和位置效應(yīng)，且生物安全性高[101,102]，但質(zhì)體誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)需要利用細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件。為此，研究人員開發(fā)了一系列能夠在質(zhì)體中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)。

蝦青素(astaxanthin)是迄今為止自然界中最強(qiáng)的天然抗氧化劑[103,104]，當(dāng)前已實(shí)現(xiàn)了其生物合成途徑在轉(zhuǎn)質(zhì)體種子植物中的異源表達(dá)及高水平積累[78,91]，但蝦青素的合成對(duì)類異戊二烯前體的消耗限制了葉綠素、類胡蘿卜素和植物激素的生物合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)質(zhì)體植物出現(xiàn)了嚴(yán)重的生長遲緩。因此，在最近的一項(xiàng)研究中，作者利用質(zhì)體誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)解決了這一問題[33]。該系統(tǒng)利用茶堿依賴性核糖開關(guān)，可通過小分子化合物茶堿調(diào)控T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生少量的T7 RNA聚合酶作用于質(zhì)體基因組T7啟動(dòng)子，在該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的蝦青素合成操縱子產(chǎn)生了大量轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步提高了蝦青素的積累水平，且與組成型轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草相比[91]蝦青素的含量并未顯著減少。更重要的是，誘導(dǎo)型植物與野生型的表型幾乎一致，說明該誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)未對(duì)植物的正常生長造成影響。

萊茵衣藻葉綠體基因組中不含有終止密碼子TGA，Young等[105]利用這一特性開發(fā)了一種簡單的質(zhì)體誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，將trnW基因整合至萊茵衣藻的葉綠體基因組，該基因可編碼一種對(duì)溫度敏感的突變體tRNA，因此，包含TGA密碼子的外源基因在P的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)水平隨培養(yǎng)溫度的降低而逐漸升高，當(dāng)溫度降低至15℃時(shí)表達(dá)水平最高，當(dāng)溫度升高至35℃時(shí)，蛋白表達(dá)水平降至最低或完全不表達(dá)。此外，作者還可通過改變轉(zhuǎn)基因內(nèi)TGA密碼子的數(shù)量來精準(zhǔn)調(diào)控外源基因的表達(dá)水平。該系統(tǒng)為萊茵衣藻的質(zhì)體基因工程提供了新工具，并能夠進(jìn)一步開發(fā)為研究葉綠體中必需基因功能的熱抑制系統(tǒng)。

4 結(jié)語與展望

表達(dá)調(diào)控元件的選擇和組合方式對(duì)于質(zhì)體基因工程研究至關(guān)重要，其中啟動(dòng)子決定了轉(zhuǎn)錄速率[28]，5′UTR決定了mRNA的翻譯效率[29]，3′UTR主要負(fù)責(zé)維持mRNA的穩(wěn)定性[30]。值得注意的是，內(nèi)源表達(dá)調(diào)控元件的使用雖然在一定程度上可以保證基因的表達(dá)水平，但也存在著發(fā)生非預(yù)期同源重組從而影響蛋白表達(dá)水平的可能性。葉綠體基因組中反向重復(fù)區(qū)的重組會(huì)導(dǎo)致插入序列的翻轉(zhuǎn)，這種重組現(xiàn)象也叫做翻轉(zhuǎn)(flip-flop)重組。Rogalski等[108]在探究煙草質(zhì)體核糖體蛋白 S18是否影響細(xì)胞存活時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)在葉綠體基因組短反向重復(fù)序列發(fā)生了兩次flip-flop重組，這種重組事件的發(fā)生使得該研究在使用I酶進(jìn)行限制片段長度多態(tài)性分析時(shí)，除產(chǎn)生了預(yù)計(jì)大小為6 kb的片段外，還額外產(chǎn)生了大小為5 kb的雜交片段。在此基礎(chǔ)上，該研究使用限制性內(nèi)切酶I和R V進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，除產(chǎn)生了預(yù)計(jì)大小為9 kb的片段外，還產(chǎn)生了一個(gè)長度明顯更小(6.2 kb)的片段。Zhou等[32]在檢測轉(zhuǎn)質(zhì)體中HIV 抗原結(jié)合操縱子的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)質(zhì)體植物的不同表型與這種非預(yù)期同源重組相關(guān)。在未發(fā)生flip-flop重組的情況下，由全長P驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致了色素缺乏型，即黃色煙草的產(chǎn)生。而flip-flop重組事件發(fā)生后，由截短的P啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，使得該基因的表達(dá)水平大幅下降，因此未產(chǎn)生色素缺乏型煙草。為了避免內(nèi)源調(diào)控元件之間發(fā)生非預(yù)期同源重組，近年來研究者們也在積極開發(fā)并使用一些異源調(diào)控序列，例如在煙草葉綠體操縱子構(gòu)建中使用玉米來源的啟動(dòng)子ZmP[19]和5′UTR ZmL[71]、衣藻來源的啟動(dòng)子CrP與3′UTR CrT[73]以及大腸桿菌來源的3′UTR T[45]。

利用多基因共表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)可以顯著提升異源復(fù)雜生化途徑引入質(zhì)體基因組的可行性，但在設(shè)計(jì)構(gòu)建多順反子操縱子時(shí)，仍需盡可能避免重復(fù)使用單一的IEE樣元件。此外，在某些情況下，質(zhì)體中的多順反子mRNA也可以直接作為翻譯的模板。Staub等[109]為了確定在質(zhì)體中是否存在啟動(dòng)子遠(yuǎn)端開放閱讀框的翻譯起始，將不含有啟動(dòng)子的報(bào)告基因整合到了煙草質(zhì)體基因組基因的下游區(qū)域后未產(chǎn)生單順反子mRNA。然而由于基因的3′UTR轉(zhuǎn)錄終止效率較低，產(chǎn)生了包含基因作為第二個(gè)順反子的多順反子轉(zhuǎn)錄單元，轉(zhuǎn)質(zhì)體植物中仍能檢測到報(bào)告基因編碼的產(chǎn)物GUS的表達(dá)，表明啟動(dòng)子遠(yuǎn)端順反子可以在質(zhì)體中進(jìn)行有效翻譯。Quesada-Vargas等[110]首次對(duì)煙草葉綠體基因組中異源操縱子的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯過程進(jìn)行表征。含有不同異源操縱子(操縱子、操縱子、操縱子和操縱子)的葉綠體轉(zhuǎn)基因系中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子mRNA。盡管在轉(zhuǎn)質(zhì)體內(nèi)缺乏對(duì)此類多順反子mRNA的加工，但仍能檢測到較高水平的外源蛋白，說明葉綠體可以直接翻譯異源多順反子mRNA，即使在不存在3′UTR的情況下，加工和未加工的異源多順反子mRNA均是穩(wěn)定的。

經(jīng)過30多年的發(fā)展，用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究的表達(dá)調(diào)控元件種類已十分可觀，這些元件已基本能夠適應(yīng)絕大多數(shù)研究目的及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需求，而關(guān)于非綠色組織中質(zhì)體調(diào)控系統(tǒng)的報(bào)道仍然較少[99]。此外，利用誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)盡管能夠有效降低異源合成所帶來的有害影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)的精準(zhǔn)調(diào)控[72,83,99]，但這類系統(tǒng)需要在非誘導(dǎo)狀態(tài)下避免表達(dá)泄露并兼顧更廣的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)范圍，因此需對(duì)質(zhì)體誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行更加深入的研究。

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Progress on regulatory elements of plant plastid genetic engineering

Yifan Yu1,2, Zhen OuYang2, Juan Guo1, Yujun Zhao1, Luqi Huang1,2

With the advancement of plant synthetic biology, plastids have emerged as an optimal platform for the heterologous production of numerous commercially valuable secondary metabolites and therapeutic proteins. In comparison on nuclear genetic engineering, plastid genetic engineering offers unique advantages in terms of efficient expression of foreign genes and biological safety. However, the constitutive expression of foreign genes in the plastid system may impede plant growth. Therefore, it is imperative to further elucidate and design regulatory elements that can achieve precise regulation of foreign genes. In this review, we summarize the progress made in developing regulatory elements for plastid genetic engineering, including operon design and optimization, multi-gene coexpression regulation strategies, and identification of new expression regulatory elements. These findings provide valuable insights for future research.

plant synthetic biology; plastid genetic engineering; genetic transformation; operon; regulatory element

2023-01-30;

2023-04-29;

2023-05-22

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)”(編號(hào)：2060302)和中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(編號(hào)：ZZ15-YQ-061，ZZXT202103)資助[Supported by the Key Project at Central Government Level(No.2060302) and the Fundamental Research Funds for the Central Public Welfare Research Institutes(Nos. ZZ15-YQ-061, ZZXT202103)]

于一凡，在讀博士研究生，專業(yè)方向：分子生藥學(xué)。E-mail: 18641603721@163.com

趙瑜君，助理研究員，研究方向：中藥資源與分子生藥學(xué)。E-mail: zhaoyj@nrc.ac.cn

黃璐琦，研究員，研究方向：中藥資源與分子生藥學(xué)。E-mail: huangluqi01@126.com

10.16288/j.yczz.23-021

(責(zé)任編委: 宋任濤)