不同消毒方法和激素配比對百薯2 號(hào)莖尖脫毒培養(yǎng)的影響

王鐵固,朝郁坤,卜文曼,宋奕良,趙元增

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453000;2.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 新鄉(xiāng)453000）

甘薯（Ipomoea batatas L.）是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和生物能源作物,為全球第七大糧食作物,也是我國五大糧食作物之一,具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和多用途特點(diǎn)[1],為我國甚至世界糧食安全和能源安全發(fā)揮了重要的作用[2-4].甘薯由于產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣和光合效率高等特點(diǎn),因此自二十世紀(jì)六、七十年代始被全球廣泛種植.我國是甘薯生產(chǎn)大國之一,種植面積和總產(chǎn)量分別占世界的45%和75%左右[5].如今甘薯已成為我國的第四大糧食作物,僅次于小麥、水稻和玉米,總產(chǎn)量居世界首位[6].但是,由于甘薯是無性繁殖的作物,主要通過塊根和莖蔓進(jìn)行繁殖,因此在栽培時(shí)容易受到病毒的侵染而且難以防治[7].甘薯病毒病對甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)有較大影響,特別對甘薯增產(chǎn)存在明顯的負(fù)面影響[8],嚴(yán)重可導(dǎo)致甘薯品種退化、產(chǎn)量縮減、經(jīng)濟(jì)效益下降等諸多問題,其在我國的發(fā)病率高達(dá)60%～90%[11].據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),甘薯病毒病導(dǎo)致我國每年約損失40 億元[10].

目前防治甘薯病毒病最有效的方法是通過甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)來獲取脫毒苗, 由此保障甘薯的穩(wěn)定高產(chǎn)和品種優(yōu)化.利用莖尖存在無病毒組織,繼而在無菌條件下切取甘薯莖尖無病毒組織進(jìn)行離體培養(yǎng),可得到不帶病毒的植株[11].在進(jìn)行甘薯的莖尖分生組織培養(yǎng)時(shí),外植體的消毒方法可以影響到莖尖的污染率和成活率, 目前對甘薯外植體進(jìn)行消毒處理有體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液、0.1%的升汞以及二者相結(jié)合的方法.在甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)的過程中6-BA、NAA 等激素起著關(guān)鍵作用.6-BA 為細(xì)胞分裂素,其主要作用是促進(jìn)芽的形成,也可誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生.NAA 為植物生長調(diào)節(jié)劑,能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大,誘導(dǎo)甘薯不定根的形成與發(fā)育.在甘薯脫毒苗的組織培養(yǎng)過程中,只有通過添加外源激素,才能打破個(gè)體內(nèi)源激素間的平衡,并且要有適當(dāng)?shù)臐舛扰浔?才能使甘薯芽的分化和生長達(dá)到最佳點(diǎn).

許多研究結(jié)果表明,不同的甘薯品種之間由于基因型的差異,因此采用不同的外植體消毒方法和培養(yǎng)基中不同激素的濃度配比,獲得的植株再生率和脫毒率也不同.百薯2 號(hào)是河南科技學(xué)院甘薯育種團(tuán)隊(duì)選育的葉菜型紫薯新品種,具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、莖葉甘甜可口、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn).2022 年申請了國家植物新品種保護(hù).本研究以百薯2 號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料,采用不同的外植體消毒處理和不同的激素濃度配比,以期獲得百薯2 號(hào)莖尖組織培養(yǎng)脫毒苗的最佳培養(yǎng)體系,為百薯2 號(hào)在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為百薯2 號(hào),由河南科技學(xué)院甘薯育種團(tuán)隊(duì)提供.外植體從試驗(yàn)田的百薯2 號(hào)植株中選取生長健壯的1 cm 左右甘薯頂芽,去掉多余葉片.隨后在自來水下沖洗8～10 s,并用毛刷洗去表面的灰塵及泥土.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 在超凈工作臺(tái)中將洗凈的甘薯頂芽放入燒杯中進(jìn)行表面消毒, 采取A:體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液8 s+0.1%升汞6～7 min、B:0.1%升汞6～7 min、C:體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液3～5 s+0.1%升汞3～4 min 三種不同的消毒處理方法進(jìn)行消毒,每種處理消毒10 個(gè)莖尖,4 次重復(fù).消毒完成后用無菌水再次涮洗2～3 次,隨后將其置于已高溫滅菌的操作濾紙表面待用.

1.2.2 莖尖剝離 將消毒好的甘薯頂芽利用解剖鏡在超凈工作臺(tái)中先剝?nèi)ビ兹~,到5～6 層時(shí),采用“一刀切”的快速剝離技術(shù),即使用已消毒的解剖刀一刀切下,然后用解剖針分離的快速剝離技術(shù),將解剖鏡下較大的葉原基切除,隨后用解剖針將莖尖頂端的生長點(diǎn)分離開來.

1.2.3 莖尖接種 使用解剖針將甘薯莖尖頂端的生長點(diǎn)挑到高溫滅菌之后并裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,在此過程中應(yīng)始終保持于酒精燈上方操作,避免實(shí)驗(yàn)發(fā)生污染進(jìn)而影響莖尖培養(yǎng)的脫毒效果.

1.2.4 莖尖誘導(dǎo) 莖尖生長點(diǎn)接種于培養(yǎng)瓶后便開始莖尖誘導(dǎo).分別采取13 種不同處理的激素濃度配比培養(yǎng)基對其進(jìn)行培養(yǎng),具體見表1.每種處理的培養(yǎng)基誘導(dǎo)10 個(gè)莖尖,4 次重復(fù),30 d 后調(diào)查其莖尖誘導(dǎo)率.

表1 甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)基6-BA 與NAA 配比Tab.1 Ratio of 6-BA and NAA in sweet potato stem tip virus-free medium

1.2.5 再生苗的增殖誘導(dǎo) 莖尖培養(yǎng)30 d 左右即可分化出不定芽, 隨后開始增殖生根長葉形成再生苗,60 d 后檢查其成苗率.

1.2.6 再生苗根的誘導(dǎo) 脫毒再生苗的快速繁殖可以利用單個(gè)帶葉片莖段進(jìn)行,即在無菌的條件下把再生苗莖段利用消毒后的剪刀剪切為幾部分小莖段,每一部分小莖段分別帶一片葉,隨后用鑷子將其扦插移植入新的MS 培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)單莖葉生根以形成一顆完整植株.

1.2.7 培養(yǎng)條件 上述所有使用的培養(yǎng)基均添加蔗糖3%/mL、瓊脂0.44%/mL,pH 值為5.8,120 ℃高溫滅菌20 min,培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃,光照時(shí)間13 h/d,光照強(qiáng)度2 500 lx.

1.2.8 再生苗的主要病毒檢測 脫毒再生苗在培養(yǎng)基中培養(yǎng)50～60 d,葉片數(shù)長到5～6 片左右,對其進(jìn)行主要病毒的檢測,檢測的病毒種類有:甘薯卷葉病毒（SPLCV）;甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）;甘薯病毒2（SPV2）;甘薯潛隱病毒（SPLV）;甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）;甘薯G 病毒（SPVG）;甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）.將脫毒再生苗從培養(yǎng)基中取出,剪下新鮮葉片3～4 片,送至河南華智營養(yǎng)科技有限公司進(jìn)行病毒檢測.

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析 污染率、成活率的計(jì)算分別見下列公式

數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics Version 19 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的外植體消毒方法對莖尖成活率影響

不同外植體消毒方法處理獲得的愈傷組織污染率和成活率列入表2.由表2 可知,外植體的不同消毒方法對愈傷組織的污染率和成活率有顯著影響.其中處理A 為最佳,獲得的愈傷組織成活率最高,污染率最低.而單一采用0.1%升汞的處理B 效果最差,成活率最低,污染率最高.這一結(jié)果與蔣素華等[12]、丁明珠等[13]、劉揚(yáng)等[14]結(jié)果有一定差異,表明不同甘薯品種莖尖組織培養(yǎng)時(shí)可采用不同的外植體消毒方法,已獲得最佳的處理效果.

表2 不同消毒方法對莖尖成活率的影響Tab.2 Effects of different disinfection methods on survival rate of stem tip

2.2 不同的激素質(zhì)量濃度培養(yǎng)基對莖尖誘導(dǎo)的影響

將莖尖生長點(diǎn)接種到培養(yǎng)基30 d 后觀察其生長狀況,統(tǒng)計(jì)出芽的莖尖數(shù),計(jì)算誘導(dǎo)率,結(jié)果見表3.

表3 不同培養(yǎng)基配比對莖尖誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different media ratio on stem tip induction

對莖尖誘導(dǎo)率的結(jié)果進(jìn)行差異顯著性比較,結(jié)果如圖1 所示.由圖1 可知,不同激素質(zhì)量濃度配比對莖尖誘導(dǎo)的效果有著顯著影響.百薯2 號(hào)莖尖在無激素的MS 培養(yǎng)基中沒有誘導(dǎo)效果;在添加1.0 mg/L 6-BA+0 mg/L NAA 的培養(yǎng)基A2處理中,百薯2 號(hào)莖尖誘導(dǎo)率最高,平均值達(dá)到0.98±0.05,其莖尖生長較快,不定芽發(fā)育正常,葉芽呈正常綠色;在添加0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 的A1+B3處理中,莖尖誘導(dǎo)率最低,平均值為0.60±0.08,其莖尖大多僅分化為愈傷組織,不定芽分化較少,只生長出少量葉片.說明不同的6-BA 和NAA 激素濃度配比對百薯2 號(hào)莖尖誘導(dǎo)有不同的促進(jìn)和抑制作用,莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳選擇為A2.

圖1 不同處理方法對莖尖誘導(dǎo)影響的顯著性差異Fig.1 Significant difference of different treatment methods on shoot tip induction

2.3 不同的激素質(zhì)量濃度培養(yǎng)基對再生苗增殖的影響

莖尖培養(yǎng)30～40 d 左右即可分化出苗,40～50 d 后可增殖5～7 片葉.不同處理百薯2 號(hào)莖尖的成苗率結(jié)果見表4.

表4 不同培養(yǎng)基配比對再生苗增殖的影響Tab.4 Effects of different media ratio on the proliferation of regenerated seedlings

不同的6-BA 和NAA 激素質(zhì)量濃度配比對百薯2 號(hào)再生苗增殖的影響顯著性比較結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可知,不同質(zhì)量濃度配比的6-BA 和NAA 對百薯2 號(hào)再生苗的成苗率影響達(dá)到顯著水平.在添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培養(yǎng)基A2+B1處理中,百薯2 號(hào)再生苗成苗率最高,平均值為0.90±0.08,其再生苗生長發(fā)育快,葉片和不定根數(shù)量多,葉片呈正常綠色且莖段較粗;在添加0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA 的A1+B3處理中,再生苗成苗率最低,平均值為0.40±0.08,其大多未形成完整的再生苗或仍為愈傷組織,其原因可能是百薯2 號(hào)含內(nèi)源激素造成的.這一結(jié)果與黃迎冬等[15]、楊育峰等[16]、胡琳琳等[17]的研究結(jié)果有一定差異,表明不同甘薯品種之間的莖尖分生組織的脫毒培養(yǎng)體系并不一致.

圖2 不同處理方法對再生苗增殖影響的顯著性差異Fig.2 Significant differences of different treatment methods on the proliferation of regenerated seedlings

2.4 再生苗的主要病毒檢測結(jié)果

我國已報(bào)道的甘薯病毒有20 多種,對甘薯生產(chǎn)影響較大的主要有馬鈴薯Y 病毒屬病毒、甘薯雙生病毒和甘薯褪綠矮化病毒等[18].本試驗(yàn)針對主要的8 種病毒:甘薯卷葉病毒（SPLCV）、甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯病毒2（SPV2）、甘薯潛隱病毒（SPLV）、甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）、甘薯G 病毒（SPVG）和甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）,將獲得百薯2 號(hào)脫毒再生苗委托河南華智營養(yǎng)科技有限公司進(jìn)行病毒檢測,檢測結(jié)果如圖3 所示.由圖可見,本試驗(yàn)獲得的百薯2 號(hào)莖尖脫毒再生苗均未檢測出上述病毒.

圖3 百薯2 號(hào)樣品病毒RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR amplification products of Baishu 2 sample virus

3 結(jié)論

本研究以百薯2 號(hào)為試驗(yàn)材料,對百薯2 號(hào)莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行了優(yōu)化.

結(jié)果表明,不同的甘薯品種之間采用不同的外植體消毒方法效果存在明顯差異.體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液8 s+0.1%升汞6～7 min,對于百薯2 號(hào)莖尖外植體組織的消毒效果最好,可有效地降低外植體的污染率,提高成活率.

在甘薯脫毒苗的組織培養(yǎng)過程中,只有通過添加外源激素,才能打破個(gè)體內(nèi)源激素間的平衡,并且要有適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量濃度配比,才能使甘薯芽的分化和生長達(dá)到最佳點(diǎn).本試驗(yàn)結(jié)果中不同的激素質(zhì)量濃度配比對百薯2 號(hào)莖尖的誘導(dǎo)率和再生苗的增殖有著顯著影響.其中MS+1.0 mg/L 6-BA+0 mg/L NAA 為最佳莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基,平均誘導(dǎo)率為0.98±0.05;MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 為最佳再生苗增殖培養(yǎng)基,平均成苗率為0.90±0.08.

本研究進(jìn)一步可對百薯2 號(hào)無糖培養(yǎng)快速繁殖脫毒種苗技術(shù)進(jìn)行探索, 以期為百薯2 號(hào)在生產(chǎn)上的快速推廣應(yīng)用提供參考.