c-Myc調(diào)控lnc-CCDC117-1對舌鱗癌進(jìn)展的影響

石清影,朱友明

目前,人類基因組中只有2%的RNA能編碼蛋白質(zhì)[1],其余98%為非編碼RNA[2],其中長度>200 nt的被歸類為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)。LncRNAs具有低豐度及組織特異性表達(dá),通過直接與DNA、RNA和(或)蛋白質(zhì)結(jié)合[3]或在染色質(zhì)、DNA、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[4],影響神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥以及心血管疾病等重大疾病的發(fā)生和結(jié)局。目前,多種 lncRNAs在腫瘤中具有促癌、抑癌作用,如lncRNA BC200、lncRNA MALAT1、H19等[5]。C-Myc是一種關(guān)鍵的致癌轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控人類基因當(dāng)中約15%的表達(dá)[6-7]。其中包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成、能量代謝、翻譯和蛋白合成等一系列生理過程,并與細(xì)胞激活和轉(zhuǎn)化相關(guān)[8-9]。相關(guān)研究[2]表明,c-Myc在腫瘤中有高表達(dá),如Burkitt淋巴瘤、CRC等,并證實(shí)c-Myc在惡性腫瘤進(jìn)展和維持中的關(guān)鍵作用,因此目前其已成為癌癥治療的理想靶點(diǎn)。

因此,鑒于lncRNAs與c-Myc 在腫瘤進(jìn)展過程中的密切聯(lián)系,從致癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 切入,利用基因芯片技術(shù)在c-Myc tet off的P493細(xì)胞中進(jìn)行篩選(在該系統(tǒng)中,加入Doxycycline后c-Myc會下調(diào)),結(jié)果顯示一些由c-Myc正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的新lncRNAs,從中選擇了一個(gè)表達(dá)差異顯著且由c-Myc正調(diào)控的lncRNA,lnc-CCDC117(ENST00000451486),確定為后續(xù)研究對象。Lnc-CCDC117-1定位于人類22號染色體上,長約347個(gè)核苷酸。目前,在惡性腫瘤研究的相關(guān)進(jìn)展中鮮有關(guān)于lnc-CCDC117-1生物學(xué)功能的報(bào)道。該研究表明c-Myc與lnc-CCDC117-1兩者間調(diào)控的相關(guān)性;通過構(gòu)建表達(dá)載體及shRNA技術(shù),過表達(dá)、敲低lnc-CCDC117-1探究其對舌鱗癌細(xì)胞發(fā)展的影響,并為舌鱗癌的早期診斷和治療提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料人胚腎細(xì)胞293T、人舌鱗癌細(xì)胞系HN6、SCC9、CAL27,人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOK、大腸桿菌DH5 α(安徽醫(yī)科大學(xué)口腔實(shí)驗(yàn)室保存)。慢病毒載體plko.1-puro、質(zhì)粒體系pGag、pRev、pVsvg(美國Sigma-Aldrich公司)。表達(dá)載體plko.1-shc-Myc、plko.1-sh-ctrl、flag-c-My(+c-Myc)、pGL3質(zhì)粒、 +c-Myc質(zhì)粒以及renilla質(zhì)粒 (中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供)。 表達(dá)載體+lnc-CCDC117-1、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、pGL3-lnc-CCDC117-1-wt質(zhì)粒和pGL3-lnc-CCDC117-1-mut質(zhì)粒(上海生工生物公司);敲低慢病毒載體plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-1、plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-2以及對照組plko.1-sh-ctrl(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建); 胎牛血清(上海Lonsera公司)、DMEM 高糖培養(yǎng)基(以色列BI公司);轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000(美國invitrogen公司,貨號:11668019); q-PCR相關(guān)試劑(美國Axygen公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)HN6、SCC9、CAL27、293T細(xì)胞,放置于5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng);傳代時(shí)使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化。

1.2.2plko.1-sh-lnc-CCDC117-1表達(dá)載體的構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢lnc-CCDC117-1的基因序列,根據(jù)plko.1-puro載體的敲低骨架特征,設(shè)計(jì)plko.1-sh-lnc-CCDC117-1載體構(gòu)建所需的引物,選擇PAGE純化方式,送上海生工合成。引物序列見表1。分別合成sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2。獲得擴(kuò)增基因后,37 ℃水浴中消化雙酶切plko.1-puro載體,回收酶切產(chǎn)物。1%瓊脂糖凝膠電泳,由T4連接酶將回收的酶切產(chǎn)物和基因片段連接。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α,涂于LB(含Amp抗性)平板上,37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。第2天挑取菌落,篩選陽性克隆,送公司測序鑒定,成功構(gòu)建plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-1、plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-2。

1.2.3慢病毒包裝和轉(zhuǎn)染HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞 取上述已構(gòu)建成功且攜帶目的片段的表達(dá)載體(3 μg)和病毒包裝質(zhì)粒:3 μg pGag、3 μg pRev、1.5 μg pVsvg,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,使用不含血清的DMEM培養(yǎng)8 h后更換為10% FBS的正常培養(yǎng)基。40 h后收集病毒上清液,0.45 μm PVDF濾器過濾分裝,-80 ℃保存?zhèn)溆?。慢病毒轉(zhuǎn)染: 病毒感染前1天,0.25%胰蛋白酶消化HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞,鋪至小皿,待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%時(shí),將病毒原液分別感染HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞。同時(shí)加入3.5 μl的polybrene(濃度為8 mg/ml),37 ℃孵育12 h,加入嘌呤霉素篩選1～2周。

1.2.4qRT-PCR檢測lnc-CCDC117-1的表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后的HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞各5組(轉(zhuǎn)染shc-Myc、+c-Myc、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其各對照組),按TRIzol試劑說明書分別提取各組細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,-20 ℃保存待用。將含有待擴(kuò)增序列的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng),總體積20 μl包括:上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl,2× q-PCR Mix 10 μl,ROX 0.4 μl,cDNA 2 μl,無菌蒸餾水6 μl。在PCR擴(kuò)增儀上完成PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃、2 min,95 ℃、5 s,60 ℃、15 s,72 ℃、20 s,重復(fù)55個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取各組結(jié)果,以β-actin作為分子內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法分析比較各組lnc-CCDC117-1的表達(dá)。引物序列見表2。

表2 引物序列

表3 在P493細(xì)胞篩選中顯示3個(gè)lncRNA響應(yīng)c-Myc

表4 在HN6細(xì)胞中驗(yàn)證c-Myc對3個(gè)lncRNA的影響

表5 lnc-CCDC117-1基本數(shù)據(jù)

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測啟動子活性 共轉(zhuǎn)染pGL3-lnc-CCDC117-1-wt與+c-Myc組,pGL3-lnc-CCDC117-1-mut與+c-Myc組及其對照組。轉(zhuǎn)染后48 h加入100 μl細(xì)胞裂解液,冰上充分裂解5 min。吸取細(xì)胞裂解液至新的EP管中,12 000 r/min離心2 min,收集上清液備用。取干凈的EP管放在Promega熒光檢測儀中檢測本底熒光值,記作L0。吸取10 μl Luciferase Substrate 到新的EP管內(nèi),小心的吸取20 μl細(xì)胞裂解液上清液,吹打混勻5次后立即放入熒光檢測儀中檢測。該值是螢火蟲熒光素酶的熒光值,記作L1。繼續(xù)向管中加入10 μl Renilla Substrate工作液,迅速吹打混勻5次放入熒光檢測儀中檢測。該值為海腎熒光素酶的熒光值,記作R1。整理得到的熒光值,用L1-L0/R1-L0計(jì)算出每管樣品的數(shù)值,繪制柱狀圖。

1.2.6熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測lnc-CCDC117-1在細(xì)胞內(nèi)的定位 將準(zhǔn)備好的細(xì)胞置于4%的多聚甲醛,室溫下固定15 min。根據(jù)試劑盒說明配制好所需溶液(Buffer A,Buffer C,Buffer E,Buffer F)。棄去固定液,每孔加入200 μl 0.1%的Buffer A,室溫靜置15 min; PBS潤洗細(xì)胞2次。向孔中加入200 μl 2× Buffer C,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min;繼續(xù)加入200 μl變性處理后的探針混合液,避光孵育至雜交過夜。次日依次向每孔加入200 μl 42 ℃預(yù)熱的Buffer F、Buffer C浸洗5 min。,避光條件下DAPI染核20 min。滴加3～5 μl抗淬滅劑,于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7生長曲線實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其對照組后的HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞按1×104個(gè)/孔密度鋪至12孔板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37 ℃分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù),繪制生長曲線。

1.2.8CCK-8 法檢測HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞生長 收取轉(zhuǎn)染了sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其對照組的HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞,按照2×103個(gè)/孔密度接種于96孔板,設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁,37 ℃分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h;加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)避光孵育4 h,在酶標(biāo)儀450 nm處測量各孔的吸光值(OD)。

1.2.9細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1和對照組HN6、SCC9細(xì)胞鋪至6孔板,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后用20 μl黃槍頭劃線后培養(yǎng)過夜。24 h后在顯微鏡下觀察拍照,分析對比細(xì)胞劃痕變化。

1.2.10克隆形成實(shí)驗(yàn) 取sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1和對照組CAL27細(xì)胞接種于6孔板,400個(gè)/孔,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔加入2 ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d,4%多聚甲醛室溫下固定30 min,1%結(jié)晶紫染色4 h,清洗晾干并觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 lnc-CCDC117-1的篩選與鑒定該研究通過基因芯片技術(shù),在c-Myc tet off的P493細(xì)胞中進(jìn)行篩選(在該系統(tǒng)中,加入Doxycycline后c-Myc會下調(diào)),結(jié)果顯示有一些c-Myc正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的lncRNAs。進(jìn)一步在HN6細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證,從中選擇了一個(gè)高表達(dá)且變化量約15倍的lncRNA:lnc-CCDC117-1(ENST00000451486),認(rèn)為其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此確定為后續(xù)研究對象。因在該系統(tǒng)中c-Myc下調(diào),而在此結(jié)果中檢測到lnc-CCDC117-1表達(dá)也下調(diào),故猜測lnc-CCDC117-1受c-Myc正性調(diào)控。檢測數(shù)據(jù)見表3-5。qRT-PCR檢測HOK、HN6、SCC9、CAL27 4種細(xì)胞系中l(wèi)nc-CCDC117-1的表達(dá)情況。顯示與HOK對照組相比, HN6組、SCC9組、CAL27組內(nèi)lnc-CCDC117-1表達(dá)水平上調(diào)(t=2.804,P<0.05;t=2.866,P<0.05;t=5.374,P<0.01),見圖1。因此,選擇有高表達(dá)水平的HN6、SCC9、CAL27細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 lnc-CCDC117-1在3種口腔癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2.2 檢測c-Myc對lnc-CCDC117-1啟動子活性的影響合成pGL3-lnc-CCDC117-1-wt和pGL3-lnc-CCDC117-1-mut序列,克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-basic中。將構(gòu)建的熒光素酶質(zhì)粒載體與ctrl、+c-Myc 共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,比較各組熒光信號的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示, pGL3-lnc-CCDC117-1-mut和+c-Myc共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,細(xì)胞的熒光信號值與對照組相比無明顯變化,但共轉(zhuǎn)染pGL3-lnc-CCDC117-1-wt和+c-Myc組后熒光信號值顯著高于對照組(t=6.133,P<0.01)。見圖2。

圖2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證c-Myc和lnc-CCDC117-1靶向結(jié)合

2.3 lnc-CCDC117-1在細(xì)胞中的定位情況

2.3.1核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) 取成功分離的細(xì)胞上清液和沉淀,分別通過qRT-PCR和Western blot檢測,結(jié)果顯示lnc-CCDC117-1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)(t=22.02,P<0.001)。見圖3。

圖3 核質(zhì)分離Western blot法、qRT-PCR法檢測lnc-CCDC117-1的定位情況

2.3.2Fish 檢測 lnc-CCDC117-1的細(xì)胞內(nèi)定位 倒置熒光顯微鏡下觀察,lnc-CCDC117-1呈現(xiàn)出綠色熒光,細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色。將圖像合并可見lnc-CCDC117-1定位于細(xì)胞核內(nèi)。說明lnc-CCDC117-1可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。見圖4。

圖4 lnc-CCDC117-1 在細(xì)胞內(nèi)的定位 ×40

2.4 敲低c-Myc對舌鱗癌細(xì)胞HN6/SCC9/CAL27中l(wèi)nc-CCDC117-1表達(dá)的影響將shc-Myc轉(zhuǎn)染至HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞,qRT-PCR檢測敲低c-Myc后HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞內(nèi)lnc-CCDC117-1的表達(dá)量,顯示lnc-CCDC117-1水平均低于sh-ctrl組(t=14.13、68.24、11.59,P<0.001)。見圖5。

圖5 shc-Myc對HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1表達(dá)的影響

2.5 過表達(dá)c-Myc對舌鱗癌細(xì)胞HN6/SCC9/CAL27中l(wèi)nc-CCDC117-1表達(dá)的影響將+c-Myc轉(zhuǎn)染至HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞,qRT-PCR檢測c-Myc過表達(dá)后的HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞內(nèi)lnc-CCDC117-1的表達(dá)量,顯示lnc-CCDC117-1水平均高于轉(zhuǎn)染ctrl組(t=9.513,P<0.001;t=29.71,P<0.001;t=5.309,P<0.01)。見圖6。

圖6 +c-Myc對HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1表達(dá)的影響

2.6 shlnc-CCDC117-1干擾lnc-CCDC117-1和c-Myc的表達(dá)情況將sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1轉(zhuǎn)染HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞后,qRT-PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組的lnc-CCDC117-1水平顯著低于轉(zhuǎn)染sh-ctrl組(t=5.781,P<0.01;t=9.176,P<0.001)、(t=5.931,P<0.01;t=13.940,P<0.001)、(t=7.362,P<0.01;t=4.359,P<0.05)。見圖7。同樣,轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組的c-Myc水平明顯低于對照組(t=6.267,P<0.01;t=9.557,P<0.001)、(t=18.370,P<0.001;t=27.040,P<0.001)、(t=3.947,P<0.05;t=3.405,P<0.05)。見圖8。

圖7 shlnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1表達(dá)的影響

圖8 shlnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中c-Myc表達(dá)的影響

2.7 +lnc-CCDC117-1對lnc-CCDC117-1表達(dá)水

平的影響將+lnc-CCDC117-1轉(zhuǎn)染HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞,qRT-PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染+lnc-CCDC117-1組的lnc-CCDC117-1水平明顯高于轉(zhuǎn)染ctrl組(t=12.470,P<0.001;t=12.110,P<0.001;t=6.269,P<0.01)。見圖9。

圖9 +lnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1表達(dá)的影響

2.8 lnc-CCDC117-1對HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞生長、增殖、侵襲能力的影響細(xì)胞生長曲線、CCK-8法、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染+lnc-CCDC117-1、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組后HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞的生長增殖、遷移以及集落形成能力。結(jié)果表明,與ctrl組相比,+lnc-CCDC117-1組轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞生長速率明顯增加(t=14.440,P<0.001;t=4.909,P<0.05;t=16.140,P<0.01),見圖10A、C、E;轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1-1,sh-lnc-CCDC117-1-2組,細(xì)胞生長速率明顯低于sh-ctrl組(F=48.360,F=19.210,F=17.020,P<0.01),見圖10B、D、F 。CCK-8法實(shí)驗(yàn)顯示+lnc-CCDC117-1組轉(zhuǎn)染后24 h增值率明顯上升(t=4.635,P<0.05;t=10.65,P<0.01;t=11.820,P<0.01),見圖11A、C、E;轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組,細(xì)胞增殖明顯減慢(F=148.600,F=11.530,F=143.800,P<0.01),見圖11B、D、F。另外,與轉(zhuǎn)染ctrl組比較,+lnc-CCDC117-1組轉(zhuǎn)染后24 h后細(xì)胞遷移速率增加;轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2組,細(xì)胞遷移速率明顯低于sh-ctrl組,見圖12。+lnc-CCDC117-1組細(xì)胞形成集落的數(shù)量比ctrl組增多[(161.00±3.74)vs(214.67±9.29),t=7.581,P<0.01];與sh-ctrl組比較,轉(zhuǎn)染sh1-lnc-CCDC117-1,sh2-lnc-CCDC117-1組的集落個(gè)數(shù)減少[(193.33±6.13)vs(109.33±5.56),(193.33±6.13)vs(85.00±3.56),F=239,P<0.001],見圖13。 因此,可以看出過表達(dá)HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞內(nèi)lnc-CCDC117-1顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖;反之,敲低HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1明顯抑制細(xì)胞增殖與遷移。

圖10 生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖11 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖12 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) ×20

圖13 結(jié)晶紫染色觀察轉(zhuǎn)染sh-lnc-CCDC117-1 、+lnc-CCDC117-1后CAL27細(xì)胞集落形成情況

3 討論

OSCCs是世界上第6大最常見的惡性腫瘤[10],5年病死率約為50%。主要危險(xiǎn)因素有吸煙、飲酒和人乳頭狀瘤病毒感染[11]。作為一種復(fù)雜的腫瘤性疾病,口腔鱗狀細(xì)胞癌好發(fā)于口腔各個(gè)部位,其中以舌鱗癌最為常見。近些年來由于其惡性程度高、轉(zhuǎn)移快、病死率高而預(yù)后較差成為臨床治療的難題,因此,隨著腫瘤分子生物學(xué)發(fā)展,探究舌鱗癌發(fā)生的潛在通路機(jī)制聯(lián)合基因治療受到越來越多的關(guān)注[12]。

C-Myc被列為人類最重要的致癌基因之一。C-Myc的失調(diào)受多種病理?xiàng)l件干擾,包括基因組不穩(wěn)定、免疫細(xì)胞逃逸,不受控制的細(xì)胞增殖、永生化、血管生成和轉(zhuǎn)移等[13-14]。研究表明lncRNA在腫瘤中表達(dá)異常,c-Myc可以調(diào)控一些lncRNA的表達(dá),而lncRNA 也能結(jié)合c-Myc抑制其表達(dá),兩者形成的lncRNA-c-Myc 網(wǎng)絡(luò)影響了腫瘤的進(jìn)程,在腫瘤的轉(zhuǎn)移和激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明一些受c-Myc調(diào)控的lncRNA,例如在0SCC中,c-Myc上調(diào) lncRNA NEAT1促進(jìn)細(xì)胞的增殖進(jìn)而提高 OSCC3 細(xì)胞的糖酵解代謝水平;舌鱗癌細(xì)胞SCC3中l(wèi)ncRNA55受c-Myc負(fù)調(diào)控,c-Myc敲低可以使lncRNA表達(dá)明顯上調(diào)。另有研究[12]表明非小細(xì)胞肺癌H19是c-Myc的下游靶基因,c-Myc能上調(diào)H19表達(dá), H19 進(jìn)而下調(diào)miR-107促進(jìn)腫瘤生長。Feng et al[15]研究表明lncRNA MILIP在人類癌癥中上調(diào),其表達(dá)與MYC表達(dá)水平呈正相關(guān)。MILIP通過抑制TRIML2,降低腫瘤蛋白p53的SUMO化促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和致瘤性,最終導(dǎo)致腫瘤蛋白p53轉(zhuǎn)化,表明MILIP可能是對抗c-Myc軸的抗癌靶點(diǎn)。該研究通過基因芯片技術(shù),篩選出因c-Myc下調(diào)引起表達(dá)差異的lnc-CCDC117-1作為研究對象,探究c-Myc 與lnc-CCDC117-1的調(diào)控關(guān)系,并分析lnc-CCDC117-1對舌鱗癌細(xì)胞發(fā)展的影響。

為了驗(yàn)證舌鱗癌細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1與c-Myc表達(dá)之間的聯(lián)系,建立雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),結(jié)果顯示,c-Myc增強(qiáng)了lnc-CCDC117-1野生型報(bào)告基因的相對活性,說明lnc-CCDC117-1可能是c-Myc的直接靶點(diǎn), c-Myc對lnc-CCDC117-1的轉(zhuǎn)錄活性有調(diào)節(jié)作用。為了增加結(jié)果的可信度, PCR檢測顯示在HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞中c-Myc上調(diào)lnc-CCDC117-1表達(dá)增加,下調(diào)后lnc-CCDC117-1表達(dá)量減少。結(jié)論與上述一致。該研究結(jié)果顯示,在舌鱗癌細(xì)胞中l(wèi)nc-CCDC117-1與c-Myc表達(dá)之間存在正相關(guān)性,推測lnc-CCDC117-1受c-Myc正調(diào)控。進(jìn)一步探究lnc-CCDC117-1在舌鱗癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能,體外構(gòu)建表達(dá)載體sh-lnc-CCDC117-1-1,sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1,轉(zhuǎn)染至HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞,過表達(dá)、敲低lnc-CCDC117-1水平。通過 CCK-8法、細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況,結(jié)果均顯示lnc-CCDC117-1表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的增殖,反之則抑制細(xì)胞生長,說明lnc-CCDC117-1可調(diào)控影響癌細(xì)胞的生長。另外,熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示lnc-CCDC117-1定位在舌鱗癌細(xì)胞核內(nèi),預(yù)測lnc-CCDC117-1在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

綜上所述,該研究表明舌鱗癌細(xì)胞HN6/SCC9/CAL27中l(wèi)nc-CCDC117-1受c-Myc 正調(diào)控,c-Myc參與調(diào)節(jié)lnc-CCDC117-1的轉(zhuǎn)錄活性。過表達(dá)lnc-CCDC117-1水平促進(jìn)HN6/SCC9/CAL27細(xì)胞增殖、遷移能力,反之則會抑制細(xì)胞生長;并表明lnc-CCDC117-1存在于細(xì)胞核當(dāng)中。但該實(shí)驗(yàn)研究尚處于初級階段,對于c-Myc-lnc-CCDC117-1通路怎樣從分子水平干擾細(xì)胞生長仍是未知的。繼續(xù)深入研究lnc-CCDC117-1在舌鱗癌細(xì)胞中的抑制機(jī)制,將為口腔惡性腫瘤的靶向治療提供新的思路和臨床指導(dǎo)意義。