骨形成蛋白7在ESCC中的表達及功能初步探究

孫夢菲,黃紅芳,董宇航,張華坤,周紫茹,孫 琦,管文燕,趙琳玥,崔曉賓, 陳云昭,李 鋒

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetics protein,BMP)原為一種誘導(dǎo)骨組織形成的生長因子,它的亞型除BMP1是金屬蛋白酶家族外,其余如BMP7等均隸屬轉(zhuǎn)錄生長因子β(TGF-β)超家族且具有典型的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域[1]。近些年,有研究[2]表明BMP7與腫瘤高度相關(guān),該分子在小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、食管癌等病理生理機制中起著重要價值。食管癌作為全球病死率排在第6位的惡性腫瘤, 其中約一半是病理亞型為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)的中國人[2]。從正常食管到ESCC轉(zhuǎn)化過程中, 不只癌細胞本身發(fā)生了改變, 周圍免疫微環(huán)境也發(fā)生了變化, BMP7可以通過抑制巨噬細胞和CD4+T細胞來調(diào)節(jié)微環(huán)境中的促炎反應(yīng)。但是BMP7在ESCC中研究較少且不一致亟待進一步探討,該研究從組織、細胞、生物信息學(xué)3個層次觀察BMP7在ESCC的表達與臨床病理指標(biāo)和生存的關(guān)系,免疫細胞的相關(guān)性,通路富集分析等探尋BMP7與ESCC產(chǎn)生的分子機制[3-4]。

1 材料與方法

1.1 主要材料EC9706(ESCC細胞系)來源于中國科學(xué)院細胞庫;DAB染色液試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);10%胎牛血清(上海酶研生物科技有限公司);1%青-鏈霉素(大連美侖生物技術(shù)有限公司); RPMI-1640(德國制藥企業(yè)勃林格殷格翰);Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑(賽默飛世爾科技中國區(qū)有限公司);pcDNA3.1BMP7 質(zhì)粒(南京晶百生物科技有限公司);Young PAGE預(yù)制膠(南京金斯瑞生物科技有限公司);Loading Buffer(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);轉(zhuǎn)膜液(蘇州新賽美生物科技有限公司);蛋白酶封閉液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);羊抗兔二抗等抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司); ECL 化學(xué)發(fā)光底物(廣州碩譜生物科技有限公司);0.1%結(jié)晶紫(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 組織樣本收集整理2000—2021年食管鱗狀細胞癌石蠟包埋組織樣本共 516 例,其中,有274例為癌組織,242例為正常組織。所收集的病例均得到患者的同意并簽署醫(yī)學(xué)倫理委員會的知情同意書,通過電話和隨訪信等進行隨訪(截止時間: 2021 年9 月)。

1.3 免疫組化染色使用DAB染色液試劑盒,免疫組化操作程序:脫蠟和水化,抗原修復(fù), 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,滴加一抗,滴加酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物,DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片、閱片。2位有相應(yīng)資質(zhì)的病理醫(yī)師遵循2019版WHO 消化系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)對染色效果進行判讀。依據(jù)棕黃色為陽性,細胞著色強度和腫瘤細胞陽性百分比分?jǐn)?shù)評分的具體細節(jié)(無著色=0,黃色=1,棕黃色=2,棕色=3;腫瘤細胞陽性百分比<5%=0,6%～25%=1,26%～50%=2,51%～75%=3,75%～100%=4),其免疫組化評分等于細胞著色強度分?jǐn)?shù)與腫瘤細胞陽性百分比分?jǐn)?shù)的乘積(免疫組化評分≤8為低表達,評分>8為高表達)。

1.4 細胞培養(yǎng)EC9706(ESCC細胞系)細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 EC9706培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的 RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基中,并置于 37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。

1.5 細胞學(xué)實驗當(dāng)細胞密度約85%開展實驗處理;鋪板6孔板每孔計數(shù)60萬個細胞,過夜細胞貼壁后,EP管各加入100 μl RPMI-1640培養(yǎng)基,再分別添加7.5 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和2.5 μg pcDNA3.1BMP7 質(zhì)粒。① Western blot 實驗應(yīng)用YoungPAGE預(yù)制膠,將轉(zhuǎn)染 48 h后的細胞用 PBS 清洗 3 遍,蛋白提取全程在冰上進行,加入5× Loading Buffer 100 ℃煮沸 10 min,電泳后采用快速轉(zhuǎn)膜液濕轉(zhuǎn)法400 mA 30 min轉(zhuǎn)膜,無蛋白酶封閉液封閉10～15 min,敷一抗4 ℃過夜(BMP7 1 ∶500; GAPDH 1 ∶50 000),1×TBST 清洗,4 ℃孵二抗孵育2 h(羊抗兔二抗 1 ∶10 000)(BMP7、GAPDH、羊抗兔二抗等抗體),1×TBST 清洗, 使用 ECL 化學(xué)發(fā)光底物顯色。② CCK-8與Clone實驗將轉(zhuǎn)染細胞在 96 孔板中每孔接種約2 000 個,每組每個時間點設(shè)置3復(fù)孔,每個時間點至少留1個無細胞孔作為調(diào)零孔,96孔板旁邊一圈要加無菌PBS防蒸發(fā),測6 d共6個時間點,取3 次的均值。平板克隆每孔 1 000 個細胞接種于6 孔板中,培養(yǎng)10 d左右顯示肉眼可見的克隆后PBS 清洗3次,4%多聚甲醛于 4 ℃固定 20 min,重復(fù)清洗,0.1%結(jié)晶紫4 ℃染色, 20 min后 PBS 再次清洗3次。Image J軟件計算細胞克隆數(shù)。Transwell 遷移實驗將轉(zhuǎn)染48 h 后的細胞密度約為 1×105個/ml加入上室 200 μl,下室加入 500 μl 含 20% FBS 培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出,吸去上室培養(yǎng)基,10%甲醇溶液固定細胞30 s,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,自來水中清洗至背景清晰。

1.6 生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)使用TCGA數(shù)據(jù)庫和limma、reshape2、ggpubr、vioplot、ggExtra等包繪制免疫浸潤圖,同時用gridExtra、ggplot2等包畫GSEA圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 26.0 軟件統(tǒng)計分析,BMP7于正常食管鱗狀上皮與鱗癌組織之間以及高低表達BMP7兩組樣本臨床信息之間比較均采用χ2,預(yù)后生存曲線分析使用Kaplan-Meier 法,ESCC預(yù)后的單因素和多因素分析運用cox法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。細胞學(xué)實驗每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次,計量資料符合獨立正態(tài)分布方差齊時組間比較用t檢驗,不符合時用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)驗證BMP7表達與臨床信息的關(guān)系

2.1.1BMP7蛋白在ESCC組織的表達 正常食管鱗狀上皮及ESCC組織免疫組化染色顯示(圖 1),BMP7主要富集在胞核,染色具有顯著差異,在ESCC組織中的蛋白表達水平顯著低于癌旁正常食管組織(P<0.05)(表1)。

表1 低、高表達BMP7的兩組樣本的比較[n(%)]

表2 BMP7 表達與臨床特點[n(%),n=226]

2.1.2BMP7表達差異與臨床特征的關(guān)系 具有臨床病理數(shù)據(jù)的226例依據(jù)免疫組化總分(IRS)進行分組(表 2), 分值<8 分為低表達, 分值≥8分為高表達, 其中BMP7的表達差異與不同級別分化程度(P=0.006)、N分期(P<0.001)、 TNM分期(P<0.001)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 正常組織與ESCC組織中BMP7蛋白表達

圖2 ESCC中BMP7蛋白表達差異與生存預(yù)后

2.1.3BMP7與ESCC患者生存預(yù)后和預(yù)后影響因素 有137例ESCC患者通過電話、信件隨訪、病案記錄等方式獲得完整的隨訪信息,通過Kaplan-Meier 生存分析 ESCC患者BMP7蛋白表達水平與生存時間的關(guān)系,BMP7低表達組的生存時間低于高表達者(P=0.041)(圖 2)。單因素分析后把所有因素使用更嚴(yán)格的多因素計算,TNM分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),cox多因素回歸分析顯示TNM分期是影響ESCC預(yù)后的獨立因素(表3)。

表3 ESCC中cox單因素和多因素分析(n=137)

2.2 細胞學(xué)實驗驗證BMP7對ESCC的影響EC9706細胞中,按照轉(zhuǎn)染說明書分別使用不同量 BMP7 質(zhì)粒: Lipofectamine2000 比 例 在 6 孔 板 中 進 行 轉(zhuǎn) 染 分別24、48、72 h轉(zhuǎn)染,同時做了無處理的Control組和轉(zhuǎn)染了正常載體的NC組做對照,BMP7組分別按照 2.5、2.0、3.0 μg濃度梯度,確定最佳轉(zhuǎn)染條件48 h BMP7 質(zhì)粒2.5 μg,Lipofectamine2000 7.5 μl時過表達效果較好(圖 3A)。使用最佳轉(zhuǎn)染條件進行過表達BMP7 對ESCC細胞增殖能力的影響等實驗,在CCK-8實驗中,EC9706細胞過表達 BMP7 組吸光度值低于對照組(P<0.01)(圖3B),平板克隆實驗在EC9706 細胞中過表達 BMP7 組細胞集落數(shù)顯著低于對照組(P<0.000 1)(圖3C),結(jié)果顯示 BMP7可以抑制ESCC細胞的增殖能力。Transwell 遷移結(jié)果顯示過表達 BMP7 組的細胞遷移數(shù)目低于對照組的細胞遷移數(shù)目(P<0.000 1)(圖3D)。

圖3 BMP7對ESCC細胞的影響

2.3 BMP7在ESCC免疫微環(huán)境中的角色基于TCGA數(shù)據(jù)庫去驗證ESCC中BMP7與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性。如圖4A所示,BMP7與B細胞(r=0.373,P=0.008)、樹突狀細胞(r=0.343,P=0.016)、巨噬細胞(r=0.307、P=0.032)、NK細胞(r=-0.304,P=0.034)免疫細胞呈正相關(guān),它與γ-δT細胞(r=-0.313,P=0.028)、M1-TAM(r=-0.353,P=0.013)、M2-TAM(r=-0.281,P=0.050)呈負(fù)相關(guān)。同時,BMP7相關(guān)的基因集GSEA富集分析顯示其與哮喘、自身免疫性甲狀腺疾病、補體與凝血疾病、糖脂磷脂酰肌醇、移植物抗宿主疾病通路呈正相關(guān),與造血細胞系疾病、視黃醇代謝、RNA降解、氨基酸代謝、剪接體通路呈負(fù)相關(guān)(圖4B)。

圖4 BMP7的表達與ESCC中的免疫浸潤水平相關(guān)

2.4 BMP7基因的列線圖根據(jù)年齡、性別、分化程度、N分期、TNM分期、BMP7免疫組化表達評分等繪制可視化列線圖,預(yù)測ESCC患者的患病風(fēng)險,評估預(yù)后生存時間(圖5)。

圖5 ESCC風(fēng)險預(yù)測列線圖

3 討論

近年來,ESCC的發(fā)病率和病死率開始下降,但患者術(shù)后總體生存率仍然較低。尋找有效的分子標(biāo)志物可以為食管鱗狀細胞癌提供新的診斷標(biāo)志物,早診早治提高患者生存率[5]。BMPs發(fā)揮抑癌作用或致癌作用,這取決于細胞環(huán)境和腫瘤類型[6]。腫瘤本身是細胞發(fā)生累積性基因突變的結(jié)果[3],尋找新的標(biāo)志物有望提高診斷的有效性和準(zhǔn)確性。比較近10年來BMP7與ESCC的研究進展,嚴(yán)琳 等[7]在56例ESCC組織標(biāo)本中驗證出BMP7陽性率(73.2%)遠高于正常食管黏膜,且主要在胞膜和胞質(zhì)。有研究[8]使用160例ESCC組織標(biāo)本表明BMP7在ESCC細胞中有高、中、低表達3種情況,主要富集癌巢。該研究516 例樣本中BMP7在ESCC組織中主要為低表達,主要表達在胞質(zhì),從樣本角度分析原因可能是相對之前的研究擴大了樣本數(shù)量且使用了其他地區(qū)的組織樣本;從分子本身角度分析原因可能是ESCC可通過自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生,BMP7調(diào)節(jié)ESCC微環(huán)境,其分泌量受多種因素影響也處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。綜合分析不同的ESCC組織BMP7表達量有所不同,進一步研究可使用內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)或類器官等ESCC樣本深入構(gòu)建模型研究。列線圖能綜合多種影響因素,簡易方便地實現(xiàn)個人評估,提高ESCC患者個體化診斷和預(yù)后的效率[9]。

BMP7是一種通過改變靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多不同細胞類型的增殖、分化和凋亡的分泌蛋白[3]。該細胞學(xué)實驗驗證過表達的BMP7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細胞后CCK-8以及平板克隆實驗結(jié)果中過表達組的細胞增殖能力發(fā)生了顯著的下降,同時Transwell 遷移實驗結(jié)果也提示,過表達BMP7的處理組中,ESCC 細胞的遷移能力也出現(xiàn)明顯的減弱,BMP7在EC9706中可發(fā)揮抑癌作用。有文獻[10]表明 BMP7能抑制轉(zhuǎn)移性腫瘤,能延緩肺癌轉(zhuǎn)移和擴散。

越來越多的研究[11-13]表明BMPs調(diào)節(jié)免疫細胞反應(yīng)并在癌癥中具有免疫抑制作用,比如調(diào)節(jié)巨噬細胞的激活和極化等。在ESCC里,該研究表明BMP7與M1-TAM(經(jīng)典活化型巨噬細胞)和M2-TAM(交替活化型巨噬細胞)呈負(fù)相關(guān)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞是數(shù)量最大的炎癥細胞群,有2種亞型,M1-TAM可產(chǎn)生IFN-γ、腫瘤壞死因子、IL-10等,可在一定程度上抵抗食管鱗狀細胞癌的進展,但隨著食管腫瘤細胞及間質(zhì)細胞分泌的相關(guān)細胞因子( 包括 CCL-2、CCL-18 等趨化因子和 CSF-1) 增加,部分 M1 型腫瘤細胞能向 M2 型轉(zhuǎn)化,形成以 M2-TAMs 為主的免疫微環(huán)境浸潤[14],M2-TAM促進癌癥發(fā)生。在這里,BMP7與樹突狀細胞呈正相關(guān)。樹突狀細胞表達I型和II型BMP受體(BMPRIA、BMPRIB、IA型激活素受體、BMPRII)和BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(Smad1),其信號激活通過增加共刺激分子和CD83、程序性細胞死亡配體1(PD-L1)和PD-L2的表達,促進人類DC的表型成熟,而且BMPs處理的樹突狀細胞表現(xiàn)可增強的T細胞刺激能力。BMP7可通過自分泌和旁分泌影響腫瘤微環(huán)境腫瘤和免疫細胞進而影響腫瘤的進展。研究[3]表明BMP7信號通路是癌癥中潛在的免疫治療靶標(biāo),同時在TCGAESCC數(shù)據(jù)庫中BMP7相關(guān)的基因集與自身免疫性疾病通路呈正相關(guān)。高表達BMP7的ESCC也可以介導(dǎo)正常成纖維細胞活化為腫瘤相關(guān)成纖維細胞,BMP7可通過激活Smad1/5/8并抵消TGF-β/Smad2/3信號通路來抑制纖維化[14]。BMP7抑制可能是克服ESCC免疫治療一個靶點。