Pirfenidone通過癌相關(guān)成纖維細(xì)胞抑制膽道腫瘤侵襲

魏亦成,王紫怡,李 煒,殷佩浩,

膽囊癌(gallbladder cancer,GBC)和膽管癌(cholangiocarcinoma,CCA)目前發(fā)病率在高收入國家呈上升趨勢(shì),由于膽道腫瘤的侵襲性較強(qiáng)導(dǎo)致腫瘤惡性程度高和預(yù)后較差[1]。腫瘤的侵襲能力與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)具有密切關(guān)系,其中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast,CAF)在腫瘤微環(huán)境中起到了重要作用。在CAF的過去研究中指出存在多種功能不同的CAF,例如炎性CAF和肌成纖維細(xì)胞CAF(myofibroblast-like CAF,myCAF)[2]。其中myCAF與膠原蛋白的產(chǎn)生相關(guān)[3]并且能夠增加細(xì)胞外基質(zhì)的剛度[4],是TME形成和重塑的重要因素。

吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)是一種新型抗纖維化劑,被批準(zhǔn)用于特發(fā)性肺纖維化和其他纖維化相關(guān)疾病[5]。PFD可以通過抑制TGF-β的釋放從而抑制SMAD通路和膠原蛋白產(chǎn)生,具有抗纖維化和抗炎特性,表明PFD能夠抑制肌成纖維細(xì)胞功能[6]。如果PFD能夠改變腫瘤微環(huán)境中的myCAF功能,則對(duì)于抑制腫瘤侵襲具有重要意義。該研究就此提出假設(shè)PFD能否通過改變CAF的功能來影響相關(guān)腫瘤微環(huán)境從而抑制膽道腫瘤侵襲,并且探索PFD作用于CAF的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、雙抗、胰酶(含EDTA)(美國Gibco公司);胎牛血清(FBS)(德國BI公司);TGF-β ELISA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔源FAP抗體 (英國Abcam公司, ab53066)、兔源p-smad3抗體 (美國CST公司, 9520S)、兔源smad2/3 (美國CST公司, 8685S)、兔源COL1A1(英國Abcam公司,ab138492)、兔源COL3A1(美國NOVUS公司, NB600-594),兔源COL4A1 (美國CST公司, 50273)、兔源p-smad2抗體 (美國CST公司, 18338)、鼠源VIM (美國CST公司, 5741S) 、鼠源α-SMA (英國Abcam公司, ab124964)、鼠源β-actin (英國Abcam公司, ab6276);PFD(平湖市正遠(yuǎn)醫(yī)藥科技有限公司)。

1.1.2主要儀器 超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán)公司),全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),凝膠電泳儀、電泳槽、ChemiDoc MP成像儀(美國BIO-RAD公司),離心機(jī)(德國Hettich公司)。

1.1.3細(xì)胞 該課題選取膽囊CAF,膽管CAF,膽囊正常成纖維細(xì)胞(normal fibroblast,NF),膽管NF作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,膽囊NF來自安徽來爾文科技有限公司,公司提供細(xì)胞相關(guān)驗(yàn)證報(bào)告。GBC-SD人膽囊癌細(xì)胞,來自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC細(xì)胞庫。組織來源的CAF,從膽囊癌和膽管癌患者的癌組織中分離得到。膽管NF,從正常膽管組織分離得到。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37 ℃、5% CO2。所有參與這項(xiàng)研究的患者均表示同意。該研究及相關(guān)課題經(jīng)上海普陀區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào): PTEC-A-2021-29-1)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性BALB/c裸鼠10只(6～8周齡30～40 g/只)和購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)營部,生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(蘇) 2018-0006。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在上海普陀區(qū)中心醫(yī)院 SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,飼養(yǎng)條件為(22±2) ℃、濕度60%,明暗周期為 12 h /12 h,自由進(jìn)食和飲水。將小鼠單側(cè)皮下接種GBC-SD人膽囊癌細(xì)胞形成皮下瘤小鼠模型。2周后腫瘤成型后進(jìn)行隨機(jī)分組,以 BALB/c裸鼠5只為 PFD給藥組,以其余BALB/c裸鼠5只為正常對(duì)照。PFD給藥組每天灌胃1次,每次PFD 250 mg/kg,對(duì)照組給予生理鹽水,共2周。2周后收集兩組BALB/c裸鼠血清進(jìn)行后續(xù)研究。該研究已獲得上海普陀區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):DWEC-A-202206013)。

1.2 方法

1.2.1原代CAF細(xì)胞提取 在培養(yǎng)皿中加入適量的生理鹽水后將所取患者組織標(biāo)本塊置于其中,將多余脂肪、邊緣殘留組織清理掉,加入適當(dāng)10%雙抗D-Hanks溶液清洗組織至澄清,用眼科剪將其剪碎至糊狀。將組織碎末轉(zhuǎn)移到離心管中,加入適量D-Hanks溶液完全淹沒組織,離心后棄去上清液。關(guān)燈避光,加入膠原酶,封口膜封住管口,置于37 ℃恒溫?fù)u床中 150 r/min振蕩1 h。加入完全培養(yǎng)基吹打離散組織后離心5 min來清洗膠原酶,重復(fù)此步驟3次,待膠原酶全部去除后加入培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)皿中放入培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2細(xì)胞分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶AF分成4組:膽囊CAF組; 膽管CAF組,分別培養(yǎng)24 h;膽囊CAF+PFD組,膽囊CAF加入PFD后作用24 h;膽管CAF+PFD組,膽管CAF加入PFD后作用24 h,其中PFD濃度0.3 mg/ml,作用時(shí)間為24 h。

1.2.3條件培養(yǎng)基 當(dāng)CAF增長到80%的濃度時(shí),培養(yǎng)基被無血清的培養(yǎng)基取代。處理48 h后,收集細(xì)胞懸液作為條件培養(yǎng)基。高速離心后收集條件培養(yǎng)基,然后通過0.22 μm微孔膜過濾,在-20 ℃保存。

1.2.4Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)成長期的細(xì)胞鋪板,48 h后去培養(yǎng)基,用PBS清洗3次后,用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的CST細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白裂解,置于冰上裂解15 min后,運(yùn)用離心機(jī)離心提取蛋白。棄去沉淀后,取上清液,使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE分離等量的細(xì)胞裂解物,并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA封閉1 h后,按照蛋白分子量的大小分離不同條帶,將條帶與一抗孵育,一抗有FAP(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶2 000)、VIM(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶5 000)、COL1A1(1 ∶1 000)、COL3A1(1 ∶1 000)、COL4A1(1 ∶1 000)、p-smad2(1 ∶1 000)、p-smad3(1 ∶1 000)、smad2/3(1 ∶1 000)。在4 ℃條件下孵育一抗12 h,用TBST漂洗3次后,與二抗在常溫下孵育1 h。再用TBST漂洗3次,使用化學(xué)發(fā)光顯色法進(jìn)行顯色,用Image J軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)分析,每組試驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5ELISA檢測(cè)TGF-β水平 收集CAF的條件培養(yǎng)基和小鼠血清作為樣品。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定TGF-β水平。將100 μl樣品加入抗體包被的96孔板的每個(gè)孔中,然后在室溫下孵育2 h。將100 μl的工作檢測(cè)溶液加到每個(gè)孔中,在加入100 μl底物溶液之前,將板在室溫下再孵育1 h。加入50 μl終止液后終止工作。在分光光度計(jì)中設(shè)置波長為450 nm,讀取相應(yīng)吸光度。每個(gè)樣品設(shè)立3個(gè)復(fù)孔,分別獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6膠原收縮實(shí)驗(yàn) 將CAF懸浮液在無血清培養(yǎng)基和I型膠原溶液中混合,制備膠原凝膠。最終細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/ml,膠原濃度為1 mg/ml。將0.5 ml混合物加入到24孔板的每個(gè)孔中,在37 ℃下聚合30 min。將基質(zhì)從培養(yǎng)皿底部輕輕分離,基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,其中不含或含有PFD。每隔24 h白光下拍攝。通過Image J軟件對(duì)凝膠的表面積進(jìn)行量化。收縮百分比使用公式100%×凝膠表面積/孔表面積,繪制為初始基質(zhì)面積。每組收縮試驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7鬼筆環(huán)肽染色 將細(xì)胞固定后,用0.1%Triton X-100滲透,并用5% BSA在PBS中封閉30 min。然后用Alexa-Fluor 488 Phalloidin(A12379,Thermo Fisher Scientific)染色細(xì)胞,以觀察絲狀F-肌動(dòng)蛋白。每種細(xì)胞分別鋪3個(gè)共聚焦皿,獨(dú)立進(jìn)行染色觀察。

1.2.8明膠酶譜實(shí)驗(yàn) 將來自CAF條件培養(yǎng)基在非還原性樣品緩沖液中以1 ∶1稀釋,并在含有0.1%明膠的10% SDS聚丙烯酰胺凝膠(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA USA)上在125 V下分離150 min。通過在室溫下與復(fù)性緩沖液(2.5%Triton X-100在水中稀釋)孵育30 min來去除SDS。凝膠在顯影緩沖液中洗滌30 min,然后在37 ℃的新鮮顯影緩沖液中培養(yǎng)48 h。凝膠用考馬斯藍(lán)染色。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,觀察現(xiàn)象。

1.2.9Transwell實(shí)驗(yàn) 在 Transwell小室的底膜使用基質(zhì)膠鋪底后,置入 Transwell專用24孔板中。將處理后的細(xì)胞分別與300 μl無血清培養(yǎng)基混合后加入小室內(nèi);之后向小室下的孔中加入700 μl含10% FBS培養(yǎng)基。共培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,使用甲醇將膜表面的細(xì)胞固定。使用結(jié)晶紫染色后,將小室晾干,在顯微鏡下拍照,在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。每個(gè)樣品鋪3個(gè)小室,每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.10CCK-8實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪板于96孔板中,并在24 h內(nèi)加入PFD作用。24 h后,使用CCK-8檢測(cè)方法評(píng)估細(xì)胞活力,設(shè)置3個(gè)孔,分別獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.11mRNA表達(dá)水平檢測(cè) qRT-PCR檢測(cè)TGF-β的mRNA表達(dá)水平。設(shè)計(jì)引物如下核苷酸序列F:TATTGAGCACCTTGGGCACTGTTG; R: CCTTAACCTCTCTGGGCTTGTTTCC方向(5′-3′);根據(jù)EZ-press RNA Purification Kit提取總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取cDNA,使用染料法qPCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 原代CAF提取及功能觀察分別從患者膽囊癌組織和膽管癌組織中提取原代CAF細(xì)胞,將其名稱定義為膽囊CAF和膽管CAF。分別提取2種CAF的蛋白后,通過Western blot檢測(cè)標(biāo)志蛋白表達(dá)。如圖1A所示,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞中的CAF標(biāo)志蛋白FAP,Vimentin,α-SMA均表達(dá),從而驗(yàn)證CAF的身份。通過鬼筆環(huán)肽實(shí)驗(yàn)分別對(duì)膽囊CAF和膽管CAF染色,圖1B顯示其成纖維細(xì)胞骨架膠原蛋白豐富且呈束狀分布,這提示2種CAF的功能可能與膠原蛋白相關(guān)從而影響腫瘤微環(huán)境。

2.2 CAF中的TGF-β分泌和膠原生成由于TGF-β/SMAD信號(hào)通路與成纖維細(xì)胞的膠原收縮和生成功能有重要聯(lián)系[6],所以通過ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究,實(shí)驗(yàn)分組為膽囊NF組,膽管NF組,膽囊CAF組,膽管CAF組。ELISA實(shí)驗(yàn)表明膽囊CAF和膽管CAF的TGF-β分泌分別強(qiáng)于正常成纖維細(xì)胞細(xì)胞(3 116.67±567.65),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.09,P<0.05)。同時(shí)通過Western blot檢測(cè)膽囊CAF和膽管CAF中膠原蛋白顯示,COL1A1,COL3A1,COL4A1相較于正常NF明顯表達(dá)增高,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCOL1A1=54.39,FCOL3A1=112.00,FCOL4A1=186.90,P<0.05)。同時(shí)研究也表明膽囊CAF和膽管CAF中TGF-β/SMAD信號(hào)通路的標(biāo)志蛋白p-smad2,p-smad3,smad2/3表達(dá)相較與正常NF增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fp-smad2=90.04,Fp-smad3=162.20,P<0.05)。這提示膽囊CAF和膽管CAF相比NF具有更強(qiáng)的TGF-β分泌,并且激活TGF-β/SMAD通路來促進(jìn)膠原生成。見圖2。

2.3 PFD抑制CAF對(duì)TGF-β分泌和膠原生成的影響為了研究PFD對(duì)于CAF中TGF-β分泌和膠原生成的影響,研究分組分為膽囊CAF組,膽管CAF組,膽囊CAF+PFD組,膽管CAF+PFD組。根據(jù)圖3A,CCK-8實(shí)驗(yàn)患者膽囊CAF和膽管CAF在0.6、1.2、2.4、3.6、7.2、14.4 mg/ml PFD處理后與對(duì)照組0 mg/ml PFD處理后細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。故研究選擇對(duì)兩種細(xì)胞存活率無影響的PFD藥物濃度為0.3 mg/ml。結(jié)果如圖3B所示, qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明PFD組相比對(duì)照組TGF-β的mRNA表達(dá)水平明顯降低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=549.3,P<0.05)。圖3C顯示ELISA實(shí)驗(yàn)表明PFD能明顯抑制CAF中TGF分泌(2 895.42±855.96), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.00,P<0.05)。同時(shí)圖3D顯示W(wǎng)estern blot分析表明PFD能抑制膽囊CAF和膽管CAF的膠原蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCOL1A1=29.94,FCOL3A1=405.90,FCOL4A1=479.10,P<0.05)。在圖3E、F動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中相同條件下的GBC-SD患者膽囊癌細(xì)胞皮下瘤裸鼠模型中,PFD組相比對(duì)照組的血清TGF-β濃度明顯降低(364.52±220.60),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 PFD抑制CAF對(duì)TGF-β分泌和膠原生成的影響

2.4 PFD對(duì)CAF功能的作用為了研究PFD對(duì)CAF膠原收縮和重塑的影響進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn),圖4A、B為膠原收縮實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,膽囊CAF細(xì)胞加入PFD后與對(duì)照組24 、48 h收縮具有明顯差異,膽管CAF細(xì)胞加入PFD后與對(duì)照組24 h收縮差異不明顯,但是48 h收縮具有明顯差異,結(jié)果顯示PFD能夠明顯減弱膠原凝膠的收縮功能,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膠原收縮與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的基質(zhì)重塑能力密切相關(guān)。圖4C的明膠酶譜實(shí)驗(yàn)表明PFD對(duì)CAF分泌的MMP2和MMP9具有抑制作用。MMP2和MMP9是膠原重塑和腫瘤微環(huán)境形成的重要因素,這說明了PFD能通過CAF對(duì)腫瘤微環(huán)境的改變起到作用。

圖4 PFD對(duì)CAF功能的作用

2.5 PFD通過SMAD信號(hào)通路影響CAF功能及腫瘤微環(huán)境研究[6]表明,PFD能夠抑制TGF-β產(chǎn)生和相關(guān)的膠原蛋白產(chǎn)生。圖5顯示PFD可以抑制CAF中TGF-β下游的SMAD信號(hào)通路,p-smad2,p-smad3磷酸化蛋白明顯受到抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fp-smad2=193.4,Fp-smad3=575.2,P<0.05)。說明PFD可能是通過SMAD信號(hào)通路來抑制膠原蛋白的產(chǎn)生和重塑功能。為了研究CAF對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響,進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn),收集膽囊CAF組,膽管CAF組,膽囊CAF+PFD組,膽管CAF+PFD組的條件培養(yǎng)基,在相同條件下驗(yàn)證患者膽囊癌GBC-SD細(xì)胞的侵襲能力的變化,結(jié)果顯示PFD能夠改變腫瘤微環(huán)境從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲(534.82±56.45),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.6,P<0.05)。

圖5 PFD通過SMAD信號(hào)通路影響CAF功能及腫瘤微環(huán)境

3 討論

腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥性密切相關(guān),關(guān)系到腫瘤的侵襲功能并且影響腫瘤預(yù)后。多數(shù)膽囊癌和膽管癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高和化療效果較差,這與腫瘤微環(huán)境是密切相關(guān)的。伴隨對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究增多,研究表明CAF是組成腫瘤微環(huán)境重要部分,由于CAF具有異質(zhì)性,不同CAF的功能具有明顯區(qū)別。其中注意到膽道腫瘤中的CAF具有myCAF類似功能,可以通過膠原蛋白的生成和重塑對(duì)腫瘤微環(huán)境的改變起到重要作用。

在膽囊相關(guān)研究中表明膽囊癌的周圍組織的肌動(dòng)蛋白染色百分比與正常相比更高,而肌動(dòng)蛋白是myCAF重要標(biāo)志。肌動(dòng)蛋白影響細(xì)胞質(zhì)中應(yīng)力纖維和束狀組織,并且與膠原凝集相關(guān)[7]。在CAF的研究中表明TGF-β能夠激活CAF的相關(guān)功能從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[8]。該研究通過提取原代CAF,進(jìn)行了鬼筆環(huán)肽實(shí)驗(yàn)并且驗(yàn)證了TGF-β相關(guān)通路蛋白,從而證實(shí)了TGF-β信號(hào)通路在膽道CAF中的高表達(dá),說明原代CAF具有myCAF的類似功能。在膽管癌腫瘤微環(huán)境中膠原的改變和重塑最腫瘤侵襲起到了重要作用[9]。該研究也通過膠原蛋白的Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。

PFD是一類具有廣泛的抗纖維化和抗炎特性的藥物。PFD能過通過調(diào)節(jié)前膠原轉(zhuǎn)錄和限制成纖維細(xì)胞活化和分化為肌成纖維細(xì)胞來減緩纖維化[6]。Pirfenidone對(duì)不同類型的癌癥具有抗腫瘤潛力,在非小細(xì)胞肺癌中能提高化療的敏感性提高腫瘤治療效果[10]。腫瘤微環(huán)境研究[11]表明Pirfenidone具有通過靶向CAF促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和干細(xì)胞特征的作用。TGF-β在纖維化中起到了重要作用,通過Western blot實(shí)驗(yàn)表明PFD能明顯抑制CAF的TGF-β分泌。TGF-β通路主要由TGF-β受體介導(dǎo)的Smad和非Smad信號(hào)通路組成。其中,活化的TGF-β與TGF-β受體2結(jié)合并激活TGF-β受體1,導(dǎo)致Smad2和Smad3的磷酸化,磷酸化后形成Smad復(fù)合物,然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)膠原蛋白和纖連蛋白,影響組織纖維化。

由于CAF在腫瘤基質(zhì)中對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到了促進(jìn)作用。如果能改變膠原生成和膠原重塑的進(jìn)程,對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到抑制作用。其中有對(duì)CAF選擇性缺失I型膠原的小鼠的研究表明,I型膠原在腫瘤微環(huán)境中的主導(dǎo)力是I型膠原-剛度途徑,在I型膠原所產(chǎn)生的機(jī)械限制與其剛度介導(dǎo)的作用發(fā)生變化時(shí),Ⅰ型膠原可能對(duì)腫瘤的侵襲起到促進(jìn)作用[12]。通過Western blot實(shí)驗(yàn)表明PFD能夠抑制膠原蛋白的生成,進(jìn)一步運(yùn)用膠原收縮和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)PFD能夠明顯改變CAF的膠原收縮和重塑功能,這提示PFD通過膠原收縮和重塑改變了膠原的機(jī)械限制和剛度作用,隨后通過Transwell實(shí)驗(yàn)表明PFD能夠改變CAF這一功能從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。為了尋求PFD的作用機(jī)制,驗(yàn)證了TGF-β下游通路,最后通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)PFD主要是通過抑制TGF-β影響下游的SMAD信號(hào)通路起到作用。

綜上所述,該研究通過膽囊CAF和膽管CAF的原代細(xì)胞提取,提示在腫瘤微環(huán)境下TGF-β/SMAD信號(hào)通路影響CAF的膠原合成,其中PFD可以通過抑制TGF-β的產(chǎn)生來阻斷SMAD信號(hào)通路的激活和改變腫瘤微環(huán)境從而抑制腫瘤侵襲。