光照與核黃素濃度對(duì)核黃素光動(dòng)力滅活病原體效果的研究

何緣圓,李彥玉,尹云弟,李 玲,陳可洋,劉 忠

輸血是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療中不可或缺的手段,但是輸血感染仍然時(shí)有發(fā)生,感染性風(fēng)險(xiǎn)由可通過(guò)輸血傳播的病原微生物構(gòu)成,其中包括人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等多種病毒以及大腸桿菌、金黃色葡萄菌、梅毒等細(xì)菌和原蟲等。血液病原體滅活技術(shù)是最有希望能夠進(jìn)一步降低輸血感染風(fēng)險(xiǎn)的方法,是保障血液安全的最后一道屏障,但血液病原體滅活技術(shù)目前還不成熟,還需要進(jìn)一步研究和發(fā)展。

核黃素光化學(xué)病原體滅活法作為一種新型高效的病原體滅活技術(shù)近年來(lái)得到廣泛的關(guān)注。核黃素一般是指維生素B2,是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。核黃素的安全性也已經(jīng)得到了充分的肯定,它被美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)歸類為一般認(rèn)為是安全的[1],并與紫外線介導(dǎo)的活化一起用于新生兒黃疸的治療[2]。核黃素光化學(xué)法的原理是核黃素在受到紫外光或可見光激活,鳥苷堿基被氧化,通過(guò)電子轉(zhuǎn)移對(duì)鳥嘌呤殘基進(jìn)行修飾,阻斷核酸復(fù)制對(duì)核酸造成不可逆損傷[3-4],從而實(shí)現(xiàn)抑制或破壞病原體復(fù)制的目的。Mirasol PRT系統(tǒng)對(duì)臨床相關(guān)病原體有效和滅活白細(xì)胞[5],而不顯著損害產(chǎn)品的功效[6]或?qū)е庐a(chǎn)品損失[7-8],同時(shí)也不需要后續(xù)的清除步驟。目前很少有文章報(bào)道血液病原體滅活研究中核黃素濃度與紫外光照聯(lián)合作用效果,本文將探究不同光照時(shí)間與不同濃度核黃素對(duì)血漿水皰性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)滅活效果的影響,為核黃素光化學(xué)法病原體滅活技術(shù)滅活條件的選擇和滅活效果的優(yōu)化提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康株式會(huì)社; ABO型血漿由四川德陽(yáng)中心血站提供;核黃素購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;生理鹽水購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用病毒與細(xì)胞VSV(原代劑量15 ml由本所輸血傳播病原體研究中心饋贈(zèng));Vero E6(由本實(shí)驗(yàn)平臺(tái)輸血安全課題組傳代保存)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1核黃素濃度配制 取生理鹽水配制終濃度為500 μmol/L的核黃素生理鹽水溶液,溶液避光保存。

1.3.2病毒培養(yǎng) 取出VSV存管,水浴鍋解凍。VSV復(fù)蘇反復(fù)感染Vero E6細(xì)胞,連續(xù)傳代,以增加病毒毒力;收集病毒培養(yǎng)液,離心過(guò)濾后,放入-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。使用前檢測(cè)病毒原液滴度。

1.3.3病原體滅活 本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估水皰性口炎病毒VSV在不同核黃素濃度和不同紫外光照時(shí)間下滅活效果。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備需要提前培養(yǎng)好細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)當(dāng)天取出同血型血漿,將血漿混合病毒液后再加入不同工作濃度核黃素配制好后加入血袋,配制為4組核黃素濃度,每組核黃素終濃度為50、100、150 μmol/L以及空白對(duì)照組;使用365 nm紫外線燈各組照射時(shí)間為10、15、20、25 min及未進(jìn)行光照的對(duì)照組;每組設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。病毒滅活后,在滅活實(shí)驗(yàn)后使用終點(diǎn)滴定法(1 ∶10連續(xù)稀釋,每個(gè)稀釋8個(gè)平行樣品)分析樣品。Vero E6細(xì)胞與每個(gè)病毒樣本一起培養(yǎng),并在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)3～5 d。每天使用顯微鏡記錄細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng),并使用Reed-Muench法[9]計(jì)算病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 光照時(shí)間對(duì)滅活效果的影響當(dāng)光照時(shí)間為10 min時(shí),不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素濃度50 μmol/L組與100 μmol/L組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.633)(圖1A);當(dāng)光照時(shí)間為15 min時(shí),不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.859、0.128、0.174(圖1B);當(dāng)光照時(shí)間為20 min時(shí),不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.076、0.110、0.361(圖1C);當(dāng)光照時(shí)間為25 min時(shí),不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.361、0.361、1.000(圖1D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,在實(shí)驗(yàn)時(shí)間25 min內(nèi),當(dāng)光照時(shí)間到15 min后增加光照時(shí)間對(duì)病原體滅活效果無(wú)影響。

圖1 核黃素光化學(xué)法病原體滅活后VSV生長(zhǎng)量

2.2 核黃素對(duì)VSV滅活效果的影響當(dāng)不添加核黃素時(shí),光照10 min與光照20 min和25 min組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A);當(dāng)核黃素濃度為50 μmol/L時(shí),只有光照20 min組和光照25 min組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.235)(圖2B);當(dāng)核黃素濃度為100 μmol/L時(shí),只有光照20 min組和光照25 min組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.658)(圖2C);當(dāng)核黃素濃度為150 μmol/L時(shí),只有光照20 min組和光照25 min組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.474)(圖2D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)核黃素濃度超過(guò)50 μmol/L后,增加核黃素濃度對(duì)病原體滅活效果無(wú)影響。

圖2 核黃素光化學(xué)法病原體滅活后VSV生長(zhǎng)量

2.3 光照時(shí)間與核黃素濃度相互作用對(duì)病原體滅活效果的影響總結(jié)上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論:在25 min內(nèi),光照時(shí)間越長(zhǎng),效果越好,VSV生長(zhǎng)量越低。與核黃素濃度相比,光照時(shí)間的增長(zhǎng)比核黃素濃度的增加效果更明顯。當(dāng)核黃素濃度增加到50 μmol/L后再增加核黃素濃度病原體滅活效果不會(huì)增強(qiáng)。見表1和圖3。

表1 光照時(shí)間與核黃素濃度相互作用時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢出VSV生長(zhǎng)量log數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖3 光照時(shí)間與核黃素濃度聯(lián)合作用滅活病原體后VSV log生長(zhǎng)量

3 討論

核黃素光化學(xué)病原體滅活技術(shù)在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn),通過(guò)對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的深入研究表明活性氧介導(dǎo)的非特異性氧化應(yīng)激以及核黃素分子插入到微生物的RNA和DNA中會(huì)對(duì)微生物造成損傷[10-12]。到目前為止,在一些歐洲國(guó)家核黃素光化學(xué)法病原體滅活技術(shù)已被運(yùn)用于臨床[13]。

在核黃素聯(lián)合紫外光照光化學(xué)法滅活病原體的實(shí)驗(yàn)中,紫外光照劑量增加可有效提高病原體的滅活效果,當(dāng)紫外光照的時(shí)間達(dá)到20 min以上時(shí),效果尤為明顯。相比于紫外光照劑量增加帶來(lái)的有效改變,核黃素濃度的增加對(duì)于滅活效果有一定的提升,但就不那么顯著了?？琢羁?等[14]的早期核黃素紫外光照滅菌實(shí)驗(yàn)也證實(shí)核黃素濃度12.5～50.0 μmol/L滅活后細(xì)菌下,降數(shù)與無(wú)核黃素的空白對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但是隨著核黃素濃度的增加滅菌效果趨于下降核黃素濃度>75 μmol/L后無(wú)滅菌效果(P>0.05)。

該實(shí)驗(yàn)表明,核黃素與紫外光照兩者聯(lián)合對(duì)病原體的滅活是具有促進(jìn)作用的,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將紫外照射的劑量增加后,紫外光照劑量引起的病原體生長(zhǎng)量變化幅度要大于核黃素濃度變化引起的病原體生長(zhǎng)量變化。這與Makdoumi et al[15]在對(duì)觀察紫外光(UVA)活化核黃素對(duì)角膜炎中常見的3種細(xì)菌的抗菌作用時(shí)結(jié)果基本一致。這可能是由于紫外線劑量的增加也有可能放大氧化應(yīng)激產(chǎn)生的數(shù)量,然而,核黃素濃度的增加并不一定起到同樣的作用。也許只需要少量的核黃素就可以達(dá)到所研究的效果,過(guò)量的核黃素甚至可以阻止紫外線滲透到液體溶液的深層。同時(shí)受試病毒的代謝周期、代謝途徑等也可能是影響氧化應(yīng)激敏感性的因素之一。關(guān)于其他作用條件可能會(huì)給病原體滅活帶來(lái)的影響以及其中的作用機(jī)制等還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)繼續(xù)深入探索。

該實(shí)驗(yàn)表明核黃素聯(lián)合紫外光A對(duì)VSV滅活確實(shí)存在一定的療效,但也存在一定的局限性。本文只驗(yàn)證了核黃素濃度和紫外光A劑量的影響,其他實(shí)驗(yàn)表明病原體的滅活也可能與其他因素有關(guān),例如不同的介質(zhì)、溫度、光照距離及其他機(jī)械因素。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探索。

面對(duì)各種傳染病的威脅,警示了血庫(kù)和輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要有更新的技術(shù)創(chuàng)新。由于核黃素光化學(xué)病原體滅活的優(yōu)越性,在保持處理后產(chǎn)品無(wú)需清除工作且高質(zhì)量減少副反應(yīng)的發(fā)生,Mirasol PRT系統(tǒng)可能會(huì)被進(jìn)一步展開研究,其開發(fā)應(yīng)用在未來(lái)也具有非常大的潛力。