光照與核黃素濃度對核黃素光動力滅活病原體效果的研究

何緣圓,李彥玉,尹云弟,李 玲,陳可洋,劉 忠

輸血是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療中不可或缺的手段,但是輸血感染仍然時有發(fā)生,感染性風(fēng)險由可通過輸血傳播的病原微生物構(gòu)成,其中包括人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等多種病毒以及大腸桿菌、金黃色葡萄菌、梅毒等細(xì)菌和原蟲等。血液病原體滅活技術(shù)是最有希望能夠進(jìn)一步降低輸血感染風(fēng)險的方法,是保障血液安全的最后一道屏障,但血液病原體滅活技術(shù)目前還不成熟,還需要進(jìn)一步研究和發(fā)展。

核黃素光化學(xué)病原體滅活法作為一種新型高效的病原體滅活技術(shù)近年來得到廣泛的關(guān)注。核黃素一般是指維生素B2,是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)。核黃素的安全性也已經(jīng)得到了充分的肯定,它被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)歸類為一般認(rèn)為是安全的[1],并與紫外線介導(dǎo)的活化一起用于新生兒黃疸的治療[2]。核黃素光化學(xué)法的原理是核黃素在受到紫外光或可見光激活,鳥苷堿基被氧化,通過電子轉(zhuǎn)移對鳥嘌呤殘基進(jìn)行修飾,阻斷核酸復(fù)制對核酸造成不可逆損傷[3-4],從而實(shí)現(xiàn)抑制或破壞病原體復(fù)制的目的。Mirasol PRT系統(tǒng)對臨床相關(guān)病原體有效和滅活白細(xì)胞[5],而不顯著損害產(chǎn)品的功效[6]或?qū)е庐a(chǎn)品損失[7-8],同時也不需要后續(xù)的清除步驟。目前很少有文章報道血液病原體滅活研究中核黃素濃度與紫外光照聯(lián)合作用效果,本文將探究不同光照時間與不同濃度核黃素對血漿水皰性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)滅活效果的影響,為核黃素光化學(xué)法病原體滅活技術(shù)滅活條件的選擇和滅活效果的優(yōu)化提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑倒置光學(xué)顯微鏡購自日本尼康株式會社; ABO型血漿由四川德陽中心血站提供;核黃素購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;生理鹽水購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用病毒與細(xì)胞VSV(原代劑量15 ml由本所輸血傳播病原體研究中心饋贈);Vero E6(由本實(shí)驗(yàn)平臺輸血安全課題組傳代保存)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1核黃素濃度配制 取生理鹽水配制終濃度為500 μmol/L的核黃素生理鹽水溶液,溶液避光保存。

1.3.2病毒培養(yǎng) 取出VSV存管,水浴鍋解凍。VSV復(fù)蘇反復(fù)感染Vero E6細(xì)胞,連續(xù)傳代,以增加病毒毒力;收集病毒培養(yǎng)液,離心過濾后,放入-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。使用前檢測病毒原液滴度。

1.3.3病原體滅活 本實(shí)驗(yàn)旨在評估水皰性口炎病毒VSV在不同核黃素濃度和不同紫外光照時間下滅活效果。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備需要提前培養(yǎng)好細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)當(dāng)天取出同血型血漿,將血漿混合病毒液后再加入不同工作濃度核黃素配制好后加入血袋,配制為4組核黃素濃度,每組核黃素終濃度為50、100、150 μmol/L以及空白對照組;使用365 nm紫外線燈各組照射時間為10、15、20、25 min及未進(jìn)行光照的對照組;每組設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。病毒滅活后,在滅活實(shí)驗(yàn)后使用終點(diǎn)滴定法(1 ∶10連續(xù)稀釋,每個稀釋8個平行樣品)分析樣品。Vero E6細(xì)胞與每個病毒樣本一起培養(yǎng),并在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)3～5 d。每天使用顯微鏡記錄細(xì)胞病理學(xué)效應(yīng),并使用Reed-Muench法[9]計(jì)算病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 光照時間對滅活效果的影響當(dāng)光照時間為10 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素濃度50 μmol/L組與100 μmol/L組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.633)(圖1A);當(dāng)光照時間為15 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.859、0.128、0.174(圖1B);當(dāng)光照時間為20 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.076、0.110、0.361(圖1C);當(dāng)光照時間為25 min時,不添加核黃素組與添加核黃素組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),添加核黃素組各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值分別為0.361、0.361、1.000(圖1D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,在實(shí)驗(yàn)時間25 min內(nèi),當(dāng)光照時間到15 min后增加光照時間對病原體滅活效果無影響。

圖1 核黃素光化學(xué)法病原體滅活后VSV生長量

2.2 核黃素對VSV滅活效果的影響當(dāng)不添加核黃素時,光照10 min與光照20 min和25 min組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A);當(dāng)核黃素濃度為50 μmol/L時,只有光照20 min組和光照25 min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.235)(圖2B);當(dāng)核黃素濃度為100 μmol/L時,只有光照20 min組和光照25 min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.658)(圖2C);當(dāng)核黃素濃度為150 μmol/L時,只有光照20 min組和光照25 min組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.474)(圖2D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)核黃素濃度超過50 μmol/L后,增加核黃素濃度對病原體滅活效果無影響。

圖2 核黃素光化學(xué)法病原體滅活后VSV生長量

2.3 光照時間與核黃素濃度相互作用對病原體滅活效果的影響總結(jié)上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論:在25 min內(nèi),光照時間越長,效果越好,VSV生長量越低。與核黃素濃度相比,光照時間的增長比核黃素濃度的增加效果更明顯。當(dāng)核黃素濃度增加到50 μmol/L后再增加核黃素濃度病原體滅活效果不會增強(qiáng)。見表1和圖3。

表1 光照時間與核黃素濃度相互作用時實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢出VSV生長量log數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖3 光照時間與核黃素濃度聯(lián)合作用滅活病原體后VSV log生長量

3 討論

核黃素光化學(xué)病原體滅活技術(shù)在20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn),通過對這項(xiàng)技術(shù)的深入研究表明活性氧介導(dǎo)的非特異性氧化應(yīng)激以及核黃素分子插入到微生物的RNA和DNA中會對微生物造成損傷[10-12]。到目前為止,在一些歐洲國家核黃素光化學(xué)法病原體滅活技術(shù)已被運(yùn)用于臨床[13]。

在核黃素聯(lián)合紫外光照光化學(xué)法滅活病原體的實(shí)驗(yàn)中,紫外光照劑量增加可有效提高病原體的滅活效果,當(dāng)紫外光照的時間達(dá)到20 min以上時,效果尤為明顯。相比于紫外光照劑量增加帶來的有效改變,核黃素濃度的增加對于滅活效果有一定的提升,但就不那么顯著了?？琢羁?等[14]的早期核黃素紫外光照滅菌實(shí)驗(yàn)也證實(shí)核黃素濃度12.5～50.0 μmol/L滅活后細(xì)菌下,降數(shù)與無核黃素的空白對照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但是隨著核黃素濃度的增加滅菌效果趨于下降核黃素濃度>75 μmol/L后無滅菌效果(P>0.05)。

該實(shí)驗(yàn)表明,核黃素與紫外光照兩者聯(lián)合對病原體的滅活是具有促進(jìn)作用的,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將紫外照射的劑量增加后,紫外光照劑量引起的病原體生長量變化幅度要大于核黃素濃度變化引起的病原體生長量變化。這與Makdoumi et al[15]在對觀察紫外光(UVA)活化核黃素對角膜炎中常見的3種細(xì)菌的抗菌作用時結(jié)果基本一致。這可能是由于紫外線劑量的增加也有可能放大氧化應(yīng)激產(chǎn)生的數(shù)量,然而,核黃素濃度的增加并不一定起到同樣的作用。也許只需要少量的核黃素就可以達(dá)到所研究的效果,過量的核黃素甚至可以阻止紫外線滲透到液體溶液的深層。同時受試病毒的代謝周期、代謝途徑等也可能是影響氧化應(yīng)激敏感性的因素之一。關(guān)于其他作用條件可能會給病原體滅活帶來的影響以及其中的作用機(jī)制等還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)繼續(xù)深入探索。

該實(shí)驗(yàn)表明核黃素聯(lián)合紫外光A對VSV滅活確實(shí)存在一定的療效,但也存在一定的局限性。本文只驗(yàn)證了核黃素濃度和紫外光A劑量的影響,其他實(shí)驗(yàn)表明病原體的滅活也可能與其他因素有關(guān),例如不同的介質(zhì)、溫度、光照距離及其他機(jī)械因素。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探索。

面對各種傳染病的威脅,警示了血庫和輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要有更新的技術(shù)創(chuàng)新。由于核黃素光化學(xué)病原體滅活的優(yōu)越性,在保持處理后產(chǎn)品無需清除工作且高質(zhì)量減少副反應(yīng)的發(fā)生,Mirasol PRT系統(tǒng)可能會被進(jìn)一步展開研究,其開發(fā)應(yīng)用在未來也具有非常大的潛力。