SS-31抑制O3介導(dǎo)的小鼠氣道高反應(yīng)和黏液高分泌

謝梅琴,李忱菲,劉 琪,翁佳麗,張 海,李 鋒,范曉云

臭氧(O3)是一種典型的二級(jí)空氣污染物,主要是由氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)化合物在光合作用下形成。中國(guó)是全球臭氧水平最高的國(guó)家之一,隨著氣候變暖,夏季O3在空氣中的含量大幅增加。研究[1]表明,O3與人體健康相互關(guān)聯(lián),短期O3暴露與呼吸系統(tǒng)的病死率和發(fā)病率增加有關(guān),而長(zhǎng)期O3暴露會(huì)導(dǎo)致一些慢性呼吸系統(tǒng)疾病,如非嗜酸粒細(xì)胞性哮喘和慢性阻塞性肺疾病。O3暴露可引起氣道上皮細(xì)胞急性損傷、炎癥、氣道高反應(yīng)性和黏液高分泌,從而導(dǎo)致氣道發(fā)生刺激性反應(yīng),包括咳嗽、支氣管收縮和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并導(dǎo)致小氣道功能異常[2]。

線粒體是負(fù)責(zé)能量代謝的細(xì)胞器,在維持細(xì)胞功能中起著重要作用[3]。最近的研究[4]表明,O3可引起線粒體功能障礙,并觸發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)可由多種危險(xiǎn)情況觸發(fā),包括感染和代謝失調(diào),活性氧 (reactive oxygen species,ROS)誘導(dǎo)的半胱氨酸殘基氧化可能促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介導(dǎo)的Gasdermin家族蛋白D (Gasdermin D,GSDMD)裂解和激活[5]。SS-31是一種新型的線粒體靶向抗氧化復(fù)合物,可以消除ROS,減輕線粒體功能障礙和氧化損傷。目前尚不清楚SS-31是否能抑制O3誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)和黏液高分泌。因此,該研究旨在探究 SS-31能否通過抑制NLRP3/Caspase 1/GSDMD信號(hào)通路在O3介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和黏液高分泌模型中發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)均得到了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,給予適宜的環(huán)境及充足的食物和水。

1.2 儀器與試劑臭氧產(chǎn)生儀購(gòu)自德國(guó)比森多夫公司;氣道高反應(yīng)儀購(gòu)自英國(guó)EMMS公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;蛋白印跡自動(dòng)成像儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司;SS-31購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司;乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)購(gòu)自Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司;劉氏染液和PAS染液均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;TRIzol試劑、Prime ScriptTMRT Master Mix Kit、Power Green qPCR mix均購(gòu)自大連 TaKaRa 公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)/谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;β-actin、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和MUC5B均購(gòu)自上海邁浦生物科技有限公司;GAPDH、β-actin、NLRP3、pro-Caspase 1、GSDMD、Cleaved GSDMD均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司;Caspase 1(p20)購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物分組與處理將32只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為磷酸鹽緩沖液(PBS)+Air組、SS-31+Air組、PBS+O3組、SS-31+O3組,每組各8只。各組在空氣或O3暴露前1 h腹腔注射PBS或SS-31(10 mg/kg,溶于PBS)。將PBS+O3組和SS-31+O3組放在一個(gè)由發(fā)電機(jī)產(chǎn)出5.01×10-6mol/m3濃度O3的全身暴露室(65 cm×45 cm×37 cm)中,暴露3 h。PBS+Air組和SS-31+Air組小鼠暴露在過濾后的空氣中。

1.4 氣道反應(yīng)檢測(cè)24 h后,將0.2 ml的1%戊巴比妥注射到小鼠腹腔,通過氣管切開、氣管插管,連接小鼠氣道與氣道高反應(yīng)檢測(cè)儀。首先暴露于霧化PBS(建立基線),逐漸增加霧化Ach濃度(0、8、16、32、64、128、256 mg/ml)。每一劑量Ach持續(xù)30 s,記錄呼吸測(cè)量值并在霧化開始7 min內(nèi)取平均值作為參考數(shù)據(jù)。記錄肺阻力(lung resistance,RL)值計(jì)算比基線增加100%所需的乙酰膽堿濃度(PC100),并以-logPC100作為支氣管反應(yīng)性的衡量指標(biāo)。

1.5 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)氣道高反應(yīng)檢測(cè)完后,用過量的戊巴比妥鈉處死小鼠。經(jīng)氣管內(nèi)管向小鼠氣道內(nèi)灌注2 ml PBS,回收BALF。然后將BALF放于4 ℃下以1 000 r/min離心10 min。上清液放于-80 ℃下保存,以供進(jìn)一步測(cè)定。取0.2 ml PBS重懸細(xì)胞顆粒,進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù),再用劉氏染色液染色,400倍鏡下計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞。

1.6 組織病理學(xué)分析取小鼠左肺,用10%福爾馬林灌注固定,用石蠟包埋。石蠟切片,制備約4 μm厚的肺組織切片進(jìn)行PAS染色,評(píng)估支氣管周圍的黏液分泌情況,0級(jí)(無(wú)杯狀細(xì)胞)、1級(jí)(<25%)、2級(jí)(25%～50%)、3級(jí)(51%～75%)和4級(jí)(>75%)。計(jì)算每只小鼠的平均杯狀細(xì)胞增生評(píng)分。

1.7 氧化應(yīng)激水平檢測(cè)取適量新鮮的肺組織,加入細(xì)胞/組織裂解液勻漿后,4 ℃,9 000 r/min離心10 min,收集上清液。然后用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,酶標(biāo)儀測(cè)定532 nm處吸光度,計(jì)算MDA的含量。

用蛋白去除試劑將肺組織10 mg均質(zhì),取混合物8 000 r/min離心10 min,取上清液。總的水平測(cè)定了肺組織中的GSH和GSSG波長(zhǎng)為412 nm,計(jì)算GSH/GSSG的值。

1.8 炎癥因子檢測(cè)采用qRT-PCR方法檢測(cè)炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-18和MCP-1)和黏液蛋白(MUC5B)的mRNA水平。根據(jù)產(chǎn)品說明,用TRIzol試劑從組織中提取總RNA,測(cè)定總RNA的濃度。利用HiScript II qRT SuperMix II合成了單鏈互補(bǔ)DNA(cDNA),將得到的cDNA作為后續(xù)qRT-PCR分析的模板。RT-PCR過程采用ChamQ通用SYBR qPCR主混合物和ABI ViiATM7系統(tǒng)進(jìn)行。引物序列見表1。

表1 炎癥因子和黏液蛋白分子的引物序列

1.9 Western blot分析采用Western blot檢測(cè)NLRP3、pro-Caspase 1、Caspase 1(p20)、GSDMD和Cleaved GSDMD的表達(dá)。取適量小鼠肺組織,RIPA緩沖液勻漿提取總蛋白,使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍踪|(zhì)樣品分離使用10%SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,放入一抗稀釋液(1 ∶1 000)中,4 ℃搖床過夜。使用HRP偶聯(lián)的山羊抗兔和抗鼠二抗(1 ∶3 000),在室溫下孵育2 h。TBST洗滌膜后,用ECL檢測(cè)系統(tǒng)觀察條帶。

2 結(jié)果

2.1 SS-31對(duì)O3介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)和BALF炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響與PBS+Air組相比,O3暴露誘導(dǎo)了明顯的氣道高反應(yīng);與PBS+Air組相比,SS-31+Air組的氣道反應(yīng)性沒有明顯變化。與PBS+O3組相比,SS-31預(yù)處理抑制O3引起氣道高反應(yīng)。O3降低了-logPC100(1.957±0.302,P<0.05),而SS-31預(yù)處理升高了-logPC100(2.421±0.136,P<0.01)。O3增加了小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)(34.750±3.655,P<0.01)、巨噬細(xì)胞數(shù)(20.733±3.355,P<0.05)、中性粒細(xì)胞數(shù)(8.708±1.960,P<0.01)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)(0.929±0.405,P<0.05)及淋巴細(xì)胞數(shù)(4.381±0.887,P<0.05)均增高。SS-31 預(yù)處理增加了小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)(28.875±4.299,P<0.01)、中性粒細(xì)胞數(shù)(6.345±1.336,P<0.01)、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)(0.601±0.214,P<0.05)及淋巴細(xì)胞數(shù)(2.615±1.314,P<0.01)均降低。見圖1。

圖1 SS-31抑制了O3誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)和BALF炎癥細(xì)胞數(shù)

2.2 SS-31對(duì)O3介導(dǎo)的氣道黏液產(chǎn)生的影響與PBS+Air組相比,O3暴露誘導(dǎo)明顯的氣道上皮黏液分泌,杯狀細(xì)胞增生積分增加(0.611±0.251,P<0.001)。與PBS+Air組相比,SS-31+Air組的氣道上皮黏液分泌沒有明顯變化。與PBS+O3組相比,SS-31預(yù)處理抑制O3引起的氣道黏液高分泌,且氣道上皮杯狀細(xì)胞增生積分下降(0.167±0.183,P<0.001)。見圖2。

圖2 SS-31抑制O3介導(dǎo)小鼠氣道黏液產(chǎn)生

2.3 SS-31對(duì)O3介導(dǎo)的肺部氧化應(yīng)激水平的影響O3增加了小鼠肺組織MDA水平(67.67±58.45,P<0.01),SS-31預(yù)處理降低O3暴露誘導(dǎo)的MDA水平(51.08±33.73,P<0.001)。O3降低了GSH/GSSG的比值(0.51±0.184,P<0.05),SS-31預(yù)處理提高了GSH/GSSG的比值(1.486±0.819,P<0.01)。見圖3。

圖3 SS-31對(duì)O3誘導(dǎo)的肺部氧化應(yīng)激的影響

2.4 SS-31對(duì)O3介導(dǎo)的炎癥因子和黏液蛋白水平的影響與PBS+Air組相比,PBS+O3組小鼠肺組織炎癥因子,包括IL-1β(2.039±0.992,P<0.001)、IL-6(3.055±0.713,P<0.001)、IL-18(1.832±0.362,P<0.05)、MCP-1(1.843±0.409,P<0.01)和黏液蛋白MUC5B(2.434±1.786,P<0.05)的mRNA水平增加。SS-31預(yù)處理抑制O3暴露誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β(1.238±0.646,P<0.05)、IL-6(1.702±0.71,P<0.01)、IL-18(0.739±0.321,P<0.001)、MCP-1(1.141±0.473,P<0.05)和黏液蛋白MUC5B(0.964±0.553,P<0.05)mRNA水平的表達(dá)。見圖4。

圖4 SS-31對(duì)O3介導(dǎo)的肺部炎癥因子和黏液蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 SS-31對(duì)O3引起的NLRP3的表達(dá)及Caspase 1和GSDMD的活化水平的影響與PBS+Air組相比,PBS+O3組小鼠肺組織炎性小體NLRP3表達(dá)水平增加(1.007±1.131,P<0.05),Caspase 1(1.118±0.226,P<0.05)和GSDMD(0.967±0.272,P<0.05)的活化增強(qiáng)。SS-31預(yù)處理降低O3暴露引起的NLRP3(0.736±0.177,P<0.05)及Caspase 1(0.698±0.174,P<0.01)和GSDMD(0.592±0.205,P<0.01)的活化水平。見圖5。

圖5 NLRP3/Caspase 1/GSDMD蛋白表達(dá)水平

3 討論

ROS在氧化應(yīng)激、氣道炎癥、上皮細(xì)胞損傷、黏液分泌等過程中起著關(guān)鍵作用。炎癥細(xì)胞在吞噬過程中產(chǎn)生大量ROS,同時(shí),組織細(xì)胞如上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下也可以產(chǎn)生ROS[6]。線粒體及其電子傳遞鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞器之一。O3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能參與炎癥小體NLRP3復(fù)合物的激活。小鼠急性臭氧暴露和慢性臭氧暴露均通過Caspase激活的炎癥小體NLRP3激活ROS并誘導(dǎo)肺部炎癥和氧化應(yīng)激,該過程的發(fā)生、發(fā)展需要通過炎癥小體NLRP3激活Caspase 1,促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18向成熟的IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)化,裂解的GSDMD穿透細(xì)胞膜[7]。在煙草暴露模型中,煙草能夠激活炎癥小體NLRP3,提高Caspase 1、IL-1β和IL-18的表達(dá)水平,并增強(qiáng)Caspase 1的活性[8]。因此,該研究使用MDA為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物(膜脂質(zhì)過氧化物指數(shù)),SS-31抑制O3介導(dǎo)的肺組織MDA水平。同時(shí),SS-31也降低炎癥小體NLRP3蛋白水平和Caspase 1、GSDMD活性水平表達(dá)增加。

氣道高反應(yīng)性是哮喘和氣道炎癥的一個(gè)重要特征,一些外部環(huán)境因素,如煙草、細(xì)菌和病毒感染,是氣道高反應(yīng)的高危因素。了解氣道高反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制對(duì)于闡明哮喘的發(fā)病是至關(guān)重要的,而氣道高反應(yīng)性的程度與哮喘的嚴(yán)重程度密切有關(guān)。然而,迄今為止,導(dǎo)致氣道高反應(yīng)的潛在分子機(jī)制尚未完全了解。近期研究[9]表明,臭氧暴露可增加急性期細(xì)胞因子,包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-18和一些趨化因子。IL-6可以通過選擇性地調(diào)節(jié)急慢性炎癥中的趨化因子和細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)中招募白細(xì)胞。IL-1和TNF-α等促炎細(xì)胞因子的合成和釋放可以增加對(duì)Ach和氣道中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的反應(yīng)性[10]。氧化應(yīng)激可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重并且誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)。在對(duì)小鼠急性O(shè)3暴露模型的研究中,線粒體靶向抗氧化劑SS-31能夠抑制由O3介導(dǎo)的氣道高反應(yīng)和BALF中炎癥細(xì)胞,降低肺組織炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-18和MCP-1)mRNA表達(dá)水平。

氣道黏液高分泌是哮喘重要的病理特征。氣道黏液主要是由糖蛋白、脂質(zhì)、非糖蛋白、無(wú)機(jī)鹽、水組成。在O3刺激下,小鼠氣道黏液分泌增多,會(huì)引起纖毛功能障礙,阻塞氣道,影響有效呼吸運(yùn)動(dòng)[11]。MUC5B是由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生,研究表明哮喘氣道上皮杯狀細(xì)胞增生明顯,肺組織中MUC5B mRNA也會(huì)明顯升高。然而,O3誘導(dǎo)的非嗜酸性粒細(xì)胞哮喘增強(qiáng)氣道黏液分泌的潛在分子機(jī)制目前尚不清楚。有研究[12]表明,O3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能參與黏液蛋白的分泌。MCP-1是CC趨化因子家族的一員,是一種重要的促炎細(xì)胞因子,主要是由肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生,介導(dǎo)單核細(xì)胞到達(dá)受損組織,參與增加血管通透性,加重組織炎癥。研究表明,在煙草刺激下,MCP-1可以通過其受體CCR2誘導(dǎo)趨化并激活支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白相關(guān)作用的激酶如MAPK,MCP-1表達(dá)增強(qiáng)與黏液蛋白MUC5AC和MUC5B蛋白表達(dá)增加有關(guān)[13]。而PM2.5可通過刺激氣道上皮細(xì)胞從而引起黏液的過度分泌,同時(shí),黏液蛋白MUC5B在控制PM2.5誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,具有控制炎癥和維持免疫穩(wěn)定性的功能[14]。此外,炎癥小體NLRP3可以調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞功能,NLRP3可介導(dǎo)鼻病毒誘導(dǎo)的炎癥、焦亡和黏液分泌[15]。該研究表明O3不僅介導(dǎo)氣道黏液高分泌,而且促進(jìn)小鼠肺組織的黏液蛋白MUC5B、炎癥小體NLRP3和IL-1β的表達(dá)。