負載褐藻多酚的絲素蛋白GBR生物膜制備及其性能的體外實驗研究

陳文澤,鄒多宏,2

由牙周炎癥、外傷、感染等原因造成的牙槽骨骨量不足使得口腔種植體在植入后無法實現(xiàn)充分的骨整合,從而不利于口腔種植術(shù)后獲得良好的預(yù)后[1]。引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration, GBR)技術(shù)是臨床上治療牙槽骨缺損常用且有效的方法之一,通過屏障膜隔絕骨缺損區(qū)域外非成骨細胞向缺損區(qū)域的遷移,從而為缺損區(qū)域內(nèi)骨組織的形成提供了空間,因此,屏障膜在GBR技術(shù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。理想的GBR屏障膜應(yīng)具備良好的機械性能、生物相容性、生物可降解性以及一定的促成骨能力等特性[3],如何獲得兼具這些特性的GBR屏障膜仍是亟待解決的問題。該實驗使用絲素蛋白 (silk fibroin, SF) 制備了雙層絲素蛋白膜,并在其粗糙面上負載褐藻多酚 (phlorotannins, PT),使該膜兼具生物可降解性、良好的抗拉強度、良好的生物相容性以及促進人牙槽骨骨髓間充質(zhì)干細胞成骨向分化的能力,可作為新型骨組織工程生物屏障膜使用。

1 材料與方法

1.1 合成材料蠶繭(浙江久恒蠶絲制品經(jīng)營部);碳酸鈉、溴化鋰(美國 Sigma-Aldrich公司);MWCO 3500透析袋(美國 Pierce公司);褐藻多酚(陜西帕尼爾公司)

1.2 主要試劑與儀器α-MEM、胰酶消化液、青-鏈霉素溶液、BCIP/BNT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);活死細胞染色試劑盒(美國 Proteintech公司);胎牛血清(美國Gibco公司);人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所);PCR引物(上海生物工程股份有限公司);CO2孵育箱、酶標(biāo)儀、實時熒光定量PCR儀、傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社);高溫高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1人牙槽骨骨髓干細胞的分離與培養(yǎng) 門診收取18～24周歲女性患者骨阻生第3磨牙時去除的牙槽骨,放入取材液(含5%青-鏈霉素雙抗溶液的α-MEM的培養(yǎng)基)中,冰盒內(nèi)保存。用含有2%雙抗的PBS沖洗3次,用無菌手術(shù)刀片清除附著軟組織,用組織剪分離骨松質(zhì)并剪碎,5 d后首次換液,以后每3 d換液1次,培養(yǎng)10～12 d獲得P0代。將獲得的原代細胞進行傳代擴增,計數(shù),將細胞凍存?zhèn)溆?。取?代hABMSCs供實驗用。

1.3.2制備SF溶液 蠶繭在0.02 mol/L碳酸鈉溶液中煮沸30、60、90 min后在蒸餾水中沖洗3次,每次30 min進行脫膠處理。脫膠后的蠶絲干燥12 h后在60 ℃的9.3 mol/L溴化鋰溶液中溶解4 h,所得的溶液裝入MWCO 3500透析袋內(nèi)在蒸餾水中透析2 d。最后將透析袋內(nèi)的溶液移入離心管,18 000 r/min離心2次,每次20 min,收集上清液。

1.3.3制備PT-SF雙層膜 將SF溶液澆鑄于亞克力板上,室溫放置24 h后成膜,真空水蒸氣處理24 h,取出后固定于不銹鋼板上,在膜上涂布SF溶液,放入-80 ℃冰箱,使不銹鋼板與冰箱隔板緊密接觸,冷凍過夜后將其轉(zhuǎn)入凍干機凍干,再經(jīng)真空水蒸氣處理24 h獲得SF雙層膜。將3.5 μg的PT溶解于1 ml無水乙醇中制備PT溶液,按照6.5 μl/cm2的比例在SF雙層膜的粗糙面上滴加PT溶液,放置在生物安全柜中直到干燥,并保存在-80 ℃冰箱中供后續(xù)使用。

1.3.4力學(xué)測試 將不同脫膠時長的SF雙層膜裁剪為長 100 mm、寬10 mm 的測試樣品,浸泡于PBS內(nèi)室溫過夜,并通過力學(xué)萬能實驗機以 0.01 mm / s 的拉伸速度勻速拉伸直至樣品斷裂,測量其室溫條件下的濕態(tài)抗拉強度,每組樣品重復(fù)測試 5次。

1.3.5結(jié)構(gòu)表征 取抗拉強度最大的SF雙層膜所對應(yīng)的SF溶液重新制備膜樣品。低真空下噴金后使用掃描電鏡在15.0 kV的加速電壓下拍攝樣品的光滑面與粗糙面,取PT粉末、SF膜和PT-SF雙層膜采用傅立葉變換紅外光譜儀分析各成分。

1.3.6細胞生物相容性實驗 按照國際標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO/EN10993-12)規(guī)定提取SF雙層膜與PT-SF雙層膜的浸提液,將高溫高壓消毒后的各組樣品浸泡于含10 %胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的α-MEM培養(yǎng)基內(nèi)24 h,樣品與培養(yǎng)基比例為1 g/10 ml[4]。在96孔板內(nèi)接種細胞,每組每個時間點5個副孔,每孔接種1× 104個hABMSCs。接種24 h后更換培養(yǎng)基,對照組使用普通培養(yǎng)基培養(yǎng),SF組與PT-SF組使用對應(yīng)的浸提液培養(yǎng),此后每3 d換液1次。在1、4、7、14 d時分別棄去培養(yǎng)基,PBS清洗2次,每孔加入CCK-8溶液(CCK-8 ∶DEME=1 ∶9)100 μl,37 ℃孵育2 h后使用酶標(biāo)儀讀取每孔在450 nm處的吸光度值。

1.3.7細胞活力及細胞黏附實驗 細胞活力實驗:將SF雙層膜、PT-SF雙層膜制備成直徑10 mm的圓形樣品。在每個樣品上接種5× 104個hABMSCs,空白組將細胞接種于24孔板底,每組3個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后按照活死細胞染色試劑盒使用說明進行染色操作,使用熒光顯微鏡進行觀察;細胞黏附實驗:將PT-SF雙層膜制備成直徑6 mm的圓形樣品。在每個樣品的粗糙面上接種1×104個hABMSCs,48 h后,PBS清洗3遍,用4 %多聚甲醛固定樣品30 min后PBS清洗3遍,使用掃描電鏡拍攝樣品。

1.3.8細胞成骨分化的檢測 qRT-PCR:將1×105個hABMSCs分別接種在SF雙層膜和PT-SF雙層膜的粗糙面上,細胞接種24 h后吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次后每孔加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基1 ml,此后每3 d更換1次,在成骨誘導(dǎo)第7天時用TRIzol提取細胞中的RNA并根據(jù)試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用qRT-PCR檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),RUNX相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX family transcription factor 2, RUNX2)和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix, OSX)基因表達水平(引物序列見表1)。ALP染色與茜素紅染色:將消毒后的各組樣品分別浸泡于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)24 h,樣品與培養(yǎng)基的比例為1 g/10 ml,獲得浸提液。將hABMSCs接種于12孔板內(nèi),每孔1×105個,24 h后更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或相應(yīng)浸提液,每3 d換液1次,7 d后采用ALP染色的方法檢測ALP活性,14 d后采用茜素紅染色的方法檢測鈣鹽沉積情況。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 不同脫膠時間的絲素蛋白溶液制備的膜抗拉強度的比較圖1A為分別由脫膠時間30、60、90 min的絲素蛋白溶液制備而成的絲素蛋白雙層膜在濕態(tài)條件下的拉伸曲線;隨著脫膠時間從30、60 min增加至90 min,絲素蛋白雙層膜的抗拉強度從 (3.293±0.122 8)、(2.649±0.096 6)MPa 降低至(2.077±0.181 3) MPa(圖1B)。

圖1 SF雙層膜的抗拉強度測試

2.2 樣品表征掃描電鏡可見SF雙層膜光滑面表面致密光滑 (圖2A),粗糙面疏松多孔(圖2B),截面可見粗糙面呈縱向有序多孔的結(jié)構(gòu) (圖2C);與SF相比,在PT-SF中氫鍵和N-H伸縮振動由3 275移動至3 274 cm-1,C-H伸縮振動由2 937移動至2 930 cm-1,C-N伸縮振動和N-H彎曲振動由1 514移動至1 512 cm-1(圖2D)。這表明PT可能通過氫鍵、疏水作用等作用力與SF發(fā)生了相互作用,從而結(jié)合到了SF雙層膜的粗糙面上。

圖2 SF雙層膜及PT-SF雙層膜的微觀結(jié)構(gòu)及成分分析

2.3 細胞黏附能力及PT-SF雙層膜生物相容性實驗hABMSCs接種在PT-SF雙層膜的粗糙面48 h后,掃描電鏡結(jié)果表明細胞可以較好的黏附在PT-SF雙層膜的粗糙面上 (圖3A、B)。CCK-8結(jié)果顯示,使用浸提液培養(yǎng) 1、4、7、14 d后,空白組、SF組和PT-SF組之間的吸光度值無明顯差異 (圖3C);活死細胞染色結(jié)果如圖3D顯所示,活細胞呈綠色熒光 (Live),死細胞呈紅色熒光 (Dead),空白組、SF組及PT-SF組粗糙面上活死細胞比例無明顯差異。

圖3 PT-SF 膜的生物相容性

2.4 促成骨分化能力qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白組及SF組相比,PT-SF組的成骨相關(guān)基因ALP、RUNX2 (P=0.056 5,F=10.38) 以及OSX 的表達顯著性增強,其中ALP 與OSX的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008 7,F=36.66;P=0.047 5,F=11.89)(圖4A-C)且成骨誘導(dǎo)至第7天 時ALP染色及第14天時茜素紅染色結(jié)果顯示,PT-SF組的ALP陽性結(jié)果及茜素紅著色更加明顯(圖4D、E)。

圖4 PT-SF雙層膜的促成骨分化能力檢測

3 討論

臨床上使用的可吸收性GBR膜多由人工合成高分子材料或天然高分子材料制成,人工合成高分子材料制備的GBR膜在降解過程中可能會引發(fā)局部的炎癥反應(yīng)不利于成骨[5],而天然高分子材料制備的膜則通常力學(xué)性能較差[6]。絲素蛋白是一種來源廣泛的天然高分子蛋白材料,具有優(yōu)異生物相容性和力學(xué)性能,同時其分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)成骨組織的主要有機成分I型膠原纖維具有高度的相似性,因此,在骨組織工程領(lǐng)域被公認為頗具潛力的天然材料[7]。褐藻多酚是一種來源于褐藻的多酚類物質(zhì),既往研究[8]表明褐藻多酚具有抗氧化、抗菌等作用,同時也有研究[9-10]表明褐藻多酚具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨方向分化的能力 。

該實驗通過溶液澆鑄、定向冷凍及冷凍干燥技術(shù)制備了由致密層和多孔層共同構(gòu)成的雙層絲素蛋白膜。其朝向軟組織面的致密層表面光滑結(jié)構(gòu)致密,致密的結(jié)構(gòu)可為SF雙層膜提供良好的力學(xué)性能,拉伸實驗[11]結(jié)果表明其濕態(tài)下抗拉強度可達 (3.293±0.122) MPa,顯著高于市售Bio-Gide 膠原膜的(1.68±0.54) MPa;朝向骨組織面的多孔層則具有粗糙表面,呈現(xiàn)出且與致密層的表面相垂直的“蜂窩”狀多孔結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)可為細胞提供有效的附著位點,對于骨缺損區(qū)域內(nèi)成骨相關(guān)細胞的黏附具有一定的促進作用[12]。在此基礎(chǔ)上利用多酚類物質(zhì)易與蛋白質(zhì)通過氫鍵、疏水鍵及共價鍵發(fā)生反應(yīng)的特點,在SF雙層膜的粗糙面上實現(xiàn)了褐藻多酚的負載[13]。體外細胞實驗結(jié)果表明細胞可以較好的與PT-SF雙層膜共存并能隨培養(yǎng)時間的延長而不斷增殖。既往研究[9]表明,褐藻提取物可能通過激活Wnt和BMP通路上調(diào)成骨相關(guān)基因RUNX2、OSX以及ALP的表達。體外實驗表明,與空白組和SF組相比PT-SF組由于PT的加入,hABMSCs內(nèi)RUNX2與OSX的表達增強, 同時ALP表達水平及活性也均高于空白組和SF組。以上結(jié)果表明PT-SF雙層膜具有良好的機械性能以及生物安全性,雙層膜的結(jié)構(gòu)設(shè)計兼顧了屏障功能以及促進細胞黏附的功能,同時結(jié)合在粗糙面上的PT彌補了SF雙層膜在促成骨能力上的缺陷。

綜上所述,該研究通過溶液澆鑄、定向冷凍及冷凍干燥技術(shù)構(gòu)建了PT-SF雙層膜。相關(guān)實驗結(jié)果顯示,所制備的PT-SF雙層膜有望作為新型的GBR 膜應(yīng)用于臨床。