UGT1A1基因突變與多例延遲晚發(fā)特異性黃疸探索研究＊

龔 偉 邱 里 吳 秀

婁底市婦幼保健院/婁底市兒童醫(yī)院 (湖南 婁底 417000)

新生兒延遲晚發(fā)性黃疸在臨床中兒科常見(jiàn)疾病之一，近年來(lái)醫(yī)學(xué)認(rèn)為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(uridine diphos phate glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1)基因突變與新生兒延遲晚發(fā)性黃疸高發(fā)生有關(guān)。UGA1A1是人體內(nèi)唯一一種催化膽紅素進(jìn)行結(jié)合發(fā)生反應(yīng)的酶，UGA1A1特異性底物為膽紅素，UGA1A1在膽紅素代謝過(guò)程中起到極為重要的作用，UGA1A1基因編碼區(qū)多態(tài)性會(huì)引起基因表達(dá)或者酶活性變化，與新生兒晚發(fā)特異性黃疸高發(fā)生率存在密切聯(lián)系[1]。同時(shí)，UGA1A1基因突變會(huì)引發(fā)Gilbert綜合征(先天性非結(jié)合型高膽紅素血癥)，此類(lèi)疾病的發(fā)生會(huì)增加新生兒期遷延性黃疸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。本研究旨在探討UGT1A1基因突變與多例延遲晚發(fā)特異性黃疸的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料實(shí)驗(yàn)研究選取我院2022年2月1日至2023年3月1日期間臨床診斷70例遷延性新生兒黃疸為觀察組，65例無(wú)黃疸新生兒為對(duì)照組，所選新生兒均足月出生，出生后均接受母乳喂養(yǎng)。觀察組新生兒胎齡＞37周，平均胎齡(275.21±7.62)d；出生時(shí)體重＞2.5kg，平均體重(3.07±0.62)kg；對(duì)照組新生兒為同期住院患兒，胎齡＞37周，平均胎齡(276.34±7.21)d；出生時(shí)體重＞2.5 kg，平均體重(3.11±0.59)kg。兩組新生兒在性別、胎齡、體重等項(xiàng)目上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t檢驗(yàn),P＞0.05)。

觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在14d～28d；黃疸發(fā)生在新生兒時(shí)期；黃疸病癥持續(xù)≥14d且遷延不退；簽署研究知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：出生后14 天內(nèi)臨床診斷治療有明確病因?qū)е曼S疸遷延不退者；肝細(xì)胞性黃疸患兒；阻塞性黃疸患兒；感染性黃疸患兒；母乳性黃疸患兒。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在14d～28d；無(wú)病理性黃疸；因新生兒臍炎、肺炎等除黃疸外病因住院；正常新生兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：血常規(guī)、胸片、C反應(yīng)蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞、肝功能等項(xiàng)目檢查有異常；未簽署研究知情同意書(shū)。

1.2 基因檢測(cè)方法通過(guò)倫理委員會(huì)審核及監(jiān)護(hù)人知情同意情況下，對(duì)符合條件的新生兒進(jìn)行UGT1A1基因Gly71Arg位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，方法如下：(1)基因組DNA提?。菏褂肊DTA抗凝管采集新生兒外周血2mL，使用試劑盒(fastPure blood DNA Isolation mini kit V2，vazyme)提取DNA，基因組DNA 4℃保存。(2)靶向引物設(shè)計(jì)：以UGT1A1基因的側(cè)翼序列和第一外顯子設(shè)計(jì)引物。(3)PCR：反應(yīng)體積為20μL，采用TaKaRa rTaq聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性95 ℃、5 min，變性 94 ℃、30 s，退火60 ℃、40 s，延伸72 ℃、1min，循環(huán)35次，最后延伸72 ℃、10min。將PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并溴乙錠染色，通過(guò)透射式紫外線燈對(duì)產(chǎn)物片段大小進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法本研究所有數(shù)據(jù)均納入SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以[n,(%)] 表示行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，以(±s) 表示平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，以α=0.05為標(biāo)準(zhǔn)，若P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組新生兒一般資料比較見(jiàn)表1。

表1 兩組新生兒一般資料

2.2 兩組UGT1A1基因突變比較見(jiàn)表2。兩組新生兒基因型分布存在差異(卡方檢驗(yàn)，P＜0.05)，突變型(純合子和雜合子)觀察組34(48.57%)明顯高于對(duì)照組16(24.62%)，P＜0.05；Arg等位基因頻率觀察組29.29%明顯高于對(duì)照組13.85%(卡方檢驗(yàn)，P＜0.05)；Gilbert綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)觀察組42(60.00%)明顯高于對(duì)照組12(18.46%)，P＜0.05。

表2 兩組UGT1A1基因突變 [n,(%)]

2.3 兩組新生兒血清總膽紅素均值比較見(jiàn)表3。兩組新生兒血清總膽紅素比較中，由于新生兒出生72h內(nèi)，在不同時(shí)間的總膽紅素干預(yù)黃疸的數(shù)值并非固定不變，因此選擇出生72h后，干預(yù)黃疸的總膽紅素值作為峰值進(jìn)行比較為準(zhǔn)，觀察組70例新生兒72 h后總膽紅素均值396.37±79.15μmol/L明顯高于對(duì)照組65例新生兒總膽紅素均值305.21±41.34μmol/L(t檢驗(yàn)，P＜0.05)。

表3 兩組新生兒血清總膽紅素均值

3 討 論

新生兒黃疸是新生兒時(shí)期常見(jiàn)的高發(fā)病癥，也是全球范圍內(nèi)兒科醫(yī)生共同關(guān)注的熱點(diǎn)和重點(diǎn)問(wèn)題[3]。目前臨床常規(guī)的診療方法對(duì)新生兒黃疸已經(jīng)不能獲取到較為滿意的治療效果，甚至部分黃疸重癥新生兒死于急性期，幸存患兒有七成以上可能并發(fā)較為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，對(duì)新生兒生存質(zhì)量及健康情況造成極為嚴(yán)重的威脅[4]。近年來(lái)有資料顯示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)基因的變異與多態(tài)性是有可能導(dǎo)致新生兒黃疸的遺傳高危風(fēng)險(xiǎn)因素。UGT基因存在于部分脊椎動(dòng)物的肝部微粒體中，是糖基轉(zhuǎn)移酶超家族之一，同時(shí)也是生物體內(nèi)進(jìn)行Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中最重要的酶之一[5]。其中UGT1A1基因是肝臟中刺激膽紅素葡萄糖醛酸化產(chǎn)生反應(yīng)的活性酶，也是對(duì)膽紅素清除起到調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶[6]。也有研究表明新生兒體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生較多的膽紅素，但由于其膽紅素清除效率較低，部分未發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的膽紅素進(jìn)入肝細(xì)胞當(dāng)中，在UGT1A1的影響下與葡萄糖醛酸產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致水溶性膽紅素生成，后隨尿液排出，降低新生兒體內(nèi)膽紅素含量。當(dāng)UGT1A1基因發(fā)生突變，其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，原本功能隨之缺失，造成膽紅素結(jié)合能力發(fā)生下降，從而引發(fā)新生兒黃疸病癥[7-8]。Gilbert綜合征屬于一種較為常見(jiàn)的遺傳性肺結(jié)核高膽紅素血癥，此病癥的發(fā)生與UGT的活性下降有著密切的關(guān)系。臨床研究表明控制Gilbert綜合征發(fā)病的UGT基因在2號(hào)染色體2q37上，正常情況下UGT基因編碼的蛋白會(huì)使葡萄糖醛酸與膽紅素相結(jié)合，使得非結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)為結(jié)合性膽紅素[9-11]。當(dāng)UGT1A1基因發(fā)生變異后，基因的表達(dá)水平下降導(dǎo)致非結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)化的過(guò)程受到影響，最終導(dǎo)致Gilbert綜合征的發(fā)生，同時(shí)Gilbert綜合征也是促使新生兒發(fā)生遷延性黃疸病癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的重要因素[12-13]。

UGT1A1基因編碼序列變異會(huì)導(dǎo)致UGT結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，出現(xiàn)酶結(jié)合功能方面的喪失與缺陷，而在啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)能力明顯下降，致使酶的活性降低，使得非結(jié)合膽紅素在人體體內(nèi)蓄積，最終成為引發(fā)新生兒黃疸的高危因素。在臨床實(shí)驗(yàn)中已明確UGT1A1的基因突變有兩種類(lèi)型，TATA插入型和編碼區(qū)突變型，后者又分為Gly71Arg、Arg367Gliy等不同基因型，本次研究表明新生兒黃疸與UGT1A1基因Gly71Arg的突變存在密切關(guān)系，且該突變對(duì)延遲晚發(fā)特異性黃疸的發(fā)生有一定的影響作用。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在參與實(shí)驗(yàn)的兩組新生兒中，在遷延性黃疸患兒突變型(純合和雜合)34例(48.57%)相明顯高于對(duì)照組無(wú)黃疸病癥新生兒16例(24.62%)，同時(shí)等位基因(Arg)的頻率觀察組(29.29%)也明顯要高于對(duì)照組(13.85%)，這表明UGT1A1基因的Gly71Arg點(diǎn)突變與遷延性黃疸的發(fā)生有著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。參與實(shí)驗(yàn)的兩組患兒中，Gilbert綜合征潛在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)觀察組42(60.00%)較對(duì)照組12(18.46%)明顯更高，這也表明Gilbert綜合征會(huì)影響新生兒遷延性黃疸的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，帶有Arg等位基因突變的新生兒出現(xiàn)遷延性黃疸的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)呈正比增加。本次研究對(duì)象當(dāng)中，發(fā)生UGT1A1基因Gly71Arg點(diǎn)突變的患兒血清總血膽紅素水平明顯要高于無(wú)遷延性黃疸患兒，說(shuō)明Gly71Arg突變會(huì)導(dǎo)致新生兒體內(nèi)血膽紅素提高，這種升高可能是葡萄糖醛栓中轉(zhuǎn)移酶活性被影響而造成的。在本次研究中未包括不足月新生兒，主要因其特殊的生理特點(diǎn)，若患有黃疸一類(lèi)病癥則表現(xiàn)較為嚴(yán)重，耐受性差，而且極易引發(fā)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

通過(guò)本次研究結(jié)果可以看出，UGT1A1基因的突變與新生兒延遲晚發(fā)性黃疸有著極為緊密的聯(lián)系，其引發(fā)的Gilbert綜合征也會(huì)導(dǎo)致新生兒延遲晚發(fā)性黃疸發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升，UGT1A1基因多態(tài)性研究具有十分重要的臨床意義，其所發(fā)生的基因突變現(xiàn)象與多種疾病相關(guān)，也會(huì)影響多種藥物代謝過(guò)程。雖然新生兒黃疸是新生兒期較為常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，但若發(fā)展成高膽紅素血癥，會(huì)嚴(yán)重威脅患兒的生命安全并造成嚴(yán)重或永久性的精神系統(tǒng)損傷而產(chǎn)生后遺癥，所以及時(shí)準(zhǔn)確的尋找病因，對(duì)此類(lèi)疾病進(jìn)行積極預(yù)防，早期治療和干預(yù)顯得極為重要。