種豬常溫精液畸形率檢測及不確定度評定

薛 冰

（ 遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 遼陽 111000 ）

為適應(yīng)生豬產(chǎn)品消費(fèi)市場需求和養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展需要，遼寧省先后從丹麥、瑞典、美國、加拿大等國引進(jìn)長白、大白、杜洛克等豬種。與本地豬相比，這些引進(jìn)品種具有瘦肉率高、飼料報酬高和生長速度快等特點，市場競爭優(yōu)勢明顯，得到快速普及和推廣。但近年來由于生豬遺傳改良工作滯后，導(dǎo)致種豬質(zhì)量提高進(jìn)展緩慢，形成“引種-退化-再引種”惡性循環(huán)，良種對養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的推進(jìn)作用越來越不明顯。因此，以加強(qiáng)引進(jìn)種豬遺傳改良為突破口，完善種豬測定、質(zhì)量檢驗和遺傳評估體系建設(shè)，不斷提高種豬質(zhì)量，建立自主種源體系，方可打破“引種-退化-再引種”惡性循環(huán)，對提高全省種豬質(zhì)量、規(guī)范種豬市場秩序、保障生豬種源安全和推動養(yǎng)豬業(yè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效發(fā)展具有十分重要的作用。

精液品質(zhì)影響種豬人工授精的成功率，種豬常溫精液畸形率測定是精液品質(zhì)檢測一項重要指標(biāo)。測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)的參數(shù)，是判定測定結(jié)果質(zhì)量的依據(jù)[1-2]。而不確定度可用于表征種豬精液品質(zhì)檢測結(jié)果是否具有可靠性，因而對種豬常溫精液品質(zhì)的符合性判定起到至關(guān)重要的作用[3]。本試驗根據(jù)GB 23238—2021 的要求[4]對種豬常溫精液品質(zhì)進(jìn)行檢測，分析種豬常溫精液檢測畸形率全過程，對影響畸形率檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素進(jìn)行探討，評定影響其測定結(jié)果的不確定度分量，為檢測結(jié)果的可靠性和種豬精液符合性評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 精液

試驗所用的10份種豬常溫精液來自錦州某供精站。

1.1.2 主要試劑及儀器

ML-810JZ 全自動動物精子分析儀（南寧松景天倫生物科技有限公司）、10 μL 移液器（EPPENDORF）以及小吸管、載玻片、血細(xì)胞計數(shù)器、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醛、甘油、吉姆薩染料等，所用試劑均為分析純，所用耗材均須無菌、無毒[5]。

檢測室內(nèi)要求干凈、整潔，配備控溫和控濕設(shè)備，保證工作時室溫在20～25 ℃，相對濕度在35%～55%，并做好溫濕度記錄[6]。

1.1.3 試劑配制

配制磷酸鹽緩沖液：0.55 g 磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和2.25 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）溶于蒸餾水并定容至100 mL容量瓶。

配制中性福爾馬林固定液：0.55 g 磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和2.25 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）溶于約50.0 mL 0.89%氯化鈉，溶解后加入8.0 mL 40%甲醛（使用前經(jīng)碳酸鎂中和過濾），再加入0.89%氯化鈉溶液定容至100.0 mL。

吉姆薩染液：吉姆薩原液2.0 mL 與磷酸鹽緩沖液3.0 mL、蒸餾水5.0 mL混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗方法

種豬常溫精液按照GB 23238—2021 要求進(jìn)行檢測，試驗由檢驗人員獨(dú)立檢測10份種豬常溫清液，用數(shù)字標(biāo)記好精子畸形率指標(biāo)。

1.2.1 制片、染色

抹片：吸取一滴精液滴于載玻片一端，取另一載玻片（要求邊緣光滑）與放置樣品的載玻片呈35°并輕輕滑動，均勻地將樣品涂于載玻片上，自然風(fēng)干擺放約5 min，每個樣品須制作兩個相同抹片。

福爾馬林固定：將1.0～2.0 mL中性福爾馬林固定液滴于已風(fēng)干的抹片上，固定時間15 min，用蒸餾水沖去固定液，自然風(fēng)干。

吉姆薩染色：取固定好的抹片，反扣于有平槽的有機(jī)玻璃上，將吉姆薩染色液用滴管滴于槽中，使染色液完全覆蓋抹片和平槽，染液充分接觸抹片，染色1.5 h，之后用洗瓶沖去染液，放置晾干待檢[7]。

1.2.2 精子畸形率

取制備好的抹片置于顯微鏡下觀察，調(diào)整視野為400～600 倍，每個抹片觀察左、右兩個區(qū)各200 個以上的精子，觀察順序為從左到右、從上到下，邊觀察邊計數(shù)，計算兩個抹片畸形率的平均值。兩個抹片畸形率差值不大于6[8]可認(rèn)為符合要求，不符應(yīng)重新按上述流程制作[4]。精子畸形率按公式（1）計算：

式中：A為畸形率；A1為畸形精子數(shù)；S為精子總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

建立不確定度數(shù)學(xué)模型，得到畸形率測量結(jié)果不確定度主要來源評定的重復(fù)性，故屬于A類不確定度。計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度、相對擴(kuò)展不確定度，得出其擴(kuò)展不確定度。

2.2 不確定度數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)GB 23238—2021 的規(guī)定，按標(biāo)準(zhǔn)測定方法以及公式建立的測量不確定度數(shù)學(xué)模型見公式（1），為種豬常溫精液檢測畸形率的測量不確定度。由公式（1）可知，A1、S為種豬精液品質(zhì)精子畸形率不確定度的分量來源。

2.3 儀器不確定度計算U(t)

可查詢?nèi)詣觿游锞臃治鰞x投影顯微鏡的分辨率（△）為0.1 μm，假定生物投影顯微鏡的分辨率最大允差為均勻分布，其產(chǎn)生的不確定度為：U(t)=△/k=0.005 8。

2.4 檢測不確定度計算

圖1 種豬常溫精液精子畸形率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.1 Mean and standard deviation of sperm malformation rate in normal temperature semen of breeding pigs

表1 種豬常溫精液精子畸形率Tab.1 Sperm abnormality rate of boar normal temperature semen

試驗結(jié)果也可采用擴(kuò)展不確定度表示，取包含因子K=2，則擴(kuò)展不確定度為U=K×U（M）＝1.68%（置信概率約95%）。

3 討論

研究表明，精子畸形率是除精子活力之外，對受精率影響最大的指標(biāo)[9]。本文建立測量不確定度模型，通過檢測種豬常溫精液精子畸形率，針對主要影響種豬精子畸形率檢測結(jié)果可靠性的因素進(jìn)行分析，建立種豬精液品質(zhì)檢測結(jié)果可靠性評估的方法。檢測方法依據(jù)《種豬常溫精液》（GB 23238—2021），不確定度計算依據(jù)《用蒙特卡洛法評定測量不確定度》（JJF 1059.2—2012）。

本試驗中精子畸形率的檢測設(shè)備為生物投影顯微鏡。付雪林等[3]認(rèn)為，生物投影顯微鏡分辨率產(chǎn)生的不確定度分量對精子畸形率檢測產(chǎn)生的準(zhǔn)確度影響最小，與本文儀器不確定度的計算結(jié)果（0.005 8）相符。本試驗檢測結(jié)果表明，生物投影顯微鏡分辨率產(chǎn)生的不確定度分量對精子畸形率檢測產(chǎn)生的準(zhǔn)確度影響較小。李何君等[10]結(jié)果表明，精子畸形率檢測標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.9%，擴(kuò)展不確定度為1.8%，與本研究結(jié)論相近。

精子畸形率是精子經(jīng)染色液染色后在顯微鏡下判別畸形精子的比率。常見的精子染色方法有吉姆薩染色法[11]、考馬斯亮藍(lán)染色法[12]、伊紅染色法[13]等，本試驗參考國家標(biāo)準(zhǔn)《種豬常溫精液》（GB 23238—2021），采用吉姆薩染色法對精子進(jìn)行染色，精子染色后檢測確定配制吉姆薩染色液的濃度不會對結(jié)果產(chǎn)生影響。精子畸形率檢測時需要檢驗人員用肉眼在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，不同的操作人員對畸形精子的評判標(biāo)準(zhǔn)也會存在差別[3]。此外，制樣和固定、鏡檢過程中的操作對精子畸形率測定結(jié)果也會產(chǎn)生影響，因此，操作人員的技術(shù)水平對精子畸形率的不確定度分量的影響較大。

種豬常溫精液是開展人工授精技術(shù)的基礎(chǔ)，是提高豬人工授精率的關(guān)鍵因素。抓好種豬常溫精液生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，建立健全精液的質(zhì)量監(jiān)管體系，如精液的生產(chǎn)、檢測、保存和運(yùn)輸?shù)冗^程，能夠保證優(yōu)秀種公豬的精液品質(zhì)，充分發(fā)揮優(yōu)秀種公豬的種用價值，提高母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展[14]。豬常溫精液供精中心可實現(xiàn)優(yōu)秀種豬精液規(guī)?；瘍Υ婧痛蠓秶馁Y源共享，養(yǎng)殖戶使用豬常溫精液可降低飼養(yǎng)成本，阻斷引種造成的傳染性疾病傳播，減輕防疫工作壓力，加快豬群品種改良速度，提升良種覆蓋率，大幅提高養(yǎng)殖收益[15-16]。對豬常溫精液精子畸形率等各項指標(biāo)進(jìn)行檢測分析可為優(yōu)秀種質(zhì)資源的篩選和使用提供依據(jù)，把好質(zhì)量關(guān)，對增加養(yǎng)殖效益、推動養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重大的作用。此外，為驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度也可定期將樣本送至其他具有檢測資質(zhì)的實驗室進(jìn)行檢測結(jié)果的比對、分析[7]，查找差距以提高自身檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究中精子畸形率的檢測設(shè)備為生物投影顯微鏡，經(jīng)檢測后產(chǎn)生的不確定度分量對精子畸形率檢測的準(zhǔn)確度影響較小。精子著色的深淺由配制吉姆薩染色液濃度的準(zhǔn)確性影響，配制染色液的濃度準(zhǔn)確性不會對精子畸形率產(chǎn)生影響。實驗室檢測精子畸形率是在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，檢驗人員在制樣和固定、鏡檢過程中的操作對精子畸形率測定結(jié)果具有決定性作用，對精子畸形率的不確定度分量的影響較大。

綜上所述，在今后的實驗室質(zhì)量監(jiān)控活動中，應(yīng)加強(qiáng)人員技術(shù)評比以及對相關(guān)理論知識的學(xué)習(xí)，提高技術(shù)人員試驗操作過程的熟練程度，多進(jìn)行崗位練兵，以達(dá)到提高檢測精子畸形率準(zhǔn)確度的目的，也可增加檢測次數(shù)提高檢測結(jié)果的可靠性。實驗室在選擇生物投影顯微鏡時要多進(jìn)行比較，以減少試驗設(shè)備對試驗結(jié)果的影響。