固氮菌Azotobacter salinestris 代謝物脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

付振艷 排孜麗亞·帕爾哈提 寧慧霞 牛立濤 熱合巴提·努爾夏提 排合爾丁·穆太力甫 阿布力米提·伊力

摘要 ?［目的］探究固氮菌Azotobacter salinestris（As101）代謝物脂肪酸組成及抗氧化活性。［方法］采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS）進行脂肪酸組成分析；根據(jù)2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽 （ABTS）自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羥基自由基清除能力測定抗氧化活性。［結(jié)果］固氮菌As101代謝物脂溶性成分中棕櫚酸甲酯（11.34%）、鄰苯二甲酸二丁酯（7.41%）、順9，10-甲基十九烷酸甲酯（18.71%）、硬脂酸甲酯（3.08%）、12-甲基十四烷酸甲酯（8.02%）為主要成分，其次為油酸甲酯（5.01%）、（Z）-十六烯酸甲酯（3.44%）、14-甲基十六烷酸甲酯（1.67%）等。其中，不飽和脂肪酸達43.78%；固氮菌As101代謝物脂肪酸對DPPH自由基、ABTS自由基及羥基自由基的清除能力分別為53.05%、27.83%、43.77%。［結(jié)論］As101代謝物脂肪酸種類豐富，具有良好的開發(fā)利用價值及廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 ?固氮菌；代謝物；脂肪酸；GC/MS；抗氧化活性

中圖分類號 ?Q 939.11+3 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0172-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.039

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Fatty Acid Analysis and Antioxidant Activity of Metabolites of Azotobacter salinestris

FU Zhen-yan1，Paziliya·Paerhati1，2，NING Hui-xia1 et al

（1.State Key Laboratory Basis of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization/Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi，Xinjiang 830011;2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039）

Abstract ?［Objective］The fatty acid composition and antioxidant activity of metabolites of Azotobacter salinestris （As101） were studied.［Method］The composition of fatty acids was analyzed by GC/MS;The antioxidant activity was determined according to the scavenging ability of 2，2-diazo-bis （3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid） diammonium salt （ABTS），1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and hydroxyl radical.［Result］Palmitic acid （11.34%），phthalic acid （7.41%），cis-9，10-methyloctadecanoic acid （18.71%），stearic acid （3.08%），12 methyltetradecanoic acid （8.02%） were the main components of the fat soluble metabolites of Azotobacter As101，followed by oleic acid （5.01%），（z） -hexadecenic acid （1.44%），14 methylhexadecanoic acid （1.67%）.Among them，unsaturated fatty acids reached 43.78%;the scavenging abilities of fatty acids of metabolites of nitrogen fixing bacteria AS101 to DPPH radical，ABTS radical and hydroxyl radical were 53.05%，27.83% and 43.77% respectively.［Conclusion］As101 metabolites are rich in fatty acids，which have good development and utilization value and broad application prospects.

Key words ?Azotobacter;Metabolite;Fatty acid;GC/MS;Antioxidant activity

脂肪酸是生物體的代謝產(chǎn)物成分之一，是其不可缺少的能量和營養(yǎng)物質(zhì)。其中，飽和脂肪酸（SFA）對人體有提供能量、抑制腫瘤病毒生長等功能［1-3］，不飽和脂肪酸中的單不飽和脂肪酸（MUFA）具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂和保護心血管［4］等作用，多不飽和脂肪酸（PUFA）具有維護神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)、預(yù)防心腦血管疾病和對抗肥胖等生理功能［5-8］。固氮菌是一種有機營養(yǎng)型細菌。菌體桿狀、卵圓形或球形，能固定空氣中的氮。氮是植物生長不可缺少的物質(zhì)，是合成蛋白質(zhì)的主要來源［9-10］。固氮菌擅長從空氣中固定氮，它們能把空氣中植物無法吸收的氮氣轉(zhuǎn)化成氮肥，源源不斷地供給植物生長［11］。現(xiàn)代微生物學(xué)研究表明，細菌的細胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細菌的 DNA 具有高度同源性，不同種屬的細菌，其脂肪酸的組成和含量表現(xiàn)出不同程度的差異，并且這種差異比較穩(wěn)定，各種細菌具有其特征性的細胞脂肪酸指紋圖譜［12］。截至目前，國內(nèi)外對固氮類細菌代謝物脂肪酸成分研究的報道甚少，固氮類細菌代謝物脂肪酸缺乏系統(tǒng)研究。筆者運用GC/MS技術(shù)對固氮菌Azotobacter salinestris（As101）代謝物的脂肪酸成分進行系統(tǒng)性分析，并對其抗氧化活性進行評價，為挖掘固氮類細菌代謝物脂肪酸在醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的潛在價值，以及為細菌指紋圖譜分析與鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ???研究對象。新疆烏魯木齊市鹽湖景區(qū)（海拔1 009 m，地理坐標88.138 445 2°E、43.380 997 4°N）。

1.1.2 ???主要試劑。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（北京索萊寶生物科技有限公司）；石油醚、甲苯、氫氧化鉀、無水硫酸鈉、無水乙醇、甘露醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鈣、酵母提取物、氯化鐵、鉬酸鈉、葡萄糖、氯化鈉、碳酸鈣，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 ???培養(yǎng)基。Ashby培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鈣0.2 g，碳酸鈣5.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2，115 ℃，滅菌30 min；固氮培養(yǎng)基：甘露醇20.0 g，磷酸二氫鉀0.2 g，磷酸氫二鉀0.8 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸鈣0.1 g， 酵母提取物0.5 g，氯化鐵（微量），鉬酸鈉（微量），蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2，121 ℃，滅菌20 min。

1.1.4 ???儀器與設(shè)備。7890A-5975C 氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國 Agilent 公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZHWY-2102C），F(xiàn)-305 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士 BUCHI 公司），NICOLET 6700 紅外光譜儀（美國 Thermo 公司），HH2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州華峰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ???土壤固氮菌As101的活化及發(fā)酵代謝物制備。試驗用土壤固氮菌（Azotobacter salinestris，As101）是新疆特有藥用資源利用省部共建重點實驗室分離鑒定保存的菌株（Genbank登錄號：OK445517）。從-80 ℃冰箱保藏菌株的甘油管中挑取1環(huán)固氮菌As101菌液，劃線到Ashby固體培養(yǎng)基中，倒置37 ℃暗培養(yǎng)，2～3 d長出單克隆，挑取單克隆接到液體固氮培養(yǎng)基進行活化，溫度33 ℃，轉(zhuǎn)速160 min/r，培養(yǎng)時間48 h（對數(shù)生長期）；再以5%接種量接種于液體固氮培養(yǎng)基進行發(fā)酵，溫度33 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)時間120 h，獲得固氮菌As101發(fā)酵代謝物。

1.2.2 ???As101代謝物脂肪酸樣品制備。經(jīng) “1.2.1” 中獲得的固氮菌As101發(fā)酵代謝物，7 000 r/min離心10 min去除菌體，將上清液濃縮為原體積的1/3，以石油醚為提取溶劑，按1 ∶ 1比例與濃縮上清液混勻攪拌2 h，分液漏斗靜置1 h，重復(fù)3次。收集3次的上層液，濃縮，40 ℃烘干24 h，稱重，獲得固氮菌 As101代謝物脂肪酸樣品。

1.2.3 ???脂肪酸甲酯化。精確稱取經(jīng) “1.2.2” 中制備的固氮菌 As101代謝物脂肪酸樣品100 mg，溶解在石油醚和甲苯比例為1 ∶1的混合物（2 mL）中，加入2 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液，攪拌混勻，在室溫下靜置20 min，加入蒸餾水，使其靜置分層。澄清后取上清液，用無水硫酸鈉干燥，用微孔濾膜過濾后供GC-MS分析［13］。

1.2.4 ???GC-MS分析。甲酯化后的脂肪酸在配備有質(zhì)譜檢測器 （5975C配備安捷倫三軸檢測器）的安捷倫7890 A 氣相色譜儀上進行分析。操作條件如下：色譜柱（30 m×0.25 μm×0.25 μm），初始溫度為50 ℃；以10 ℃/min加熱至220 ℃，以5 ℃/min加熱至250 ℃，最后以10 ℃/min加熱至300 ℃，并保持10 min。載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進樣口溫度為300 ℃，取樣體積為0.2 μL，分流比為50 ∶1。電離方式為 EI；電離能量為 70 eV；離子源發(fā)生器溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍為 40～500 m/z，全離子掃描。通過比較NIST庫（NIST 08）獲得質(zhì)譜和標準質(zhì)譜［13］。

1.2.5 ???抗氧化活性試驗。

1.2.5.1 ???DPPH自由基清除試驗。將100 μL各濃度的脂肪酸（0.17～5.76 mg/mL）和100 μL新配置的DPPH （0.2 mol/L） 加到96孔板上。然后立即混合，37 ℃避光反應(yīng) 30 min，在波長 517 nm下測吸光度，并用以下公式計算抑制率。3次重復(fù)［13］。

DPPH自由基清除率=［1- Ai-Aj A0 ］×100%

式中，Ai為100 μL DPPH自由基溶液+100 μL樣品的吸光度；A0為100 μL DPPH自由基溶液+100 μL石油醚的吸光度；Aj為100 μL樣品+100 μL石油醚的吸光度。

1.2.5.2 ???ABTS自由基清除試驗。將50 μL不同濃度脂肪酸（0.417 5～6.680 0 mg/mL）和150 μL ABTS自由基（吸光度在0.70±0.02）混合，在室溫條件下反應(yīng)10 min后，在730 nm處測定吸光度，并用上述公式計算抑制率。每個試驗重復(fù)3次［13］。

1.2.5.3 ???羥基自由基（OH+）清除試驗。分別取不同濃度脂肪酸（0.417 5～6.680 0 mg/mL）于試管中，各管加入800 μL硫酸亞鐵（避光）6 mmol/L和800 μL水楊酸6 mmol/L，搖勻后各管加入0.1 % H2O2 50 μL混勻，37 ℃水浴30 min，以石油醚為空白對照，510 nm處測定各反應(yīng)吸光度并按上述公式計算清除率［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸含量 ???固氮菌As101代謝物脂溶性成分提取量為3.6 mg/L。固氮菌As101代謝物脂肪酸甲脂總離子GC/MS流如圖1所示，GC-MS結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST08）檢索，與標準譜圖進行比對分析，細菌As101代謝物脂溶性成分的脂肪酸組成按峰面積歸一化計算各峰面積的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可知，固氮菌As101代謝物脂溶性成分中順9，10-甲基十九烷酸甲酯（18.71%）、棕櫚酸甲酯（11.34%）、12-甲基十四烷酸甲酯（8.02%）、鄰苯二甲酸二丁酯（7.41%）、油酸甲酯（5.01%）是主要成分。其中，不飽和脂肪酸達43.78%。

2.2 ?抗氧化活性 ???固氮菌As101代謝物脂肪酸提取物的抗氧化活性通過檢測ABTS、DPPH自由基和羥基自由基清除能力進行評價。如圖2所示，在檢測濃度范圍內(nèi)，陽性對照VC和固氮菌As101代謝物脂溶性成分清除ABTS自由基能力均隨濃度的增大而增強，表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。在檢測濃度范圍內(nèi)，陽性對照VC的ABTS自由基清除率在70%以上，強于固氮菌As101代謝物脂溶性成分。對于固氮菌As101代謝物脂肪酸提取物，當(dāng)濃度達到4.174 mg/mL時，ABTS清除率達到27.83%，表現(xiàn)出很強的清除ABTS自由基的活性。

從圖3可見，固氮菌As101代謝物脂溶性成分和VC溶液對DPPH自由基的清除能力均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且VC的清除能力高于固氮菌As101代謝物脂溶性成分。當(dāng)固氮菌As101代謝物脂溶性成分濃度大于0.72 mg/mL時，清除率增長快速，當(dāng)濃度達到5.76 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到53.05%，表現(xiàn)出較好的清除活性。

羥基自由基去除能力是衡量天然化合物抗氧化活性的重要指標。如圖4所示，固氮菌As101代謝物脂溶性成分和VC溶液對羥基自由基的清除活性均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，且VC的清除活性高于固氮菌As101代謝物脂溶性成分。固氮菌As101代謝物脂溶性成分呈現(xiàn)較好的羥基自由基清除能力；當(dāng)濃度為4 mg/mL時，細菌As101代謝物脂溶性成分的還原能力為43.77%。

3 討論與結(jié)論

該研究對新疆烏魯木齊市鹽湖景區(qū)土樣中分離到的固氮菌代謝物脂溶性成分進行分析并進行了抗氧化活性研究。分析結(jié)果表明，在液體固氮培養(yǎng)基上，固氮菌As101在pH 7、溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵120 h條件下的代謝物脂溶性成分組分來看，不飽和脂肪酸順9，10-甲基十九烷酸甲酯含量最高，其次依次為棕櫚酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯。這與陳拾旸等［14］報道的雙歧桿菌代謝產(chǎn)物脂肪酸構(gòu)成，甘永琦等［15］報道的乳酶生菌種脂肪酸組分以及紀曉玲等［16］報道的1株四合木鏈格孢發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組分有很大的區(qū)別。大多數(shù)微生物代謝物中棕櫚酸的含量相對高。陳拾旸等［14］的報道中飽和脂肪酸棕櫚酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、二十四烷酸（C24：0）為５株雙歧桿菌代謝產(chǎn)物及細胞中的主要脂肪酸；紀曉玲等［16］的報道中四合木鏈格孢發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸組分中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的63.04%，其中油酸和亞麻酸的含量較高。出現(xiàn)這種差異的原因可能有2個方面： ①各報道中采用的菌株不同，不同種菌株之間脂肪酸存在差異;②細胞組成與生長階段、培養(yǎng)基成分、溫度等因素有關(guān)，作為細胞膜重要組成成分的脂類也會受到影響［17］。前者研究中使用的是雙歧桿菌BS、MRS和馬鈴薯葡萄糖（PDA）3種培養(yǎng)基，而該試驗中使用的是固氮培養(yǎng)基；另外，前者報道中的氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析條件也不同。細菌代謝物脂肪酸的組成受到很多因素的影響，因此在分析脂肪酸時，需要對培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、氣相前處理條件等因素進行標準化，否則會影響測定結(jié)果的準確性和重復(fù)性。該研究含量最高的不飽和脂肪酸順9，10-甲基十九烷酸甲酯相關(guān)報道甚少，有待更進一步研究。

健康的食品供應(yīng)和有效的藥物生產(chǎn)對人體免疫系統(tǒng)有直接影響。鑒于全球日益嚴峻的環(huán)境和健康挑戰(zhàn)，找到不同的解決辦法來改善食品供應(yīng)和藥品有效性，特別是找到具有高抗氧化活性的脂肪酸對藥品生產(chǎn)和食品供應(yīng)具有重要影響。鑒于此，筆者進行了固氮菌As101代謝物脂溶性成分抗氧化活性研究。脂肪酸成分抗氧化活性研究中，董強等［18］報道的鷹嘴豆脂肪酸中不飽和脂肪酸含量達87.79%～90.56%，脂肪酸DPPH自由基去除能力70%；趙海軍等［19］報道，牡丹籽油脂肪酸成分中不飽和脂肪酸含量達80.55%～92.12%，脂肪酸DPPH自由基去除能力60.82%～95.68%?？梢钥闯觯伙柡椭舅岷吭礁?，脂肪酸抗氧化活性就越高。雖然VC溶液對羥基自由基的清除活性均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，清除活性高于固氮菌As101代謝物脂溶性成分，但隨濃度的升高，其變化趨勢增加平緩，而固氮菌As101代謝物脂溶性成分清除自由基能力隨濃度增加表現(xiàn)出“強拐點”，呈強線性特征，如固氮菌As101代謝物脂溶性成分清除DPPH自由基的能力可為今后挖掘高效抗氧化物質(zhì)提供參考。

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