2017至2019年上海和湖南兩醫(yī)院耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)研究

丁興偉 韓逸青 王暉 李榮

具有廣譜和抗菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物,如美羅培南、亞胺培南和厄他培南,是治療大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等革蘭陰性菌引起感染最有效的抗生素之一,這類(lèi)細(xì)菌約占臨床分離株的70%以上。革蘭陰性菌廣泛分布于自然界,也存在于人的上呼吸道和腸道[1]。同時(shí)碳青霉烯類(lèi)亦可囊括大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌及厭氧細(xì)菌,是臨床治療耐藥細(xì)菌導(dǎo)致感染的首選藥物之一,也是治療耐藥肺炎克雷伯菌等,根據(jù)CHINET耐藥數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)顯示,耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的檢出率正在逐年提高,使得碳青霉烯類(lèi)抗生素的總體臨床治療有效性正在下降[2]。本文通過(guò)醫(yī)院HIS信息系統(tǒng),提取2017至2019年醫(yī)院碳青霉烯類(lèi)(美羅培南)的使用強(qiáng)度數(shù)據(jù),對(duì)比2017至2019年從住院患者標(biāo)本中分離得到的肺炎克雷伯菌的耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),分析差異。使用PCR方法擴(kuò)增分離出的CRKP的碳青霉烯相關(guān)基因,通過(guò)用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis,AGE)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)了解耐藥基因分布和同源性。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)由上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院和南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院、檢驗(yàn)科微生物室提供,為2017至2019年從住院患者標(biāo)本中分離得到的肺炎克雷伯菌。通過(guò)醫(yī)院HIS信息系統(tǒng),提取2017至2019年該院碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的使用數(shù)據(jù)。同時(shí)收集2019年6～12月的耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌的耐藥菌株,其中來(lái)自上海普陀區(qū)人民醫(yī)院的CRKP共19株,來(lái)自南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院CRKP 共17株,作耐藥基因分析,剔除同一患者同一部位分離的重復(fù)菌株。

1.2 主要試劑

1.2.1 儀器與設(shè)備：法國(guó)生物梅里埃生物公司BacT/Alert 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀、VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和相應(yīng)鑒定卡。

1.2.2 藥敏紙片：①涉及藥物包括阿米卡星、多粘菌素B、厄他培南、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、磷霉素、美羅培南、米諾環(huán)素、慶大霉素、替加環(huán)素、替卡西林/克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢呋辛、頭孢美唑、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢唑林、亞胺培南和左氧氟沙星,共20種均購(gòu)自O(shè)XOID公司。②參照2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (CLSI)推薦的藥敏試驗(yàn)方法及折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂二倍稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。取145 μl加入3 ml做卡的藥敏,被試菌懸液用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液,在管壁上擠壓去掉多余菌液,菌懸液濃度為0.50～0.63。測(cè)定抗菌藥物對(duì)致病菌的MIC。

1.3 耐藥基因檢測(cè)方法 設(shè)計(jì)PCR引物,并使用PCR擴(kuò)增以下肺炎克雷伯菌耐藥相關(guān)基因：blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaSIM-1、blaSPM、blaGIM、blaNDM-1、blaOXA-48、blaCTX-M-1-group、blaCTX-M-9-group、blaCTX-M-2-group、blaCTX-M-8-group、blaSHV和blaTEM。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示,比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩家醫(yī)院檢出肺炎克雷伯菌標(biāo)本來(lái)源比較 2017年兩家醫(yī)院檢出肺炎克雷伯菌標(biāo)本來(lái)源不同(χ2=7.1368,P=0.0076),兩兩比較,其痰、尿液和血液占比不同。2018年兩家醫(yī)院檢出肺炎克雷伯菌標(biāo)本來(lái)源不同(χ2=53.3908,P<0.0001),兩兩比較,其痰、尿液和血液占比不同。2019年兩家醫(yī)院檢出肺炎克雷伯菌標(biāo)本來(lái)源不同(χ2=17.8595,P<0.0001),兩兩比較,其痰、尿液和血液占比不同。見(jiàn)表1。

表1 兩家醫(yī)院檢出肺炎克雷伯菌標(biāo)本來(lái)源比較 份(%)

2.2 2019年CRKP的科室分布比較 兩家醫(yī)院來(lái)源均以神經(jīng)外科、ICU、呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科、急診醫(yī)學(xué)科等為最多。兩家醫(yī)院2019年度CRKP的科室來(lái)源差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2019年CRKP的科室分布比較 例(%)

2.3 兩家醫(yī)院肺炎克雷伯菌耐藥率比較 兩家醫(yī)院肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素頭孢呋辛的耐藥率為最高,對(duì)抗生素亞胺培南和阿米卡星的耐藥率比較低,湖南省某三甲醫(yī)院的各藥物耐藥性方面的數(shù)據(jù)數(shù)值低于上海市某二甲醫(yī)院,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩家醫(yī)院肺炎克雷伯菌耐藥率比較 %

2.4 耐藥基因檢出情況 兩家醫(yī)院均未檢出blaOXA-48、CTX-M-2-group。部分耐藥基因擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳。見(jiàn)表4,圖1、2。

圖1 blaSPM擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳;M DNA marker;1,3陽(yáng)性標(biāo)本;2,4陰性標(biāo)本

圖2 blaCTX-M-2-group擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳;M DNA marker;

表4 CRKP耐藥基因檢出情況 株(%)

1～7陰性標(biāo)本

2.5 耐藥菌藥敏結(jié)果

2.5.1 湖南省某三甲醫(yī)院分離出的17株CRKP對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢吡肟、頭孢呋辛、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢唑林和亞胺培南的耐藥率為100%,對(duì)阿米卡星、慶大霉素和美羅培南的耐藥率為91.3%,對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率為78.3%,對(duì)氯霉素的耐藥率為34.8%,對(duì)呋喃妥因的耐藥率為26.1%(中介為8.7%),對(duì)美滿(mǎn)霉素的耐藥率為17.4%(中介為26.1%),對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為13.0%,對(duì)多粘菌素-B不耐藥。見(jiàn)表5。

表5 湖南省某三甲醫(yī)院分離出來(lái)的17株CRKP耐藥情況

2.5.2 上海市某二甲醫(yī)院分離出來(lái)的19株CRKP對(duì)阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢呋辛、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁、亞胺培南、左氧氟沙星的耐藥率為100%,對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率為65%,對(duì)粘菌素的耐藥率為15%,對(duì)替加環(huán)素的耐藥率為5%(中介為20%)。見(jiàn)表6。

表6 上海市某二甲醫(yī)院分離出來(lái)的19株CRKP耐藥情況

2.6 肺炎克雷伯菌的同源性 上海結(jié)果主要為ST11、ST15,其中18株ST11,1株ST15。湖南結(jié)果主要為ST11,ST571,ST660,ST2237和ST1074。其中2株ST571,12株ST11,其余ST型各1株。見(jiàn)表7。

表7 CRKP耐藥基因MLST分型情況

3 討論

2013年,美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)將耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌列為最高級(jí)別的“緊迫威脅”[3]。2017年,中國(guó)CHINET細(xì)菌抗藥檢測(cè)報(bào)告顯示,肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南的耐藥率高達(dá)23.1%,對(duì)亞胺培南的耐藥率高達(dá)20.0%[4]。感染患者一旦檢出耐碳青霉烯細(xì)菌,抗菌藥物的選擇極為有限,病死率高,醫(yī)療投入大,而且碳青霉烯耐藥菌可在醫(yī)院和社區(qū)內(nèi)造成快速傳播,因此CRKP已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。CRKP感染患者病情危重,在抗菌素治療上選擇卻極其有限,并且不同地區(qū)由于環(huán)境、生活等差異性,CRKP感染以及治療情況也會(huì)有所差異[5]。自1997年MacKenzie等首次報(bào)道CRKP以來(lái),全球許多地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了CRKP的報(bào)道[6],引起了臨床的廣泛關(guān)注。腸桿菌科是臨床實(shí)踐中最常見(jiàn)的條件致病菌,常引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染。肺炎克雷伯菌是臨床上常見(jiàn)的革蘭陰性細(xì)菌,是引起肺炎、尿道感染、腹部感染甚至膿毒癥的重要病原體之一[4]。大約1/2以上的敗血癥和70%以上的泌尿系統(tǒng)感染是由腸桿菌科細(xì)菌引起的。

抗菌藥物是對(duì)抗細(xì)菌感染的有效手段。細(xì)菌耐藥性是一個(gè)世界性的問(wèn)題,作為一種自然現(xiàn)象,細(xì)菌耐藥性是數(shù)千年微生物進(jìn)化的結(jié)果。細(xì)菌耐藥性是進(jìn)化選擇的結(jié)果,抗生素的濫用也加強(qiáng)了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。在細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中,耐藥基因會(huì)發(fā)生突變。在抗生素的壓力下,耐藥細(xì)菌將被消滅[7]。細(xì)菌耐藥性的發(fā)展降低或剝奪了抗生素的有效治療效果,增加了患者的治療難度和醫(yī)療成本。細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,因此人類(lèi)對(duì)抗細(xì)菌的有效武器越來(lái)越少。耐藥細(xì)菌和易感細(xì)菌在致病性上幾乎沒(méi)有區(qū)別。獲得耐藥性的細(xì)菌不會(huì)改變其致病性,通常不會(huì)產(chǎn)生新的感染類(lèi)型[8]。主要問(wèn)題是,當(dāng)細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性時(shí),它們很難治療,感染者的有效治愈率降低,病死率上升,醫(yī)療成本大幅上升。

本研究中,2017至2019年兩醫(yī)院檢出肺炎克雷伯菌標(biāo)本來(lái)源不同(χ2=7.1368,P=0.0076)。兩家醫(yī)院肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢呋辛的耐藥率最高,對(duì)米諾環(huán)素和多粘菌素B的耐藥率最低。CRKP的來(lái)源均以神經(jīng)外科、ICU、呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科、急診醫(yī)學(xué)科為最多,其科室來(lái)源均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本研究表明,碳青霉稀類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌感染患者一般為高齡,伴有較多基礎(chǔ)疾病,且病情危重,常有多種抗菌藥物治療史,接受有創(chuàng)性治療等多種危險(xiǎn)因素。而患者預(yù)后情況與多種危險(xiǎn)因素和治療相關(guān)。體外藥敏顯示,對(duì)多種抗生素耐藥率較高,僅對(duì)多粘菌素和替加環(huán)素有較好的敏感性。腸桿菌科是生活在人類(lèi)腸道內(nèi)的需氧或兼性厭氧的革蘭陰性桿菌,大多數(shù)是人類(lèi)腸道內(nèi)的正常菌群,廣泛分布于自然環(huán)境中[9]。它是臨床最常見(jiàn)的病原致病菌,既可引起社區(qū)獲得性感染,也可引起醫(yī)院內(nèi)感染。碳青霉烯是一種具有廣泛抗菌譜和強(qiáng)抗菌活性的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,被認(rèn)為是治療耐多藥革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線[10]。然而,近年來(lái),廣譜抗生素的使用不當(dāng)和過(guò)度使用在臨床實(shí)踐中均出現(xiàn)了碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的產(chǎn)生[11],且其耐藥率全世界一直在增加。中國(guó)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)在2017年表明,腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥率已達(dá)10%,其中肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥率高達(dá)20.9%和24.0%[12]。患者一旦感染CRE,抗菌藥物的選擇極為有限,病死率高,醫(yī)療投人大,而且CRE可在醫(yī)院和社區(qū)內(nèi)造成快速傳播,因此成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內(nèi)引起肺炎、尿道或腹腔感染及敗血癥的重要致病菌[13]。2014年的CHINET報(bào)道,肺炎克雷伯菌的臨床分離率僅次于大腸埃希菌,位列所有細(xì)菌的第二位,且耐藥的問(wèn)題日益嚴(yán)峻[14]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,CRKP對(duì)多黏菌素、復(fù)方磺胺、替加環(huán)素和阿米卡星有一定敏感率[15]。2005至2014年中國(guó)CHINET克雷伯菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示,CRKP株對(duì)絕大多數(shù)抗菌藥物耐藥率均在60%以上,僅對(duì)替加環(huán)素、阿米卡星和復(fù)方磺胺等敏感,敏感率分別為76.9%,44.5%和41.5%[16]。

兩家醫(yī)院在各藥物耐藥性方面的數(shù)據(jù),湖南省某三甲醫(yī)院的數(shù)值低于上海市某二甲醫(yī)院(P<0.05)。通過(guò)PCR擴(kuò)增收集的36株耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的肺炎克雷伯菌相關(guān)基因,結(jié)果顯示兩家醫(yī)院均未檢出blaOXA-48、CTX-M-2-group。通過(guò)MLST進(jìn)行分型上海某二甲醫(yī)院主要流行ST11、ST15等類(lèi)型,湖南省某三甲醫(yī)院主要流行ST11、ST571、ST660、ST2237和ST1074等類(lèi)型。NDM-1是一種新型的金屬β-內(nèi)酰胺酶,它能使細(xì)菌對(duì)包括碳烯類(lèi)在內(nèi)的多種抗生素產(chǎn)生高度耐藥性,且其編碼基因可以通過(guò)質(zhì)粒在不同種類(lèi)的細(xì)菌之間快速傳播。雖然中國(guó)沒(méi)有爆發(fā)導(dǎo)致肺炎克雷伯菌的NDM-1疫情,但仍需要高度監(jiān)測(cè)。一些對(duì)多個(gè)國(guó)家產(chǎn)生NDM-1肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)分析,研究發(fā)現(xiàn)ST11和NDM-1和傳播和流行有密切的關(guān)系[13]。CC258菌株攜帶可促進(jìn)攜帶菌株在全球傳播的蛋白,這些蛋白與運(yùn)動(dòng)、分泌和DNA修復(fù)等過(guò)程密切相關(guān)。ST571與ST11對(duì)比,發(fā)現(xiàn)7個(gè)管家基因型完全不同,同源性較低,表明ST571與ST11這兩個(gè)克隆的遺傳背景非常不同。NDM-1肺炎克雷伯菌的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)資料顯示,ST571和ST11屬于遠(yuǎn)親的關(guān)系,所以ST571由醫(yī)院感染君主突變而來(lái)的可能性較低。ST571型肺炎克雷伯菌作為一種新的ST型,被確認(rèn)來(lái)源于印度,攜帶有印度家庭NDM-1基因[17]。除此外以外,也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SMART菌攜帶有SHV-12、CTX-M-15等ESBL基因。本研究中我們將此2個(gè)菌株均攜帶有TEM基因,但CTX陰性,SHV陽(yáng)性。猜想可能是由于耐藥基因的轉(zhuǎn)移的原因?qū)е隆?/p>

ST11可能是全球流行期間產(chǎn)生KPC酶的下一種主要肺炎克雷伯菌。ST15曾被報(bào)道與產(chǎn)CTX-M-15酶的肺炎克雷伯菌在匈牙利播散流行相關(guān)。ST660、ST2237和ST1074在文獻(xiàn)報(bào)道中很少[18]。通過(guò)MLST分型可以確認(rèn)菌株的同源性,也可以分子流行病毒株學(xué)信息對(duì)不同區(qū)域的菌株之間進(jìn)行。MLST具有標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫(kù),不同的等位基因信息可以通過(guò)全球標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行展示,也可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)對(duì)不同地區(qū)的數(shù)據(jù)進(jìn)行橫向?qū)Ρ?還可以使用該軟件相關(guān)后續(xù)追蹤特定菌株。同時(shí),結(jié)合其他分子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了碳青霉烯耐藥具有一定的地理特征,提出了對(duì)細(xì)菌藥物耐藥譜、耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)的局部研究是必要的,為合理的臨床選擇抗菌素,預(yù)防和控制醫(yī)院感染暴發(fā)提供數(shù)據(jù)支持、指導(dǎo)。

綜上所述,醫(yī)護(hù)人員應(yīng)當(dāng)針對(duì)肺炎克雷伯菌感染的高發(fā)病區(qū)和易傳染人群,密切關(guān)注動(dòng)態(tài),禁止濫用抗菌藥物,降低耐藥性。同時(shí),以神經(jīng)外科、ICU、呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科、急診醫(yī)學(xué)科為主的臨床科室,應(yīng)當(dāng)盡量選擇窄譜抗菌藥物,避免使用氨芐西林、替卡西林和頭孢呋辛等明顯誘酶的藥物,減緩耐藥菌的產(chǎn)生。