LncRNA KCNQ1OT1調(diào)控miR-10a-5p加重缺氧復(fù)氧H9c2細胞損傷的機制

程濤 趙沱 楊潔

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的病情發(fā)展迅速,死亡率高[1]。臨床上首選經(jīng)皮冠狀動脈介入法治療,常伴隨心肌缺血再灌注損傷[2]。缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是人體許多疾病的一種重要病理過程,尤其是心肌梗死[3]。長非編碼RNA(LncRNAs)為長度>200個核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄本,其與各種生物過程密切相關(guān),如細胞生長、分化、增殖和凋亡[4]。研究表明LncRNAs可以調(diào)節(jié)多種心血管疾病的病理生理過程,包括心肌梗死、心力衰竭[5]。LncRNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄本1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)在糖尿病心肌病、心肌梗死、缺血再灌注心肌損傷中表達均異常上調(diào),不利于細胞的存活[6,7]。本研究探討KCNQ1OT1調(diào)控缺氧復(fù)氧(hypoxia reoxygenation,H/R)心肌細胞增殖、凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2細胞購自中國(上海)科學(xué)研究院細胞庫;EMDM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青;LipofectamineTM3000試劑購自中國賽默飛世爾科技;細胞計數(shù)試劑盒(CCK8)購自日本同仁;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生物;RⅡPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物;兔抗P65單克隆抗體、兔抗PHB多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自上海艾博抗體;ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京普利萊基因生物;RNA提取液Trizol購自美國Invitrogen公司;實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購自北京天根生物;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翌圣生物;所有引物的設(shè)計合成及antagomiRNA、antagomiR-10a-5p、agomiRNA、agomiR-10a-5p的設(shè)計合成均委托上海吉瑪完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：H9c2細胞用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),隔天更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 轉(zhuǎn)染與分組：正常培養(yǎng)的H9c2細胞設(shè)為H9c2組;將H9c2細胞常規(guī)培養(yǎng)12 h,更換至5%CO2、95%N2的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h,再復(fù)氧常規(guī)氣體培養(yǎng)6 h,設(shè)為H/R H9c2組;使用LipofectamineTM3000試劑將pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-KCNQ1OT1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-KCNQ1OT1)、antagomiRNA組(轉(zhuǎn)染antagomiRNA)、antagomiR-10a-5p組(轉(zhuǎn)染antagomiR-10a-5p)、pcDNA-KCNQ1OT1+agomiRNA組(共轉(zhuǎn)染pcDNA-KCNQ1OT1和agomiRNA)、pcDNA-KCNQ1OT1+agomiR-10a-5p組(共轉(zhuǎn)染pcDNA-KCNQ1OT1和agomiR-10a-5p)按照1∶5加入轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染12 h,進行缺氧復(fù)氧培養(yǎng)。RT-qPCR實驗確定轉(zhuǎn)染的效率,成功后方用于后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK8實驗：收集細胞,用細胞培養(yǎng)液調(diào)整至5×104個/μl。取200 μl至96孔板,加入CCK溶液20 μl,震蕩混勻,避光孵育20 min。酶標(biāo)儀上490 nm波長下檢測吸光度(OD490)。細胞活性=OD490實驗組/ OD490 對照組×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)實驗：收集細胞,PBS洗滌4次,用500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞。取出Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒中的Annexin V-FITC、PI,按照說明書使用方法要求操作,加入5 μl的 Annexin V-FITC和5 μl的PI避光孵育20 min。用流式細胞儀檢測分析細胞的凋亡情況。細胞總凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.5 Western blot實驗：將細胞用裂解緩沖液收集,再加上RIPA裂解液冰上裂解30 min,提取總蛋白。用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分離。結(jié)束后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜,轉(zhuǎn)膜儀器維持在0℃。將載有蛋白的NC膜用含有3%脫脂奶粉Tris緩沖鹽水吐溫-20(TBST)封閉液,37℃封閉處理1 h。用TBST溶液充分洗膜3次,再加入稀釋過的一抗溶液,至淹沒膜,4℃冰箱孵育過夜。取出膜,同樣洗膜3次,滴加稀釋的二抗溶液,37℃孵育2 h。ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影,Quantity One 4.62圖像分析Image J軟件評價蛋白灰度。β-actin作為內(nèi)部參考,目標(biāo)條帶的灰度值與內(nèi)部參考條帶的灰度值之比表示蛋白質(zhì)的相對表達。

1.2.6 RT-qPCR實驗：收集需要檢測的細胞,Trizol液提取RNA,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以此作為模板,用RT-qPCR試劑盒檢測模板中KCNQ1OT1、miR-10a-5p的表達情況。結(jié)果以GAPDH、U6為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算KCNQ1OT1、miR-10a-5p的相對表達量。程序設(shè)置為：94℃,2 min;94℃, 30 s; 58℃, 30 s; 72℃, 30 s;2℃,2 min。共45個循環(huán)。引物信息為：KCNQ1OT1：F：5’-CGCGATCCTCCTCAGTGTTT-3’,R：5’-CATATCG CCGACCACCATGA-3’;miR-10a-5p：F：5’-CGCTACCCTGTAGATCCGAATTTGTG -3’,R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;GAPDH、U6為通用引物。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗：靶基因預(yù)測網(wǎng)站Starbase(https：//starbase)預(yù)測miR-10a-5p的靶點,發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1為其靶基因之一。合成KCNQ1OT1-WT(含有KCNQ1OT1結(jié)合位點)和KCNQ1OT1-MUT(不含有KCNQ1OT1結(jié)合位點),在插入熒光載體,構(gòu)建熒光報告基因載體。將含有KCNQ1OT1-WT和KCNQ1OT1-MUT的熒光載體與miR-NC、miR-10a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-10a-5p共轉(zhuǎn)染至H9c2。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞的熒光活性,結(jié)果以螢火蟲熒光熒光素酶的活性為內(nèi)參,海參熒光素酶的發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶的發(fā)光強度的比值表示KCNQ1OT1與miR-10a-5p的靶向結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 H/R H9c2細胞模型的建立 與H9c2組比較,H/R H9c2組細胞活性顯著降低,凋亡率顯著升高,P65、Bcl-2的相對蛋白表達顯著降低,PHB、Bax的相對蛋白表達顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖1。

圖1 H/R H9c2細胞凋亡及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A H/R H9c2細胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表1 H/R H9c2細胞的活性、凋亡及相關(guān)的蛋白的相對表達量 n=9,

2.2 KCNQ1OT1、miR-10a-5p在H/R H9c2細胞中的表達 與H9c2組比較,H/R H9c2組細胞KCNQ1OT1表達顯著升高,miR-10a-5p表達顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 KCNQ1OT1、miR-10a-5p在H/R H9c2細胞中的相對表達量 n=9,

2.3 過表達KCNQ1OT1對H/R H9c2細胞活性、凋亡的調(diào)控 與pcDNA組比較,pcDNA-KCNQ1OT1組H/R H9c2細胞KCNQ1OT1表達顯著升高,細胞活性顯著降低,凋亡率顯著升高,P65、Bcl-2的蛋白表達顯著降低,PHB、Bax的蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表3,圖2。

圖2 過表達KCNQ1OT1的H/R H9c2細胞凋亡及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A 過表達KCNQ1OT1的H/R H9c2細胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表3 過表達KCNQ1OT1的H/R H9c2細胞活性、凋亡及相關(guān)的蛋白的相對表達量 n=9,

2.4 LncRNA KCNQ1OT1靶向miR-10a-5p 通過生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站Starbase預(yù)測到KCNQ1OT1與miR-10a-5p之間存在互補的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告結(jié)果,與miR-NC組比較,miR-10a-5p組LncRNA KCNQ1OT1-WT細胞的熒光活性顯著降低(P<0.05);與miR-NC組相比,miR-10a-5p組KCNQ1OT1表達顯著降低,與anti-miR-NC組相比,anti-miR-10a-5p組KCNQ1OT1表達顯著升高(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 LncRNA KCNQ1OT1靶向miR-10a-5p

表4 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果 n=9,

2.5 抑制miR-10a-5p對H/R H9c2細胞活性、凋亡的調(diào)控 與antagomiRNA組比較,antagomiR-10a-5p組H/R H9c2細胞miR-10a-5p表達顯著降低,細胞活性顯著降低,凋亡率顯著升高,P65、Bcl-2的蛋白表達顯著降低,PHB、Bax的蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 抑制miR-10a-5p的H/R H9c2細胞凋亡圖及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A 抑制miR-10a-5p的H/R H9c2細胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表5 抑制miR-10a-5p的H/R H9c2細胞活性、凋亡及相關(guān)的蛋白的相對表達量 n=9,

2.6 過表達miR-10a-5p部分逆轉(zhuǎn)過表達KCNQ1OT1對H/R H9c2細胞活性、凋亡的調(diào)控 與pcDNA-KCNQ1OT1+agomiRNA組比較,pcDNA-KCNQ1OT1+agomiR-10a-5p組H/R H9c2中KCNQ1OT1的表達顯著降低,細胞活性顯著升高,凋亡率顯著降低,P65、Bcl-2的相對蛋白表達顯著升高,PHB、Bax的相對蛋白表達顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6,圖5。

圖5 過表達miR-10a-5p和KCNQ1OT1的H/R H9c2細胞凋亡及P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白;A 過表達miR-10a-5p和KCNQ1OT1的H/R H9c2細胞凋亡;B P65、PHB、Bcl-2、Bax的蛋白

表6 過表達miR-10a-5p和KCNQ1OT1的H/R H9c2細胞活性、凋亡及相關(guān)的蛋白的相對表達量 n=9,

3 討論

很多研究證實KCNQ1OT1在心臟疾病中具有重要作用[8,9],但是其發(fā)揮作用的機制仍在繼續(xù)探究。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn),KCNQ1OT1在急性心肌梗死區(qū)和交界區(qū)的組織中表達均顯著升高,并且抑制KCNQ1OT1可保護心肌細胞免受缺氧損傷,揭示KCNQ1OT1通過分泌miR-466k和miR-466i-5p,進而上調(diào)茶結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子1(Tead1)達到心肌細胞缺氧損傷。Li等[11]在缺血再灌注對心肌細胞損傷的研究中發(fā)現(xiàn),KCNQ1OT1的表達顯著上調(diào),抑制KCNQ1OT1可降低損傷心肌細胞炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌和凋亡,這與KCNQ1OT1抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路活性直接聯(lián)系;除此之外,KCNQ1OT1的這些功能可被敲減AdipoR1逆轉(zhuǎn),說明KCNQ1OT1還可通過上調(diào)AdipoR1預(yù)防心肌的缺血再灌注損傷。本研究成功建立了缺氧復(fù)氧H9c2細胞損傷模型,RT-qPCR實驗檢測其中KCNQ1OT1的表達,發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1顯著升高,與Zhang等[10,11]的研究結(jié)果相一致,再次驗證KCNQ1OT1參與心肌缺血再灌注損傷。為探討KCNQ1OT1在缺氧復(fù)氧H9c2細胞生存中的功能,通過轉(zhuǎn)染KCNQ1OT1建立過表達KCNQ1OT1的H9c2細胞,發(fā)現(xiàn)受損的H9c2細胞活性更低,細胞凋亡能力更強,P65、Bcl-2的表達更低,PHB、Bax的表達更高,加重H/R對H9c2的損傷,說明KCNQ1OT1在心肌損傷過程中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn),KCNQ1OT1靶向負調(diào)控miR-10a-5p,猜測miR-10a-5p可能與KCNQ1OT1損傷心肌有關(guān)。

miR-10a-5p在心血管疾病中的功能已有很多學(xué)者研究,尤其是缺血再灌注心肌損傷[12,13]。Dong等[14]通過慢病毒介導(dǎo)的體外老化hBM間充質(zhì)干細胞(MSCs)中miR-10a的上調(diào)和KLF4的下調(diào)發(fā)現(xiàn),miR-10a可通過抑制KLF4-BAX/BCL2信號通路減少缺氧誘導(dǎo)的細胞凋亡并提高老化hBM MSCs細胞的存活率;在體內(nèi),過表達miR-10a的老年人骨髓間充質(zhì)干細胞移植可促進移植干細胞存活,改善心肌梗死;過表達miR-10a的老化hBM MSCs可激活A(yù)kt并刺激血管生成因子的表達,增加缺血小鼠心臟的血管生成,揭示miR-10a可使老化hBM MSCs恢復(fù)活力,改善缺血小鼠心臟的血管生成和心臟功能。Cao等[15]報道,miR-10a-5p在H/R H9c2細胞和MI小鼠心肌中低表達,并且作為MIAT的下游靶點和EGR2的上游調(diào)控因子參與心肌細胞的凋亡、ATP含量,調(diào)節(jié)心肌梗死后心肌的損傷,揭示MIAT通過與miR-10a-5p/EGR2通路參與心肌梗死的作用機制,暗示miR-10a-5p、MIAT在心肌梗死基因靶向治療中的潛力。本研究通過檢測H/R H9c2細胞中miR-10a-5p的表達發(fā)現(xiàn),miR-10a-5p表達明顯降低,下調(diào)miR-10a-5p可加重H/R對H9c2細胞的活性抑制和凋亡促進作用,并且過表達miR-10a-5p能夠部分逆轉(zhuǎn)過表達KCNQ1OT1對H/R H9c2細胞的活性抑制、凋亡促進作用。

綜上所述,長鏈非編碼RNA KCNQ1OT1在缺氧復(fù)氧心肌細胞中高表達,可加重缺氧復(fù)氧對心肌細胞的損傷,其作用機制與靶向抑制miR-10a-5p相關(guān),為缺血再灌注心肌損傷的靶向治療奠定基礎(chǔ)。