紅景天苷調(diào)節(jié)miR-26a-5p/JAG1/Notch-1信號(hào)軸對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

蔡翔 何亞男 李伶華 邱百怡 秦宗碧

瘢痕疙瘩(keloid disease,KD)是皮膚傷口在愈合過程中過度生長的瘢痕組織,是一種特殊的病理學(xué)瘢痕,病因不明,組織學(xué)特點(diǎn)為瘢痕過度形成、成纖維細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積[1]。臨床上KD表現(xiàn)為瘢痕超出原始損傷范圍,成持續(xù)性生長腫塊,可伴有瘙癢或疼痛[2]。紅景天苷(salidroside,SAL)是從景天科景天屬植物紅景天全草或根莖中提取出的主要活性成分之一,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明SAL具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)保護(hù)等功能[3,4]。SAL對皮膚也具有保護(hù)作用,研究發(fā)現(xiàn)SAL具有抗皮膚光老化、促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合修復(fù)、治療黃褐斑、痤瘡等皮膚病等功效[5,6]。有證據(jù)表明,非編碼RNA能夠參與KD進(jìn)展,而微小RNA是一類重要的非編碼RNA,在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡中具有調(diào)控作用[7]。miR-26a-5p作為miRNA大家族的一員,是腫瘤抑制基因,具有阻斷細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn)JAG1在KD成纖維細(xì)胞中顯著高表達(dá),且是Notch的配體之一,JAG1/神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1(Notch-1)信號(hào)通路能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[8]。本研究培養(yǎng)原代HKF細(xì)胞,探究SAL通過調(diào)節(jié)miR-26a-5p/JAG1/Notch-1信號(hào)軸對HKF細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 紅景天苷(≥98%)購自于上海源葉生物有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購自海碧云天生物技術(shù)有限公司;青、鏈霉素購自Gibco公司;BCA蛋白定量試劑盒、Trizol試劑購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司;CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒、Transwell小室購自北京索萊寶生物科技有限公司;JAG1、Notch-1、GAPDH一抗及相應(yīng)二抗購自CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) KD標(biāo)本來自我院術(shù)中切除的KD組織,將KD標(biāo)本使用PBS洗滌,剪去表皮、皮下組織和脂肪等,并切成2 mm3左右小塊,采用組織塊貼壁法對HEK細(xì)胞原代培養(yǎng),置于含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,并加入青、鏈霉素,在37℃、5% 體積分?jǐn)?shù)CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待原代細(xì)胞生長至鋪滿細(xì)胞皿底部時(shí),加入PBS輕輕晃動(dòng)使組織塊脫落,加入胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。傳3代后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將細(xì)胞以5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板,孵育過夜。將HEK細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(Control組)、SAL低濃度組(SAL-L組,50 μmol/L)、SAL高濃度組(SAL-H組,100 μmol/L)、SAL高濃度+miR-NC組(SAL-H+miR-NC組)、SAL高濃度+miR-26a-5p mimics組(SAL-H+miR-26a-5p mimics組)、SAL高濃度+NC-inhibitor組(SAL-H+NC-inhibitor組)、SAL高濃度+miR-26a-5p inhibitor組(SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組)。SAL藥物濃度參考實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置。SAL-H+miR-NC組、SAL-H+miR-26a-5p mimics組、SAL-H+NC-inhibitor組和SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后加入100 μmol/L SAL進(jìn)行干預(yù)24 h。

0 h 24 h

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種在96孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染與加藥后,分別培養(yǎng)12 h和24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,用酶標(biāo)儀檢測每個(gè)孔在450 nm波長(OD450)下的光密度。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將對數(shù)生長期細(xì)胞以5×105個(gè)/孔密度接種于6孔板,按1.3進(jìn)行相應(yīng)處理后,使用100 μl移液槍吸頭在約100%匯合的細(xì)胞單層上劃痕。PBS洗滌后加入不含血清的培養(yǎng)基,24 h后在顯微鏡下拍照,用圖像分析儀測量劃痕寬度。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 調(diào)整HKF細(xì)胞密度為1×106個(gè),并接種在6孔板中,按方法1.3進(jìn)行分組與處理。培養(yǎng)48 h后消化細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基配制成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。Transwell小室置于24孔板中,分別加入20 μl 1 mg/ml的Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行包被,在上室加入200 μl細(xì)胞懸液,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl。將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h,隨后用棉簽除去室內(nèi)細(xì)胞,加入4%多聚甲醛固定20 min,加入0.1%結(jié)晶紫染色10 min,在光鏡下觀察穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡 1.3中處理過的各組細(xì)胞加入胰酶消化,離心棄去上清液收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞懸液的密度為1×106個(gè)/ml,加入70%乙醇在4℃下固定24 h,之后離心棄去上清,加入PBS洗滌2次。加入碘化丙啶(PI)試劑,在暗處避光37℃孵育30 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。另取重懸細(xì)胞,離心沉淀后加入結(jié)合緩沖液重懸,加入5 μl Annexin V-FITC試劑和10 μl PI,混勻后室溫避光孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.8 RT-qPCR法檢測細(xì)胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)1.3處理后,加入Trizol試劑用于提取細(xì)胞RNA。將提取的RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以此為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min,95℃變性20 s,60℃退火55 s,72℃延伸15 min,共循環(huán)50次。2-ΔΔCt方法計(jì)算各組細(xì)胞miR-26a-5p、JAG1、Notch-1 mRNA的表達(dá)量。見表1。

表1 引物序列設(shè)計(jì)

1.9 Western blot檢測細(xì)胞JAG1、Notch-1蛋白的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)1.3處理后,加入PIPA裂解液提取HKF細(xì)胞總蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,隨后被轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下將膜在脫脂奶粉中封閉2 h,隨后在4℃下與一抗JAG1(1∶1 000)、Notch-1(1∶1 000)孵育過夜。次日室溫下將膜與相應(yīng)二抗(1∶2 000)孵育2 h,再用TBST洗滌膜3次,加入ECL顯色劑進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參,使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-26a-5p與JAG1的靶向關(guān)系 利用TargetScan網(wǎng)站對miR-26a-5p與JAG1的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測。構(gòu)建JAG1野生型質(zhì)粒(JAG1-WT)和突變型質(zhì)粒(JAG1-MUT),將JAG1-WT和JAG1-MUT分別與miR-NC或miR-26a-5p mimic共轉(zhuǎn)染于HKF細(xì)胞,48 h后檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 7組HKF細(xì)胞增殖情況比較 7組12 h OD450值比較均無差異(P>0.05)。與Control組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞OD450值(24 h)顯著降低(P<0.05)。與SAL-L組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞OD450值(24 h)顯著降低(P<0.05)。與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細(xì)胞OD450值(24 h)顯著降低(P<0.05)。與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組細(xì)胞OD450值(24 h)顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 7組細(xì)胞增殖情況比較

2.2 7組HKF細(xì)胞遷移能力比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞遷移距離顯著降低(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細(xì)胞遷移距離顯著降低(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細(xì)胞遷移距離顯著升高(P<0.05)。見圖1,表3。

表3 7組HKF細(xì)胞遷移能力比較 n=6,μm,

2.3 7組HKF細(xì)胞侵襲能力比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組侵襲細(xì)胞減少(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組侵襲細(xì)胞減少(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組侵襲細(xì)胞增多(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 Tanswell實(shí)驗(yàn)檢測7組HKF細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色×100)

表4 7組HKF細(xì)胞侵襲能力比較 n=6,個(gè),

2.4 SAL對7組HKF細(xì)胞周期和凋亡率的影響 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05),S期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05),G2/M期無顯著性變化(P>0.05),細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05),S期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05),G2/M期無顯著性變化(P>0.05),細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05),S期細(xì)胞比例顯著增加(P <0.05),G2/M期無顯著性變化(P>0.05),細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表5,圖3、4。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HKF細(xì)胞的細(xì)胞周期變化

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HKF細(xì)胞凋亡

表5 SAL對7組HKF細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率的影響 n=6,%,

2.5 7組HKF細(xì)胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表達(dá)比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞miR-26a-5p表達(dá)顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,JAG1和Notch-1 mRNA表達(dá)顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細(xì)胞miR-26a-5p表達(dá)顯著升高,JAG1和Notch-1 mRNA表達(dá)顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細(xì)胞miR-26a-5p表達(dá)顯著降低,JAG1和Notch-1 mRNA表達(dá)顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 7組HKF細(xì)胞miR-26a-5p、JAG1和Notch-1 mRNA的表達(dá) n=6,

2.6 7組HKF細(xì)胞JAG1和Notch-1蛋白表達(dá)比較 與Control組和SAL-L組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞JAG1和Notch-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細(xì)胞JAG1和Notch-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與SAL-H+NC-inhibitor組相比,SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組HKF細(xì)胞JAG1和Notch-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表7,圖5。

圖5 Western blot檢測HKF細(xì)胞中JAG1、Notch-1蛋白表達(dá)(A Control組;B SAL-L組;C SAL-H組;D SAL-H+miR-NC組;E SAL-H+miR-26a-5p mimics組;F SAL-H+NC-inhibitor組;G SAL-H+miR-26a-5p inhibitor組)

表7 7組HKF細(xì)胞JAG1和Notch-1蛋白的表達(dá) n=6,

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果 預(yù)測得到的miR-26a-5p與JAG1的結(jié)合位點(diǎn)。與JAG1-WT和miR-NC共轉(zhuǎn)染組相比,JAG1-WT和miR-26a-5p mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與JAG1-MUT和miR-NC共轉(zhuǎn)染組相比,JAG1-MUT和miR-26a-5p mimic共轉(zhuǎn)染組的熒光酶活性變化無顯著性差異(P>0.05)。見表8,圖6。

圖6 miR-26a-5p與JAG1的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

表8 熒光素酶活性比較

3 討論

KD是良性的真皮纖維增生性腫瘤,好發(fā)于10～30歲人群,其中約有86%患者產(chǎn)生瘙癢且難以有效控制,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和心理健康[9]。臨床治療KD主要依靠外科手術(shù)或病灶內(nèi)注射類固醇藥物的方法,但其容易復(fù)發(fā),且復(fù)發(fā)后通常出現(xiàn)病情加重的現(xiàn)象,因此尋找治療KD的新型藥物與治療方法具有重要意義[10]。HKF細(xì)胞在KD的形成、病情發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中處于重要環(huán)節(jié),因其分裂能力和增殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng),易培養(yǎng),可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)的特性,是體外研究KD藥理作用和機(jī)制的常用細(xì)胞[11]。

紅景天又名薔薇紅景天,多分布于我國西藏、四川與甘肅等地,種類繁多,具有益智養(yǎng)心、補(bǔ)氣清肺、收斂止血等功效[12]。SAL作為紅景天的有效成分之一,越來越多研究者證明其具有多種藥理作用。Xu等[13]研究發(fā)現(xiàn)SAL可通過激活SIRT1抑制氧化應(yīng)激信號(hào)通路,可能成為治療銀屑病的理想候選藥物。Rong等[14]研究發(fā)現(xiàn)SAL通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人胃癌AGS細(xì)胞凋亡和自噬,為胃癌治療提供一定研究依據(jù),并提出了新的見解。李軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)SAL通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號(hào)通路,減輕了氧葡萄糖剝奪/再恢復(fù)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示,與Control組相比,SAL-H組HKF細(xì)胞增殖能力(24 h)、遷移距離、侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)、S期細(xì)胞比例顯著減少,細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加。這些結(jié)果提示SAL可能具有改善KD的作用。

miR-26a-5p是微小RNA的一種,可以調(diào)控靶基因表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。葉恒等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p可靶向下調(diào)PTEN表達(dá),調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)礦化。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-26a-5p通過靶向CTGF來減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷,減輕肺部炎癥和細(xì)胞凋亡。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-26a-5p可以抑制Wnt5a的表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞凋亡,抑制了胃癌中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲。

JAG1是細(xì)胞表面配體,主要在高度保守的Notch信號(hào)通路中發(fā)揮作用。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞生長發(fā)育、器官系統(tǒng)的代謝等過程中均發(fā)揮著重要作用[19]。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)JAG1作為致癌基因在卵巢癌的進(jìn)展和化療耐藥中起重要作用,敲低JAG1可以抑制GATA1誘導(dǎo)的Notch激活和細(xì)胞增殖。Yu等[21]研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中JAG1過表達(dá)加劇了非酒精性脂肪性肝炎小鼠的纖維化,而GAG1敲除小鼠則免受纖維化的影響。本研究結(jié)果顯示,與Control組相比,SAL-H組JAG1和Notch-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05),miR-26a-5p表達(dá)顯著增加;與SAL-H組和SAL-H+miR-NC組相比,SAL-H+miR-26a-5p mimics組HKF細(xì)胞相應(yīng)指標(biāo)變化趨勢與上述相同。與SAL-H+NC-inhibitor組相比,miR-26a-5p inhibitor減弱了SAL對HKF細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,抑制了細(xì)胞凋亡。提示過表達(dá)miR-26a-5p可能通過下調(diào)JAG1/Notch-1信號(hào)通路抑制HKF細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

綜上所述,JAG1是miR-26a-5p的靶標(biāo),SAL可能通過上調(diào)miR-26a-5p,靶向抑制JAG1/Notch-1信號(hào)軸抑制HKF細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,改善KD。說明SAL可成為治療KD的一個(gè)潛在藥物,為臨床治療研究提供新的思路與方法。