轉(zhuǎn)錄因子TWIST1干擾神經(jīng)發(fā)生對睡眠剝奪小鼠抑郁樣行為的影響

白布加甫·高娃 熱依汗古麗·阿不來提 林凱

重度抑郁癥 (major depression disease,MDD) 是一類常見的精神疾病,該病影響著大約 20%的世界人口[1]。睡眠功能障礙是抑郁癥患者的重要特征[2]。睡眠剝奪誘發(fā)抑郁樣行為的小鼠前額葉皮層與海馬體中都有檢測出結(jié)構(gòu)缺陷,伴隨著樹突棘密度與長度的降低[3]。此外,樹突棘結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化也被發(fā)現(xiàn)與小鼠抑郁樣行為表現(xiàn)密切相關(guān)[4]。因此,通過提高神經(jīng)發(fā)生途徑來提高神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性將有利于MDD治療。TWIST1 是一種高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子[5]。此外,TWIST1是一種促癌基因,通過EMT作用,促進多類癌癥侵襲,轉(zhuǎn)移與惡化。由于癌癥患者罹患抑郁癥的風(fēng)險提高[6],且TWIST1在神經(jīng)元中亦存在表達,因此,TWIST1可能與神經(jīng)元生理改變相關(guān)。一項研究表明,TWIST1 在神經(jīng)元中的高度表達是突變亨廷頓蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的重要上游介質(zhì)[7]。因此,本研究擬探索TWIST1是否通過抑制神經(jīng)發(fā)生降低神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性,造成睡眠剝奪小鼠抑郁樣行為。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 Lipofectamine 3000 試劑盒(美國Invitrogen公司,128231);5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuridinc,BrdU,美國Sigma公司,135210);Anti-mouse BrdU抗體(英國abcam公司,ab7231);Anti-mouse TWIST1、Anti-mouse Wnt3a與Anti- mouse β-catenin抗體(北京博奧森生物科技公司,bs13598、bs13832、bs13384);Alexa flour 488 Goat anti-rat IgG(H+L) (武漢三鷹生物科技公司,193822);HRP conjugated goat anti mouse/rabbit IgG(H+L)(上海碧云天生物科技公司,b183237、b277372)。懸尾測試設(shè)備、強迫游泳測試設(shè)備、曠場測試設(shè)備、Morris水迷宮設(shè)備(江蘇賽昂斯公司,SA210、SA209、SA224、SA204);倒置熒光顯微鏡(美國OLYMPUS公司,IX53);凝膠電泳裝置(美國BioRad公司,Mini-protean Tetra);膜片鉗系統(tǒng)(瑞士Axon公司,型號：MultiClamp 700B,MultiClamp 1550B);化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能生物公司,1600/1600R)。

1.2 實驗動物來源與分組 48只C57BL/6小鼠,SPF級,雌性,5周齡,體重17～19 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0002。所有小鼠入組后飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房中,控制飼養(yǎng)環(huán)境恒溫(22.0±2.0)℃,恒濕(60±5)%,自由飲食攝水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,將小鼠按數(shù)字隨機法分為對照(Con)組,對照+LV-sh TWIST1(Con+ LV-sh TWIST1)組,睡眠剝奪(SD)組,睡眠剝奪+LV-sh TWIST1(SD+ LV-sh TWIST1)組,每組12只。

1.3 實驗方法 慢病毒 shRNA (U6-MCS-Ubi-EGFP) 用于敲低小鼠內(nèi)側(cè)前額葉中 TWIST1 的表達,靶基因序列為 GCTGAGCAAGATTCAGACC,由南京金斯瑞公司設(shè)計與合成。將合成的靶基因序列核苷酸插入到慢病毒表達質(zhì)粒中,進一步使用Lipofectamine 3000 試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中。轉(zhuǎn)染72 h后,收集含重組慢病毒的培養(yǎng)基,檢測病毒滴度。取LV-shTWIST1 (1.0 × 109GC/ml),在 MCAO 前1周通過腦室內(nèi)注射到左側(cè)腦室,每只5 μl。腦室注射坐標(biāo)如下：AP∶1.9 mm; ML∶± 0.4 mm; DV∶-2.4 mm。注射完成后,注射針停留2 min,注射孔使用骨蠟覆蓋。參考文獻[8]中方法構(gòu)建睡眠剝奪模型。睡眠剝奪實驗箱中放置多個直徑3 cm,高8 cm的圓柱體金屬平臺,平臺之間間隔5 cm,箱內(nèi)注水2 cm。取睡眠剝奪組小鼠,小鼠可以在各平臺間自由移動且自由進食、飲水。由于各平臺之間存在較大間隔,小鼠進入睡眠時,會由于全身肌張力降低,節(jié)律性垂頭而跌入水中,此時小鼠受水驚嚇會蘇醒并爬上平臺,梳理皮毛,以此達到睡眠剝奪目的。模型構(gòu)建時間為連續(xù)7 d,期間換水2次/d。對照組小鼠放置在柱體平臺上,小鼠可以順利進食、飲水,但平臺底部無積水。小鼠模型構(gòu)建期間,腹腔注射BrdU 0.9%氯化鈉溶液1次/d,劑量50 mg/kg。完成睡眠剝奪模型構(gòu)建后,開展小鼠行為學(xué)測試,包括糖水偏好測試,懸尾測試,強迫游泳測試,曠場測試與Morris水迷宮測試,分別用于評估小鼠抑郁樣癥狀與學(xué)習(xí)、記憶能力。處死小鼠,取小鼠海馬體用于Western blot實驗,評估TWIST1對神經(jīng)發(fā)生蛋白表達的影響,取小鼠全腦組織用于電生理檢測與免疫熒光實驗,檢測長時程電位與BrdU蛋白表達的變化。

1.4 行為學(xué)測試

1.4.1 糖水偏好測試(sucrose preference test,SPT)：將小鼠分籠飼養(yǎng),每籠1只,開始糖水偏好適應(yīng)性訓(xùn)練,每籠分別插入一瓶1%蔗糖溶液(w/v) 與白開水,小鼠自由飲用適應(yīng)6 h。將小鼠禁食禁水12 h,開啟糖水偏好測試,每籠重新放入1瓶1%蔗糖溶液和白開水,分別稱量蔗糖水與白開水水壺質(zhì)量。小鼠自由飲用測試12 h,再次稱量蔗糖水與白開水質(zhì)量。根據(jù)以下公式計算小鼠糖水?dāng)z取率,糖水?dāng)z取率=(蔗糖水消耗量)/(蔗糖水消耗量+白開水消耗量)×100%。

1.4.2 懸尾測試(tail suspension test,TST)：距尾尖約 1 cm處,將小鼠用膠帶固定懸掛在TST箱中,攝像機拍攝記錄小鼠懸掛后6 min內(nèi)行為,前2 min適應(yīng),后4 min測試,計算機軟件分析小鼠中心不動時間。

1.4.3 強迫游泳測試(forced swimming test,FST)：將小鼠投入FST水箱中,維持水溫(22.0±2.0)℃,攝像機拍攝記錄小鼠投入水中6 min內(nèi)行為,前2 min適應(yīng),后4 min測試,計算機軟件分析小鼠中心不動時間。

1.4.4 曠場測試：將小鼠置入曠場測試箱中,測試箱底部由4×4邊長為10 cm的正方形構(gòu)成,攝像機拍攝記錄小鼠在箱體中的行為活動,前2 min適應(yīng),后4 min測試,計算機軟件分析小鼠中心穿越各個正方形的次數(shù)(最高記錄200次)。

1.4.5 Morris水迷宮測試：水迷宮主體是一個圓形水池高40 cm,直徑120 cm,周圍由50 cm高的水池壁,由遮光窗簾隔開。水池中注入約30 cm高清水,調(diào)控水溫(22.0±2.0)℃。水迷宮分析系統(tǒng)將水面分為4個象限,第Ⅲ象限中央設(shè)置一個逃生平臺。整個水迷宮測試分為定位巡航測試與空間探索測試期。定位巡航測試中,將各組小鼠自各個象限依次丟入水中,自由游泳,尋找逃生平臺,訓(xùn)練時間90 s,4次/d,連續(xù)4 d。當(dāng)小鼠登上平臺,系統(tǒng)自動停止,記錄這段時間為逃避潛伏期。若小鼠90 s內(nèi)無法登上平臺,則引導(dǎo)至平臺,記逃避潛伏期為90 s。第5天開始空間探索測試,撤去逃生平臺,將小鼠自第Ⅰ象限丟入水中,自由探索90 s。記錄小鼠首次穿越逃生平臺時間,穿越逃生平臺次數(shù)及第Ⅲ象限中停留時間。

1.5 Western blot檢驗 4組小鼠脫脊椎處死,取出腦組織后分離出海馬體,-80℃超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆?。稱取約20 μg海馬體,加入100 μl 含PMSF的RIPA裂解液,勻漿成細胞懸液,靜置30 min待充分裂解。離心20 min(4℃/12 000 min),吸取上清液,加入上樣緩沖液,沸水中加熱10 min。取SDS-PAGE凝膠,每孔加入等體積樣品開始凝膠電泳,設(shè)置條件為30 V/30 min,100 V/60 min,上樣緩沖液達底部時停止。濕法轉(zhuǎn)移凝膠上目標(biāo)蛋白至PVDF膜,條件為2 mA/60 min。取PVDF膜放入3% BSA中封閉2 h,4℃孵育一抗稀釋液過夜。次日,HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h,加ECL超敏發(fā)光液,化學(xué)發(fā)光成像儀下獲得目標(biāo)蛋白條帶。

1.6 電生理測試 將小鼠脫脊椎處死,取腦組織放入預(yù)冷且氧飽和的人工腦脊液(ACSF)中靜置1 min,去除小腦,沿小鼠矢狀線分開左右半腦,分離除去額葉,頂葉等組織,僅留下海馬體固定于切片機浴槽中,切成350 μm厚切片并轉(zhuǎn)移至氧飽和且30℃預(yù)熱的ACSF中,持續(xù)通入氧氣孵育2 h。轉(zhuǎn)移海馬體切片至記錄浴槽中,持續(xù)泵入氧飽和ACSF維持神經(jīng)元狀態(tài)。將金屬同心圓電極(MCE-100/200)插入海馬Schaffer側(cè)支處作為刺激電極。將玻璃微電極插入海馬錐體神經(jīng)元CA1區(qū)頂樹突區(qū)域作為記錄電極,充灌氯化鈉溶液作為電極內(nèi)液。采用細胞外場電位模式刺激,精確控制刺激電極與記錄電極位置、深度,誘發(fā)場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。找到fEPSP最大信號強度,以最大信號強度相應(yīng)的50%作為刺激基線。在基線穩(wěn)定記錄20 min后,用經(jīng)典的高頻刺激誘導(dǎo)方式進行刺激,誘發(fā)長時程單位增強(long term potentiation,LTP)。刺激條件：連續(xù)3串高頻脈沖,100 Hz/串,共100次,每串間隔5 s,連續(xù)記錄60 min作為原始數(shù)據(jù)。統(tǒng)計Rise slope對誘導(dǎo)前后進行比較,并進行標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)計算,對LTP是否發(fā)生及發(fā)生程度進行量化統(tǒng)計。

1.7 免疫熒光 將小鼠以CO2處死,打開胸腔,PBS心臟灌流,再用4%多聚甲醛溶液灌注。取出完整腦組織,截去小腦、嗅球等組織,放入4%多聚甲醛溶液中固定>24 h。梯度濃度乙醇脫水處理腦組織,再以聚乙二醇和聚乙烯醇混合液冷凍包埋。冰凍切片機將包埋組織切成5 μm厚切片,收集海馬區(qū)位置明顯的切片于PBST溶液中清洗,轉(zhuǎn)移切片放入含10%驢血清的PBST溶液中封閉2 h,加入Anti-mouse BrdU抗體(1∶100),4℃孵育過夜。次日,PBST清洗切片,在Dylight 488標(biāo)記二抗溶液中避光孵育1 h。PBST清洗切片,滴加DAPI染液,37℃避光孵育15 min,滴加抗熒光猝滅劑,熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 敲低TWIST1表達提高小鼠糖水偏好率與曠場測試評分,降低懸尾與強迫游泳不動時間 與Con組比較,Con+LV-sh TWIST1組小鼠糖水偏好率與曠場測試評分增加,懸尾與強迫游泳不動時間減少,但SD組糖水偏好率與曠場測試評分明顯減少(P<0.05),懸尾與游泳不動時間明顯增加(P<0.05);然而,與SD組比較,SD+LV-sh TWIST1組糖水偏好率與曠場測試評分明顯增加(P<0.05),懸尾與游泳不動時間明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 4組小鼠行為學(xué)測試結(jié)果比較 n=12,

2.2 敲低TWIST1表達降低了小鼠逃避潛伏期,增加穿越平臺次數(shù)與第Ⅲ象限停留時間 與Con組比較,Con+LV-sh TWIST1組逃避潛伏期沒有明顯變化,但SD組自第3天起明顯增加(P<0.05);然而,與SD組比較,SD+LV-sh TWIST1組在第4天明顯減少(P<0.05)?？臻g探索測試中,與Con組比較,Con+LV-shTWIST1組首次到達平臺時間,穿越平臺次數(shù)與第Ⅲ象限停留時間沒有明顯改變,但SD組首次到達平臺時間與第Ⅲ象限平臺時間明顯增加(P<0.05),穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。然而,與SD組比較,SD+ LV-sh TWIST1組首次到達平臺時間與第Ⅲ象限平臺時間明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),穿越平臺次數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、3。

表2 4組小鼠水迷宮定位巡航時逃避潛伏期比較 n=12,s,

表3 4組小鼠水迷宮空間探索時的指標(biāo)結(jié)果比較 n=12,

2.3 敲低TWIST1表達有助于激活Wnt3a/β-catenin信號通路 與Con組比較,Con+ LV-sh TWIST1組TWIST1表達明顯降低(P<0.05),Wnt3a與β-catenin蛋白表達沒有明顯變化,但SD組TWIST1表達明顯增加(P<0.05),且Wnt3a與β-catenin蛋白表達明顯減少(P<0.05);然而,與SD組比較,SD-LV-sh TWIST1組TWIST1表達明顯減少(P<0.05),且Wnt3a與β-catenin蛋白表達明顯增加(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 4組小鼠TWIST1與Wnt3a/β-catenin蛋白表達

表4 4組小鼠TWIST1與Wnt3a/β-catenin蛋白表達 n=4,

2.4 敲低TWIST1表達有助于提高fEPSP斜率 與Con組比較,Con+ LV-sh TWIST1組fEPSP斜率沒有明顯變化,但SD組fEPSP斜率明顯降低(P<0.05);然而,與SD組比較,SD-LV-sh TWIST1組fEPSP斜率明顯增加(P<0.05)。見圖2,表5。

圖2 4組小鼠fEPSP斜率

表5 4組小鼠fEPSP斜率比較 n=4,%,

2.5 敲低TWIST1表達有助于提高BrdU陽性細胞數(shù) 與Con組比較,Con+ LV-sh TWIST1組BrdU陽性細胞數(shù)增加,但無差異(P>0.05),SD組BrdU陽性細胞數(shù)減少(P<0.05);與SD組相比,SD-LV-sh TWIST1組BrdU陽性細胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖3,表6。

圖3 4組小鼠BrdU陽性細胞染色

表6 4組小鼠BrdU陽性細胞量化統(tǒng)計比較 n=4,個,

3 討論

隨著社會經(jīng)濟高速發(fā)展帶來的工作壓力增大,越來越多城市工作者出現(xiàn)睡眠障礙,嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量。流行病學(xué)研究顯示睡眠障礙者有50%～90%被診斷患有抑郁癥[9]。此外,普通人群中,有20%抑郁癥患者主觀抱怨失眠[10]。因此,睡眠障礙不僅會造成抑郁癥發(fā)病,也是抑郁癥最常見伴隨癥狀。主要表現(xiàn)有入睡困難、易驚醒、早醒以及總睡眠時間減少。完整的睡眠周期是人類生理活動必需,正相睡眠期是指機體由清醒進入睡眠狀態(tài),此時全身肌肉雖松弛但仍保持一定的緊張度。而異相睡眠期是指深睡狀態(tài),此時肌肉更加松弛,肌腱反射消失[11]。利用這一生理特性,本研究將小鼠放置在僅能滿足緊張性肌肉行動的平臺上,當(dāng)小鼠進入異相睡眠狀態(tài)時,由于肌肉松弛會跌入水中從而被驚醒,從而達到睡眠剝奪狀態(tài),連續(xù)7 d模型構(gòu)建以造成小鼠出現(xiàn)抑郁樣癥狀。以此模擬臨床睡眠質(zhì)量差,易驚醒的抑郁癥患者狀態(tài)。

不同周期的睡眠剝奪對抑郁癥存在不同影響。短期、急性的睡眠剝奪能夠在一定程度上緩解患者抑郁癥狀,增加腦內(nèi)5-羥色氨酸神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,提高去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體的表達,抑制HPA軸信號激活[12,13]。然而,長期、持久的睡眠障礙會造成體內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、代謝紊亂,不僅可能誘發(fā)抑郁癥,而且會加劇患者抑郁癥狀[14,15]。本研究觀察到連續(xù)7 d的睡眠剝奪造成小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。與Con組比較,SD組糖水?dāng)z取率降低,即小鼠表現(xiàn)出無喜感偏好現(xiàn)象。與此同時,SD組強迫游泳與懸尾測試不動時間明顯增加,曠場測試評分明顯減少,即小鼠表現(xiàn)出沮喪行為,且不愿意社交探索。此外,SD組小鼠水迷宮測試中首次到達平臺時間增加,穿越平臺象限次數(shù)減少,第Ⅲ象限停留時間減少,即小鼠表現(xiàn)出認知功能障礙行為。綜合以上行為學(xué)結(jié)果表明小鼠出現(xiàn)了與臨床患者類似的情緒低落、不愿社交、思維遲緩且運動受限癥狀。

TWIST1涉及的中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究較少,其下游信號通路主要涉及癌癥相關(guān)研究。最近研究顯示,TWIST1在大腦組織中包括嗅球、海馬以及小腦區(qū)域都有表達,并且主要定位于神經(jīng)元中[16]。長期的社交刺激應(yīng)激模型會造成海馬區(qū)TWIST1表達明顯升高,且與小鼠抑郁樣行為存在相關(guān)性[16]。本研究結(jié)果也顯示,SD組TWIST1表達相比于Con組明顯升高。我們采用了慢病毒沉默方式特異性降低了腦區(qū)TWIST1表達,行為學(xué)結(jié)果上顯示,SD+LV-shTWIST1組小鼠抑郁樣行為明顯改善。

現(xiàn)階段,抗抑郁治療主要以單胺遞質(zhì)假說為基礎(chǔ),但對近1/2患者無效,反映了該假說缺乏普適性[17]。因此,不少學(xué)者提出抑郁癥的發(fā)生可能與神經(jīng)發(fā)生抑制相關(guān)。神經(jīng)發(fā)生是新的神經(jīng)元增殖過程,貫穿終生,成年哺乳動物神經(jīng)發(fā)生主要發(fā)生在海馬體齒狀回顆粒下區(qū)和腦室下區(qū)。海馬體作為邊緣系統(tǒng)重要組成部分,不僅參與記憶的儲存與提取,而且是調(diào)節(jié)情感的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[18]。由于BrdU屬于胸腺嘧啶類似物,能整合到細胞分裂增殖的DNA雙鏈中,因此常用于標(biāo)記內(nèi)源性新生神經(jīng)元。本研究結(jié)果顯示,Con組小鼠海馬齒狀回區(qū)域存在部分新生神經(jīng)元,但SD組幾乎沒有新生神經(jīng)元。然而,TWIST1表達降低介導(dǎo)Con+LV-shTWIST1組新生神經(jīng)元增加,且由于可能存在的神經(jīng)元損傷,SD+LV-shTWIST1組新生神經(jīng)元增加更加明顯。學(xué)習(xí)、記憶能力降低是突觸可塑性降低介導(dǎo)的結(jié)果,伴隨著樹突棘萎縮,密度降低。神經(jīng)新生能夠增強突觸可塑性,長時程電位是主要的實驗指標(biāo)[19]。當(dāng)給予海馬體一個高頻刺激,其fEPSP會出現(xiàn)持續(xù)增強現(xiàn)象[20]。Wnt/β-catenin信號通路是參與神經(jīng)元增殖、分化,增強海馬體突觸可塑性的主要信號通路,敲低Wnt3a蛋白表達被發(fā)現(xiàn)會造成海馬體生理結(jié)構(gòu)缺陷[21]。GSK3β是一種普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,Wnt信號活化后發(fā)生磷酸化,促進細胞質(zhì)中β-catenin蛋白累積并轉(zhuǎn)移入核,調(diào)控與神經(jīng)干細胞增殖、分化。本研究結(jié)果顯示,TWIST1表達升高與fEPSP斜率降低,Wnt3a與β-catenin蛋白表達降低相關(guān),無論是Con組還是SD組,通過慢病毒特異性敲低TWIST1表達則能夠提高海馬體fEPSP斜率,增加Wnt3a與β-catenin蛋白表達。

綜上所述,本研究評估TWIST1對長期睡眠剝奪誘導(dǎo)抑郁癥模型動物的影響。研究結(jié)果表明,降低TWIST1表達能夠提高Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達,促進神經(jīng)元新生,增強長時程電位,起到改善小鼠抑郁樣行為與學(xué)習(xí)、記憶能力的作用,這為抑郁癥的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。