從晝夜規(guī)律對(duì)肝臟凝血系統(tǒng)的影響探討子午流注的基因背景*

李晶津 王佳玉

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心臟及大血管中心 (北京, 100070) 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)心臟中心

子午流注源于中醫(yī)針灸“人與天地相應(yīng)”的觀點(diǎn),依據(jù)人體功能活動(dòng)、 病理變化受自然界氣候變化等影響規(guī)律辨證循經(jīng)按時(shí)取穴的針灸治療方法,后來發(fā)展成為中醫(yī)藥因時(shí)制宜(“因時(shí)施治”“因時(shí)針灸”“因時(shí)給藥 ”)的理論基礎(chǔ),是較早的“時(shí)間生物學(xué)”“時(shí)間治療學(xué)”的思想和實(shí)踐[1,2]。肝臟作為最重要的消化腺,其生理功能和相關(guān)生物大分子表達(dá)、代謝活性有著很明顯的晝夜節(jié)律性[3],已有研究報(bào)道晝夜節(jié)律對(duì)肝臟的糖代謝、脂代謝以及膽汁酸代謝等均起到重要作用[4,5]。肝臟也是凝血因子的合成器官,對(duì)于維持凝血系統(tǒng)功能有重要作用[6],但晝夜節(jié)律是否影響肝臟凝血系統(tǒng)功能仍有待研究。本研究通過對(duì)小鼠肝組織基因表達(dá)譜的分析,篩選具有晝夜節(jié)律性的凝血功能相關(guān)基因,探討晝夜節(jié)律對(duì)凝血系統(tǒng)功能的影響,為子午流注的微觀生物學(xué)背景研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 利用高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO數(shù)據(jù)庫(kù)),通過關(guān)鍵字“晝夜節(jié)律”“小鼠”“肝臟組織樣本”“RNA-測(cè)序”搜索GEO數(shù)據(jù)集(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)獲得相關(guān)研究樣本數(shù)據(jù)資料:GSE57313檢測(cè)樣本數(shù)為24例(Dicer敲除型小鼠vs野生型小鼠)[7],GSE70497檢測(cè)樣本數(shù)為24例(晝夜節(jié)律基因Artnl敲除型小鼠vs野生型小鼠)[8]。

1.2 生物信息學(xué)分析 利用晝夜節(jié)律基因和調(diào)節(jié)因子數(shù)據(jù)庫(kù)(CirGRDB,http://cirgrdb.biols.ac.cn)分析上述高通量數(shù)據(jù),獲得晝夜節(jié)律基因表達(dá)譜[9],檢索Reactome生物數(shù)據(jù)庫(kù)獲得凝血信號(hào)通路相關(guān)基因[10],通過韋恩圖篩選出具有晝夜節(jié)律性的凝血相關(guān)基因,利用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID, https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因功能注釋分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟中晝夜節(jié)律性的凝血功能相關(guān)基因分析 通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中晝夜節(jié)律性的凝血功能相關(guān)基因有22個(gè)(P<0.05),根據(jù)凝血功能分為巨核細(xì)胞發(fā)育與血小板生成的相關(guān)因子12個(gè)、細(xì)胞表面與血管壁的相互作用因子5個(gè)、血小板激活和聚集因子4個(gè)、血小板止血因子2個(gè)。見表1。22個(gè)基因的功能注釋分析見圖1,2。

圖2 小鼠肝臟中晝夜節(jié)律性的凝血功能相關(guān)基因GO富集分析

表1 小鼠肝臟中晝夜節(jié)律性的凝血功能相關(guān)基因

2.2 小鼠肝臟中凝血功能相關(guān)基因晝夜節(jié)律表達(dá)特征 小鼠肝臟中晝夜節(jié)律性的凝血功能相關(guān)基因有17個(gè)在夜間表達(dá)增高(Pde9a、Ppp2r1b、Tuba4a、Vcl、Cxadr、Itga5、Kras、Slc16a1、Tek、Jmjd1c、Phf21a、Prkaca、Prkar2a、Rcor1、Tubb2a、Tubb2b、Tubb4b),其中Pde9a、Tuba4a、Cxadr、Prkar2a的表達(dá)夜間最高;Gna12、Rapgef4、Maff、Sh2b3、Wee1日間表達(dá)升高,其中Gna12、Rapgef4、Maff、Wee1的表達(dá)日間最高。敲除晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子Arntl后凝血相關(guān)基因表達(dá)的晝夜節(jié)律性消失。見表2,圖3。

圖3 小鼠肝臟中晝夜表達(dá)特征顯著的凝血相關(guān)基因(●為野生型,■為晝夜節(jié)律因子Arntl-/-敲除型)

表2 小鼠肝臟中凝血功能相關(guān)基因的晝夜節(jié)律數(shù)據(jù)

3 討論

子午流注的名稱最早載于金·閻明廣《子午流注針經(jīng)》,該學(xué)說以“天人相應(yīng)”的整體觀為理論基礎(chǔ),是中醫(yī)時(shí)間醫(yī)學(xué)內(nèi)容中對(duì)晝夜節(jié)律劃分最為嚴(yán)格的一種。子午流注學(xué)說認(rèn)為人體十二經(jīng)脈氣血流動(dòng)按一日晝夜時(shí)間更替表現(xiàn)出規(guī)律性的盛衰變化,隨著后世醫(yī)家對(duì)時(shí)間醫(yī)學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷發(fā)展,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)針灸治療、辨證、用藥和養(yǎng)生[12,13]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝主藏血、主疏泄,其排毒、修復(fù)、合成及儲(chǔ)血等功能具有時(shí)間節(jié)律的變化規(guī)律,但其科學(xué)內(nèi)涵和生物學(xué)基礎(chǔ)一直未能闡明。

本研究采用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)與方法,重點(diǎn)探討肝臟凝血功能的晝夜節(jié)律特性,以期探索子午流注學(xué)說的基因背景。本研究通過分析小鼠肝臟的高通量基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)肝臟部分凝血功能相關(guān)基因具有晝夜節(jié)律性,其中大部分基因與血小板的生成、激活、聚集和止血密切相關(guān)。這一點(diǎn)與凝血因子節(jié)律性的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究相印證,有研究報(bào)道晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子CLOCK和BMAL能夠調(diào)節(jié)血栓形成[14],高齡小鼠BMAL1缺失更易導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損并形成血栓[15]。通過分析肝臟凝血功能相關(guān)基因的晝夜節(jié)律特征,本研究表明這些基因大部分在夜間表達(dá)逐漸升高,其節(jié)律性受到節(jié)律因子的調(diào)控,節(jié)律調(diào)節(jié)因子敲除后相關(guān)基因節(jié)律性消失。夜間表達(dá)最高的基因包括磷酸二酯酶9A(Pde9a)、微管蛋白α 4a(Tuba4a)、CXADR Ig樣細(xì)胞粘附分子(Cxadr)、蛋白激酶cAMP依賴性II型調(diào)控亞基α(Prkar2a),磷酸二酯酶(PDEs)能夠水解細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP或cGMP,終結(jié)第二信使傳導(dǎo)的生化作用。PDE9A與其他PDEs家族成員相比,對(duì)cGMP具有最高的親和力和選擇性,特異性調(diào)節(jié)心臟鈉尿肽依賴性cGMP信號(hào),作為心肌細(xì)胞和肌肉肥厚的調(diào)節(jié)劑,在大腦中參與學(xué)習(xí)和長(zhǎng)期記憶等認(rèn)知功能。Tuba4是一種微管蛋白,能夠結(jié)合GTP、構(gòu)成細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)成分,參與有絲分裂中心體Nlp的丟失以及折疊前蛋白和TriC/CCT在肌動(dòng)蛋白和微管蛋白折疊中的協(xié)同作用。CXADR能夠結(jié)合整合素,參與先天免疫系統(tǒng)和Ⅰ類MHC介導(dǎo)的抗原加工和遞呈;也可介導(dǎo)駐留在上皮細(xì)胞中的γ - δ T細(xì)胞激活,增殖并產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,刺激上皮組織修復(fù)。PRKAR2A能夠結(jié)合泛素蛋白連接酶和cAMP,可能與多種α激酶錨定蛋白相互作用,并決定cAMP依賴性蛋白激酶的亞細(xì)胞定位,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)從核內(nèi)體到高爾基體并進(jìn)一步到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸。日間表達(dá)最高的凝血功能基因包括G蛋白亞基α 12(Gna12)、Rap鳥嘌呤核苷酸交換因子4(Rapgef4)、MAF BZIP轉(zhuǎn)錄因子F(Maff)、Wee1 G2檢查點(diǎn)激酶(Wee1)。GNA12參與TOR信號(hào)的調(diào)控和蛋白酶體泛素依賴性蛋白分解代謝過程的調(diào)控;通過激活RhoA/ROCK信號(hào)通路上調(diào)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;抑制獨(dú)立于Rho激活的CDH1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附過程;與NAPA協(xié)同促進(jìn)CDH5定位到質(zhì)膜;還可能通過TOR信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控細(xì)胞遷移。Rapgef4具有鳥酰核苷酸交換因子活性,可結(jié)合GTPase,參與能量代謝整合和整合素信號(hào)傳導(dǎo)途徑;可能參與神經(jīng)遞質(zhì)受體定位到突觸后特化膜的調(diào)節(jié)和突觸后組織的調(diào)節(jié)。Maff具有轉(zhuǎn)錄因子活性,能夠結(jié)合序列特異性DNA,如催產(chǎn)素受體(OTR)基因啟動(dòng)子中的US-2 DNA元件,以增強(qiáng)OTR基因在妊娠期的表達(dá),也可能參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。Wee1基因編碼蛋白是一種酪氨酸激酶,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,可催化CDC2/細(xì)胞周期蛋白B激酶的抑制性酪氨酸磷酸化,并通過保護(hù)細(xì)胞核免受細(xì)胞質(zhì)活化的CDC2激酶的影響,協(xié)調(diào)DNA復(fù)制和有絲分裂之間的過渡。

本研究發(fā)現(xiàn)肝臟中凝血相關(guān)基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性,其中大部分基因夜間表達(dá)逐漸升高,其節(jié)律性受到節(jié)律因子的調(diào)控。這可能是子午流注的重要基因背景,也為“因時(shí)防治”動(dòng)脈粥樣硬化和從肝論治提供新的研究思路。本研究存在的不足之處是,研究結(jié)果還需要利用人類群體數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,具體的凝血基因晝夜調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。