基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討克癀膠囊抗肝纖維化的作用機制*

倪沁雨 林佳成 涂天智 趙如意 孔曉妮 朱曉駿

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中心實驗室 (上海, 200021) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科 3.科興生物制藥股份有限公司

肝纖維化是發(fā)生在大多數(shù)慢性肝病中的一種病理變化,其主要表現(xiàn)為肝組織細胞外基質(zhì)(ECM)過度增殖和沉積,促使肝組織結(jié)構(gòu)異常改變,影響肝臟正常生理功能[1],其病因有病毒、毒素、藥物、乙醇或膽汁淤積等。肝纖維化最終可能導(dǎo)致肝硬化、肝癌,是肝硬化和肝癌發(fā)展過程中的重要過程。中藥復(fù)方治療肝病具有成分多、靶點多的優(yōu)勢且療效好、不良反應(yīng)小,且已有臨床效果較好的中成藥在臨床上使用[2]。

克癀膠囊是保肝退黃的常用中成藥,其成分為三七、黃連、黃芩、黃柏、大黃、白花蛇舌草、山銀花、蛇膽汁、人工牛黃、皂角刺、人工麝香、冰片、郁金、防風(fēng)、石菖蒲、甘草,共16味,具有清熱解毒,化瘀散結(jié)的功效,適用于脅肋脹痛或刺痛,脅下痞塊,口苦口黏,納呆腹脹,面目黃染,小便短赤,舌質(zhì)黯紅或瘀斑、瘀點,舌苔黃膩,脈弦滑或澀等濕熱毒邪內(nèi)蘊、瘀血阻絡(luò)證肝纖維化。臨床研究發(fā)現(xiàn)克癀膠囊對于慢性乙型肝炎、膽汁淤積性肝炎、病毒性肝炎引起的高膽紅素血癥等具有良好療效,臨床研究發(fā)現(xiàn)克癀膠囊治療6個月后,與對照組相比較,乙型肝炎肝硬化代償期患者肝臟瞬時彈性掃描儀肝臟硬度值明顯下降,由此本研究推測克癀膠囊可能具有抗肝纖維化的作用[3-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建“藥物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),從整體層面揭示藥物對疾病的作用機制[9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,克癀膠囊治療肝纖維化的作用機制進行系統(tǒng)研究,為克癀膠囊的臨床應(yīng)用和進一步研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗驗證

1.1.1 動物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠 20只,體質(zhì)量(20±2)g,購買于上海杰思捷實驗動物有限公司。所有動物均飼養(yǎng)在溫度( 24±1)℃ 、濕度 55%～65%、 光暗12 h交替的安靜環(huán)境,自由取食及飲水。

1.1.2 藥品與試劑 CCl4(麥克林公司),橄欖油(國藥試劑公司),克癀膠囊(深圳同安藥業(yè)有限公司),總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司),SYBR RT-PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機(德國Leica公司),光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司),SpectraMax iD5酶標儀酶標儀(美谷分子儀器公司),AB17900PCR熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.1.4 分組、造模與給藥 將20只6周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組,每組5只,分別為對照組(NCD)、模型組(CCl4)、克癀膠囊低劑量組(CCl4+KH_Low)(克癀膠囊1.8 g/kg)、克癀膠囊高劑量組(CCl4+KH_High)(克癀膠囊5.4 g/kg)。除空白組外,其余各組小鼠腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液(1 ml/kg)誘導(dǎo)肝纖維化模型,每周3次,共注射6周。第4周開始,CCl4+KH_Low組、CCl4+KH_High組小鼠每天給予克癀膠囊灌胃方式給藥,NCD和CCl4組小鼠給予同等體積生理鹽水,共給藥3周。

1.1.5 樣本的取材及處理 末次給藥后,所有小鼠禁食不禁水12 h后,將小鼠后頸椎脫臼,取部分肝組織用4%的多聚甲醛溶液固定,其余肝臟凍存于-80℃醫(yī)用低溫保存箱備用。

1.1.6 RT-qPCR法檢測小鼠肝組織α-SMA、COL1A1、TGF-β1 mRNA表達 稱取少量凍存肝組織, 經(jīng)RNA吸附柱提取總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用SYBR Green 進行兩步法實時熒光定量PCR反應(yīng),β-actin作為內(nèi)參基因, 以2-ΔΔCT分析計算各組小鼠mRNA表達情況。引物序列見表1。

表1 α-SMA、COL1A1、TGF-β1引物序列

1.1.7 肝組織病理學(xué)觀察 取上述經(jīng)4%的多聚甲醛溶液固定的肝組織后,石蠟包埋,切片,厚度5 μm,分別進行HE染色和天狼星紅染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)病理變化和膠原纖維沉積情況,并拍照分析。

1.2 克癀膠囊藥物有效成分與靶點 分別以三七、黃連、黃芩、黃柏、大黃、白花蛇舌草、山銀花、蛇膽汁、人工牛黃、皂角刺、人工麝香、冰片、郁金、防風(fēng)、石菖蒲、甘草16個中藥名為關(guān)鍵詞,通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP和HERB數(shù)據(jù)庫檢索其所有的化學(xué)成分。在TCMSP中以口服生物利用度(OB)>30% 和類藥性(DL)>0.18 作為篩選條件,收錄符合條件的有效成分及對應(yīng)靶點,并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶點名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱,將其結(jié)果與HERB數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并去重。再用Genecards數(shù)據(jù)庫進行二次篩選并獲取作用靶點;Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行靶點驗證,最后獲得克癀膠囊的藥物成分靶點。

1.3 肝纖維化相關(guān)靶點 以“hepatic fibrosis”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶點,將其結(jié)果取交集,得到肝纖維化的疾病相關(guān)靶點。

1.4 GO及KEGG富集分析 利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8網(wǎng)站工具(https://david.ncifcrf.gov/),將潛在作用靶點進行GO分析[包括生物功能(BP),細胞組成(CC),分子功能(MF)]和KEGG通路富集分析,并用微生信網(wǎng)站工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行GO分析和KEGG富集分析繪圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶蛋白確定 使用Bioinformatics &Evolutionary Genomics網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),將克癀膠囊藥物成分靶點與肝纖維化疾病靶點分別導(dǎo)入,繪制韋恩圖,得到克癀膠囊對肝纖維化的潛在作用靶點。將潛在作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/), 限定物種為“Homo sapiens”,minimum required interaction score≥0.9,同時去掉游離的靶點,獲取潛在作用靶點的蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape_v3.9.0軟件,利用插件cytoHubba ,用degree值法篩選出排名前20的靶點,可認為是核心作用靶點。

2 結(jié)果

2.1 克癀膠囊對肝纖維化小鼠肝臟組織α-SMA和COL1A1、TGF-β1 mRNA的表達影響 見圖1。

圖1 RT-qPCR法檢測小鼠肝臟肝纖維化相關(guān)mRNA表達 與NCD相比,#P<0.001;與CCl4相比,#P<0.001,*P<0.05;與CCl4+KH_Low相比,#P<0.01

2.2 克癀膠囊對肝纖維化小鼠肝臟形態(tài)及病理學(xué)組織的影響 HE染色結(jié)果顯示,NCD小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常,完整清晰,肝細胞大小均勻,無變形壞死,細胞核居于細胞中央;CCl4組小鼠肝細胞排列紊亂,肝組織結(jié)構(gòu)損傷嚴重;CCl4+KH_Low組和CCl4+KH_High組小鼠肝細胞變性、壞死等現(xiàn)象較CCl4組顯著改善(圖2A)。

圖2 各組小鼠肝纖維化肝組織HE染色(A)及天狼星紅染色(B)(200×) 與NCD相比,*P<0.01;與CCl4組相比,*P<0.01;與CCl4+KH_Low組相比,*P<0.001

天狼星紅染色結(jié)果顯示,NCD小鼠肝組織細胞結(jié)構(gòu)完整,未見明顯的膠原纖維沉積;CCl4組小鼠肝組織中可明顯觀察到大量的膠原纖維沉積;與CCl4組相比,CCl4+KH_Low組和CCl4+KH_High組小鼠肝組織中膠原沉積得到明顯改善(P<0.01),且CCl4+KH_High組的效果均優(yōu)于CCl4+KH_Low組(P<0.01)(圖2B)。

2.3 克癀膠囊潛在有效成分與肝纖維化潛在靶點 通過檢索得到克癀膠囊藥物組成成分39個,見表1。其中多藥共有成分12個,甘草8個,大黃、黃柏各3個,黃芩、牛黃、三七、皂角刺各2個,冰片、山銀花、蛇膽汁、麝香、石菖蒲各1個。查詢克癀膠囊各有效成分對應(yīng)靶點,合并去重后得到靶點242個,肝纖維化疾病靶點974個,二者共有靶點90個,即克癀膠囊治療肝纖維化的潛在靶點,見圖3。

圖3 克癀膠囊治療肝纖維化潛在靶點圖

表1 克癀膠囊潛在有效成分

2.4 克癀膠囊治療肝纖維化的潛在KEGG通路 KEGG通路富集顯著性排名前20的結(jié)果見圖4,結(jié)果顯示TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、IL-17信號通路被高度富集;除PI3K-Akt信號通路外,與肝纖維化有關(guān)的HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路也被富集。

圖4 克癀膠囊治療肝纖維化的KEGG通路富集圖

2.5 克癀膠囊治療肝纖維化的潛在生物功能 取顯著性排名前5的條目作圖,見圖5。BP分析顯示,克癀膠囊主要調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細胞因子介導(dǎo)的信號通路。CC分析顯示,克癀膠囊主要調(diào)控細胞外間隙和細胞外區(qū)的反應(yīng)。MF分析顯示,克癀膠囊主要調(diào)控酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性和序列特異性DNA的結(jié)合過程。

圖5 克癀膠囊治療肝纖維化的GO分析富集圖

2.6 克癀膠囊治療肝纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)和靶標網(wǎng)絡(luò) 克癀膠囊治療肝纖維化的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖6所示。克癀膠囊治療肝纖維化的核心作用靶點有JUN、STAT3、TP53、MAPK3、TNF、AKT1、MAPK1、MAPK14、IL6、CREB1等,見圖7。其中JUN、STAT3、TP53為排名前3的Hub基因,在克癀膠囊治療肝纖維化中起到重要作用。

圖6 克癀膠囊治療肝纖維化的PPI圖

2.7 克癀膠囊治療肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ) 基于肝纖維化信號通路中的潛在靶標,對克癀膠囊中有效成分(中藥單體)調(diào)控靶標進行計數(shù),如圖8所示,調(diào)控肝纖維化靶標超過5個的潛在有效成分如下:白花蛇舌草、甘草、黃柏、黃連、三七、皂角刺的槲皮素(quercetin),麝香的17β-雌二醇(17-beta-estradiol),皂角刺的漆黃素(fisetin),甘草、石菖蒲、皂角刺的山奈酚(kaempferol),甘草、郁金的柚皮素(naringenin),白花蛇舌草、黃柏、黃芩、三七、皂角刺的豆甾醇(Stigmasterol),防風(fēng)、黃連、黃芩的漢黃芩素(wogonin),三七的人參皂苷Rh2(ginsenoside rh2),甘草的芒柄花黃素(formononetin),白花蛇舌草、大黃、防風(fēng)、黃柏、黃芩、三七、郁金、皂角刺的β-谷甾醇(beta-sitosterol),大黃的蘆薈大黃素(aloe-emodin),黃芩的黃芩素(baicalein)、刺槐素(acacetin)。以上這些有效成分可能是克癀膠囊治療肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖8 克癀膠囊有效成分調(diào)控肝纖維化靶點計數(shù)

3 討論

中醫(yī)學(xué)原本并無肝纖維化病名記載,依據(jù)肝纖維化的臨床表現(xiàn),中醫(yī)學(xué)多將其歸為“積聚”“脅痛”等?？笋ツz囊主要適用于濕熱毒邪內(nèi)蘊、瘀血阻絡(luò)型肝纖維化。濕熱毒邪侵襲人體,日久瘀血內(nèi)生,肝絡(luò)受損,濕熱毒瘀郁于肝臟,出現(xiàn)肝纖維化。克癀膠囊中黃芩、黃連、黃柏、白花蛇舌草、山銀花、石菖蒲清熱化濕,配以防風(fēng)加強化濕作用;蛇膽、牛黃、冰片解毒,三七、郁金活血化瘀,麝香、皂角刺通絡(luò)散瘀散結(jié),甘草和中、調(diào)和諸藥。

本研究RT-qPCR結(jié)果顯示,克癀膠囊可降低小鼠肝組織的肝纖維化相關(guān)基因α-SMA、 COL1A1、TGF-β1 mRNA表達水平。HE染色和天狼星染色結(jié)果表明,克癀膠囊可改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝細胞損害情況和膠原沉積等形態(tài)及病理學(xué)組織改變。α-SMA是肝星狀細胞活化后的特異性蛋白,肝星狀細胞激活后α-SMA會表達升高,可反應(yīng)肝星狀細胞激活后增殖的程度,是評估肝纖維化進展的重要指標[10]。COL1A1在肝纖維化進程中過度分泌的ECM蛋白組成之一,其過度積累形成纖維瘢痕[11]。TGF-β1是最有效的促纖維化細胞因子,可刺激肝星狀細胞活化,增加ECM合成。

克癀膠囊藥物組成中的白花蛇舌草、甘草、黃柏、黃連、三七、皂角刺均含有槲皮素,槲皮素靶點與肝纖維化疾病靶點交集較多。其有抗炎、抗纖維化等多種藥理作用,能夠體外抑制肝纖維化,對HSC有顯著調(diào)控作用[12],對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠起保護作用[13]。甘草、郁金中的柚皮素,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和肝腎保護等多種作用,能抑制如肝臟等多種器官組織的纖維化[14]。皂角刺當中的漆黃素,是一種天然的黃酮類化合物,可抑制促炎反應(yīng),具有抗氧化和抗腫瘤作用[15,16]。漆黃素可能有助于改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及相關(guān)并發(fā)癥,如高脂血癥、肝纖維化等的有害影響。漆黃素通過增加對氧磷酶(PON)活性、脂肪因子失調(diào)、促炎細胞因子的產(chǎn)生和ECM在肝臟中的積聚減少過量活性氧化物(ROS)產(chǎn)生,從而有助于改善肝臟的脂毒性和纖維化[17]。甘草、石菖蒲、皂角刺中的山柰酚可有效地減輕肝纖維化形成,抑制 HSC活化,進一步抑制 HSC的體內(nèi)和體外膠原合成。此外,三七總皂苷、黃芩苷、?；撬峋锌垢卫w維化和抑制肝星狀細胞作用[18-22]。

Hub基因網(wǎng)絡(luò)提示JUN、STAT3、TP53基因被高度富集,說明克癀膠囊可能主要通過上述基因發(fā)揮抗肝纖維化作用。STAT3在介導(dǎo)肝損傷的過程中起關(guān)鍵作用,STAT3激活可在肝纖維化的發(fā)病機制中發(fā)揮抗炎或促炎作用,例如在HBV中的STAT3激活在大多數(shù)情況下作為促炎信號促進肝纖維化甚至肝癌[23]。TNF是一種調(diào)節(jié)細胞生長、分化、誘導(dǎo)炎癥和調(diào)節(jié)凋亡的因子。當機體出現(xiàn)免疫應(yīng)答和免疫損傷時,單核巨噬細胞能合成大量TNF-α,通過激活免疫級聯(lián)反應(yīng)觸發(fā)炎癥反應(yīng)[24]。

KEGG結(jié)果中TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路等被富集,上述通路都與肝纖維化、細胞凋亡有關(guān)。表明克癀膠囊干預(yù)肝纖維化的活性成分作用的靶點可能分布于不同的信號通路,協(xié)同發(fā)揮作用。PI3K-Akt的激活在肝纖維化中發(fā)揮重要作用,PI3K-Akt信號通路是許多研究治療慢性肝病的重要靶標。研究表明,通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路, HSC增殖和Ⅰ型膠原的表達和分泌可顯著減少[25]。PI3K/AKT/mTOR信號通路還能調(diào)控HSC發(fā)生自噬,進而使HSC活化,導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[26]。JAK2/STAT3信號通路是多種細胞因子共有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與細胞增殖、分化、凋亡等過程[19,27]。當信號通路被激活時,STAT3磷酸化并形成二聚體。轉(zhuǎn)移到細胞核后,與特定的DNA序列結(jié)合,誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達,激活和增殖HSC,最終導(dǎo)致肝纖維化。

克癀膠囊可改善CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化,可能是通過 TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路,調(diào)控JUN、STAT3、TP53等靶基因發(fā)揮抗纖維化作用。本研究為克癀膠囊治療肝纖維化提供了科學(xué)的依據(jù),為研究克癀膠囊治療肝纖維化機制提供一定的方向。