基于生物信息學(xué)及分子對(duì)接研究天牛止眩膠囊治療原發(fā)性高血壓的潛在活性成分及分子機(jī)制

蔡子杰 姚昆鵬 蔡虎志 陳新宇

[摘要]?目的?利用生物信息學(xué)及分子對(duì)接，探討天牛止眩膠囊治療原發(fā)性高血壓（essential?hypertension，EH）的潛在活性成分及分子機(jī)制。方法?利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)、BATMAN-TCM平臺(tái)篩選天牛止眩膠囊的活性成分及藥物靶點(diǎn)，使用GeneCards、PharmGkb、TTD、DrugBank檢索EH的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，采用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建“藥物–成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，應(yīng)用STRING平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用分析，使用R軟件包進(jìn)行基因本體論（gene?ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）富集分析，運(yùn)用AutoDockTools及AutoDock?Vina進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，使用PyMol軟件進(jìn)行可視化分析。結(jié)果?共篩選出天牛止眩膠囊有效成分53種，涉及相關(guān)靶點(diǎn)基因422個(gè)。篩選出關(guān)鍵活性化合物217個(gè)，拓?fù)浞治龅贸龊诵陌悬c(diǎn)蛋白AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN等10個(gè)，GO及KEGG富集分析結(jié)果提示天牛止眩膠囊干預(yù)EH主要涉及細(xì)胞對(duì)外的刺激、對(duì)活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)途徑與涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示FOS與槲皮素及山柰酚結(jié)合力最強(qiáng)。結(jié)論?天牛止眩膠囊中的槲皮素、山柰酚等多種關(guān)鍵活性成分可作用于FOS、JUN、AKT等多個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白，發(fā)揮調(diào)控血壓、降低心腦血管并發(fā)癥危險(xiǎn)等級(jí)、保護(hù)靶器官的作用。

[關(guān)鍵詞]?天牛止眩膠囊；原發(fā)性高血壓；生物信息學(xué)；分子對(duì)接；分子機(jī)制

[中圖分類號(hào)]?R255.3；R256.2??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.16.009

The?potential?active?ingredients?and?molecular?mechanism?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?treatment?of?essential?hypertension?based?on?bioinformatics?and?molecular?docking

CAI?Zijie1，?YAO?Kunpeng1，?CAI?Huzhi2，?CHEN?Xinyu1，2

1.Graduate?School?of?Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410208，?Hunan，?China;?2.Department?of?Cardiovascular?Medicine，?the?First?Hospital?of?Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410007，?Hunan，?China

[Abstract]?Objective?The?potential?active?ingredients?and?molecular?mechanism?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?treating?essential?hypertension?（EH）?were?studied?based?on?bioinformatics?and?molecular?docking.?Methods?Traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform?and?BATMAN-TCM?datebase?were?used?to?screen?active?ingredients?and?drug?targets?of?Tianniu?Zhixuan?capsule.?GeneCards，?PharmGkb，?TTD?and?DrugBank?were?used?to?search?disease-related?targets?of?EH.?The?“drug-composition-target”?network?map?was?constructed?using?Cytoscape3.8.0?software.?STRING?platform?was?used?for?protein-protein?interaction?analysis，?R?software?package?was?used?for?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?enrichment?analysis，?AutoDockTools?and?AutoDock?Vina?were?used?for?molecular?docking?verification，?PyMol?software?was?used?for?visual?analysis.?Results?A?total?of?53?effective?ingredients?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?were?screened，?involving?422?related?target?genes.?A?total?of?217?key?active?compounds?were?screened，?and?10?core?target?proteins?were?identified?by?topological?analysis，?including?AKT1，?MAPK8，?NFKB1，?FOS，?MAPK1，?JUN，?etc.?GO?and?KEGG?enrichment?analysis?indicated?that?the?intervention?of?Tianniu?Zhixuan?capsule?in?EH?mainly?involved?various?biological?pathways?such?as?external?cell?stimulation，?response?to?activated?oxygen，?oxidative?stress?and?other?biological?pathways，?as?well?as?lipid?and?atherosclerosis，?fluid?shear?stress?and?atherosclerosis?and?other?related?pathways.?Molecular?docking?results?showed?that?FOS?had?the?strongest?binding?force?with?quercetin?and?kaempferol.?Conclusion?Quercetin，?kaempferol?and?other?key?active?ingredients?in?Tianniu?Zhixuan?capsule?can?act?on?FOS，?JUN，?AKT?and?other?core?target?proteins，?and?play?a?role?in?regulating?blood?pressure，?reducing?the?risk?level?of?cardiovascular?and?cerebrovascular?complications?and?protecting?target?organs.

[Key?words]?Tianniu?Zhixuan?capsule;?Essential?hypertension;?Bioinformatics;?Molecular?docking;?Molecular?mechanism

當(dāng)前，高血壓仍是全球疾病負(fù)擔(dān)較重的疾病之一，也是我國面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。由于經(jīng)濟(jì)及社會(huì)醫(yī)療資源分配的不均衡，中國高血壓人群的血壓控制不甚理想。中醫(yī)藥對(duì)控制血壓、保護(hù)靶器官、提高患者遠(yuǎn)期生存率、延緩心腦血管疾病進(jìn)展具有重要意義[3]。湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制天牛止眩膠囊（原名血壓平膠囊）用于治療原發(fā)性高血壓（essential?hypertension，EH），可降低血壓，逆轉(zhuǎn)血管重塑，保護(hù)靶器官，改善心室重構(gòu)和胰島素抵抗，延緩左心室肥厚[4-6]。本文旨在利用生物信息學(xué)技術(shù)及分子對(duì)接方法，探討天牛止眩膠囊治療EH的作用機(jī)制，為后續(xù)課題組的進(jìn)一步驗(yàn)證提供思路。

1??材料與方法

1.1??有效成分篩選及作用靶標(biāo)預(yù)測

天牛止眩膠囊由漢防己、牛膝、菊花、酸棗仁、天麻組成。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（traditional?Chinese?medicine?systems?pharmacology?database?and?analysis?platform，TCMSP）檢索漢防己、牛膝、菊花、酸棗仁的有效成分及相應(yīng)靶點(diǎn)，篩選條件：生物利用度≥30%和類藥性≥0.18；在BATMAN-TCM平臺(tái)檢索天麻的有效成分及相應(yīng)靶點(diǎn)，篩選條件：校正P<0.05及分?jǐn)?shù)截?cái)嘀怠?0。使用UniProt數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化天牛止眩膠囊有效成分靶點(diǎn)。

1.2??疾病靶點(diǎn)的收集

使用“essential?hypertension”作為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫，獲得EH的疾病靶點(diǎn)基因。篩選并合并上述基因庫中與EH相關(guān)基因，剔除重復(fù)基因。

1.3??藥物-疾病核心作用基因篩選

將天牛止眩膠囊的藥物靶點(diǎn)基因與EH疾病靶點(diǎn)基因映射，并繪制韋恩圖。借助Cytoscape3.8.0軟件，導(dǎo)入藥物靶點(diǎn)–疾病靶點(diǎn)映射交集文件，構(gòu)建“藥物–成分–靶點(diǎn)”圖。

1.4??靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?/p>

將獲得的交集靶基因?qū)隨TRING平臺(tái)，設(shè)置物種為人類，最低互動(dòng)得分≥0.9，獲得蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，并刪除游離節(jié)點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析，使用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算各節(jié)點(diǎn)度值，獲取核心靶點(diǎn)基因。

1.5??富集分析

利用R軟件包對(duì)交集基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路與基因本體論（gene?ontology，GO）富集分析。

1.6??分子對(duì)接

選擇藥物–成分–靶點(diǎn)中排名前2的活性化合物作為小分子配體，在PubChem?CID數(shù)據(jù)庫獲取有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，于Uniprot數(shù)據(jù)庫中查詢關(guān)鍵靶點(diǎn)信息，在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件移除靶蛋白中的配體和非蛋白分子。使用AutoDockTools1.5.7軟件將晶體結(jié)構(gòu)加氫、加電荷。使用AutoDock?Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算最低結(jié)合能，使用PyMol軟件處理和可視化分子對(duì)接結(jié)果。

2??結(jié)果

2.1??活性成分篩選及作用靶標(biāo)預(yù)測

于TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到40種化合物。其中防己3種、牛膝20種、菊花8種、酸棗仁9種。使用BATMAN-TCM平臺(tái)進(jìn)行補(bǔ)充，得到天麻相關(guān)化合物13種。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，通過匹配并篩選去除重復(fù)值，獲得422個(gè)靶點(diǎn)。

2.2??疾病靶點(diǎn)的收集及藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集

檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫，分別得到EH靶點(diǎn)2781、57、72、112、76個(gè)，篩選并去除重復(fù)值后得到靶點(diǎn)2872個(gè)，見圖1。藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)有217個(gè)交集，見圖2。

2.3??篩選藥物-疾病核心作用基因

將天牛止眩膠囊的預(yù)測靶點(diǎn)與EH的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，再導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“藥物–成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。圖中共計(jì)256個(gè)節(jié)點(diǎn)，467條邊。天牛止眩膠囊中有效成分槲皮素、山柰酚、棕櫚酸、漢黃芩素、β-谷甾醇分別與101、39、33、31、24個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)。PTSG1（18個(gè)）是有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量最多的基因，其次是PTGS2（17個(gè)）、AR（16個(gè)）和PGR（16個(gè)）。

2.4??PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?/p>

將篩選的天牛止眩膠囊與EH的217個(gè)共同靶點(diǎn)提交至STRING平臺(tái)，構(gòu)建天牛止眩膠囊干預(yù)EH的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)圖中有162個(gè)節(jié)點(diǎn)，633條邊。使用CytoNCA功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，?duì)基因相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行篩選，得到13個(gè)核心基因。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示，核心基因前10位分別為TNF、EGFR、AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、TP53、ESR1、MAPK1、JUN，見圖5。

注：右側(cè)黃色代表作用靶點(diǎn)，左側(cè)圓圈代表藥物有效成分，淡紫色代表天麻有效成分，淡紅色代表酸棗仁有效成分，天藍(lán)色代表牛膝有效成分，墨藍(lán)色代表防己有效成分，深紫色代表菊花有效成分，淡粉色代表防己與牛膝共有有效成分，淡綠色代表菊花與牛膝共有有效成分，深綠色代表天麻與菊花有效成分

2.5??富集分析

將天牛止眩膠囊的217個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，得到2778個(gè)GO富集條目，包括生物過程2440個(gè)、細(xì)胞組分103種和分子功能235種，得到195條KEGG通路。各選取生物過程、細(xì)胞組分、分子功能排名前10的GO條目繪制柱狀圖，選取KEGG通路前30的條目繪制氣泡圖，見圖6。

A.FOS與槲皮素結(jié)合模式圖；B.FOS與山柰酚結(jié)合模式圖；C.JUN與槲皮素結(jié)合模式圖；D.JUN與山柰酚結(jié)合模式圖；E.AKT與槲皮素結(jié)合模式圖；F.AKT與山柰酚結(jié)合模式圖

2.6??分子對(duì)接

選取“藥物–成分–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中與靶點(diǎn)互動(dòng)關(guān)系密切程度居前的2個(gè)活性化合物（槲皮素、山柰酚）作為小分子配體。篩選2次拓?fù)浞治龊螳@得的前10核心靶點(diǎn)蛋白，選擇與活性成分有關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)蛋白（AKT1、MAPK8、NFKB1、FOS、MAPK1、JUN），使用AutoDock?Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并計(jì)算各個(gè)蛋白與小分子配體間的最低結(jié)合能，見表1。利用PyMol軟件數(shù)據(jù)庫可視化分析對(duì)接效果最好的6對(duì)分子–靶點(diǎn)模式圖，見圖7。

3??討論

根據(jù)高血壓病的發(fā)病癥狀，中醫(yī)將EH歸為眩暈、頭痛等范疇[7]。歷代醫(yī)家多認(rèn)為“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，從肝風(fēng)、肝陽角度論治高血壓病成為主流。其病機(jī)為肝陽上亢、痰飲內(nèi)停、腎陰虧虛，常夾雜發(fā)病。多治以平肝潛陽、化痰息風(fēng)、健脾祛濕、滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)陰填精法[3]。高血壓病責(zé)之在肝，其次為心、腎。肝體陰而用陽，賴陰血以滋養(yǎng)，故肝陰不足，陽則易亢。另肝主疏泄，司條達(dá)，疏泄失常，致肝郁氣滯、郁而化熱、耗傷陰血，可致肝陰虧虛、肝陽上亢或肝火熾盛。肝藏血，心主血，肝陰血不足，可致心火亢盛，心火亢盛可耗傷肝陰。腎藏精，肝陰虧損，下竭腎陰，水不涵木，肝陽亢盛。天牛止眩膠囊重在治肝，兼顧心、腎，共奏養(yǎng)肝柔肝、平肝潛陽、利尿定眩之效。

前期研究發(fā)現(xiàn)，天牛止眩膠囊可通過下調(diào)心肌組織Toll樣受體（Toll-like?receptor，TLR）2、TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)，從而抑制核因子κB（nuclear?factor-κB，NF-κB）活化，達(dá)到降血壓、改善高血壓所致的靶器官損傷、心室重構(gòu)等作用[6]。天牛止眩膠囊可改善EH患者的胰島素抵抗，減少EH患者的危險(xiǎn)因素，降低其危險(xiǎn)分層[4-5]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，天麻素通過一氧化氮（nitric?oxide，NO）/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble?guanylate?cyclase，sGC）/環(huán)磷酸鳥苷（cyclic?guanosine?monophosphate，cGMP）介導(dǎo)的途徑參與內(nèi)皮依賴性舒張[8]。酸棗仁皂苷通過內(nèi)皮細(xì)胞通道增加Ca2+內(nèi)流誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial?nitric?oxide?synthase，eNOS）激活，并通過打開內(nèi)皮細(xì)胞BKCa和KATP通道誘導(dǎo)超極化降低血管張力、保護(hù)內(nèi)皮功能[9]。菊花的主要提取物黃酮類化合物可調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制腸源性脂多糖/TLR4通路的激活，改善血管內(nèi)皮功能，起到降壓作用[10]。漢防己中所含的粉防己堿可通過抑制HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性、活性氧生成和谷胱甘肽耗竭，有效緩解氧化損傷，改善氧化應(yīng)激[11]。懷牛膝可通過調(diào)節(jié)表皮生長因子受體和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激活eNOS，增加NO的產(chǎn)生，舒張血管[12]。另外，懷牛膝可下調(diào)巨噬細(xì)胞中的NF-κB和活化蛋白-1（activating?protein-1，AP-1）抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible?nitric?oxide?synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶2、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[13]。

筆者采用生物信息學(xué)技術(shù)及分子對(duì)接方法，對(duì)天牛止眩膠囊治療EH進(jìn)行分子機(jī)制方面的探討。初步篩選出天牛止眩膠囊調(diào)控EH的主要活性成分為槲皮素、山柰酚。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，舒張血管平滑肌，改善血管內(nèi)皮功能障礙，起到調(diào)節(jié)血壓的作用[14]。其機(jī)制可能與槲皮素可顯著抑制NO、iNOS、IL-6、NF-κB的核易位、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和c-Jun?N末端激酶的產(chǎn)生有關(guān)[15]。槲皮素還可抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[16]。研究證實(shí)山柰酚有利尿和腎臟保護(hù)作用；山柰酚可通過NO/cGMP/cGMP依賴性蛋白激酶途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管松弛[17]。分子對(duì)接結(jié)果證實(shí)，槲皮素、山柰酚等活性成分能以疏水鍵、氫鍵與核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接結(jié)合，且結(jié)合強(qiáng)度較高。

天牛止眩膠囊調(diào)控EH的主要靶點(diǎn)與炎癥應(yīng)答、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞凋亡、血管重塑等有關(guān)，涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、松弛素等多條信號(hào)通路。研究表明，上述通路廣泛參與高血壓的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫介導(dǎo)和血管內(nèi)皮功能障礙，并與內(nèi)皮損傷介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓導(dǎo)致的心室重構(gòu)及心肌纖維化有關(guān)[18-21]。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析天牛止眩膠囊調(diào)控EH的機(jī)制。結(jié)果表明天牛止眩膠囊體現(xiàn)多通路、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用調(diào)控血壓的特點(diǎn)，分子對(duì)接方法驗(yàn)證結(jié)果符合預(yù)期。

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