朱培英,冉李艷,楊莎莎,施徐森,李文貴
( 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650201 )
豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)又稱豬丁型冠狀病毒,為套式病毒目(Niovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒亞科(Coronavirinae)、德爾塔冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)成員[1]。PDCoV 最早于2012年在香港的豬直腸拭子中檢測到,2014年初在美國俄亥俄州豬場暴發(fā),隨后在加拿大、韓國、泰國、老撾、越南及中國大陸的養(yǎng)豬場中均有PDCoV 檢出[2]。PDCoV 是引起豬群腹瀉的重要病原之一,主要通過胃腸道傳播并迅速蔓延。感染PDCoV 主要的臨床表現(xiàn)是水樣腹瀉、嘔吐和脫水;病變主要位于小腸,尤其是空腸和回腸,特點(diǎn)是腸壁變薄,腸道內(nèi)充滿氣體和黃色液體,腸黏膜呈串狀充血[3-4]。哺乳仔豬感染PDCoV 后死亡率高,生長豬和成年豬感染后死亡率低。
2021年,有研究發(fā)現(xiàn)3名患有急性未分化發(fā)熱性疾病的海地兒童血漿樣品中存在PDCoV,這是首次在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病毒,給動(dòng)物和人類健康安全帶來了巨大威脅[5]。由于PDCoV致病機(jī)制尚未明確,缺乏疫苗和特效藥,成為當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)疫病防控難點(diǎn)。本文從PDCoV 各蛋白出發(fā),探討該病毒如何通過細(xì)胞膜上的受體入侵細(xì)胞,維持自身增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬,并通過復(fù)雜的組合機(jī)制以及細(xì)胞分子和宿主蛋白參與致病過程,以期為PDCoV的防治方法和疫苗研發(fā)提供參考。
PDCoV 是一種含囊膜的單股正鏈RNA 病毒,囊膜外有冠狀棘突,病毒顆粒大小為60~180 nm。PDCoV基因組全長約25.4 kb,GC含量約43%[6],基因結(jié)構(gòu)包含5'和3'非翻譯區(qū)及至少7個(gè)開放性閱讀框,分別編碼多聚酶蛋白(polymerase protein)1a/1b、纖突蛋白(spike,S)、膜蛋白(envelope,E)、膜蛋白(membrance,M)、核衣殼蛋白(nucleocapsid,N)、非結(jié)構(gòu)蛋白6(nonstructural protein 6,NS6)及非結(jié)構(gòu)蛋白7(nonstructural protein 7,NS7)。目前對PDCoV 的結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白以及輔助蛋白的功能只有初步的研究,仍需進(jìn)一步探索。
1.1.1 S蛋白
S 基因全長3 483 nt,編碼1 161 個(gè)氨基酸。S 基因是PDCoV 纖突蛋白基因,是一種同源三聚體,每個(gè)單體分為兩個(gè)區(qū)域,即S1和S2。S1蛋白是球形結(jié)構(gòu),包含兩個(gè)獨(dú)立的功能亞域N-末端(S1-NTD)、C-末端(S1-CTD)和相應(yīng)的受體結(jié)合域(RBD)。S1可以與宿主細(xì)胞膜結(jié)合[7],S2是高度保守的螺旋,包括兩個(gè)七肽重復(fù)區(qū)(HR1 和HR2)、一個(gè)跨膜區(qū)(TM)和一個(gè)融合肽區(qū)(FP)。S2的羧基末端構(gòu)成了刺狀蛋白的莖,參與病毒和宿主細(xì)胞膜的融合。S 基因變異較大,且變異速度較快,是唯一一個(gè)負(fù)責(zé)進(jìn)入細(xì)胞的病毒膜蛋白,與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合,之后介導(dǎo)病毒與細(xì)胞融合,導(dǎo)致機(jī)體患病[8]。
張家林[9]研究表明,在內(nèi)吞體中CTSL和CTSB的切割下,S 蛋白活化暴露出S2 N 端的融合肽;融合肽插入內(nèi)吞體膜,導(dǎo)致病毒囊膜與內(nèi)吞體膜融合,病毒釋放進(jìn)入細(xì)胞,之后開始新一輪的復(fù)制增殖。此外,在細(xì)胞膜表面外源添加胰酶的處理下,S蛋白也被切割活化,導(dǎo)致病毒囊膜與細(xì)胞膜融合,病毒由此入侵細(xì)胞。Dong 等[10]研究發(fā)現(xiàn),PDCoV的S蛋白與其他冠狀病毒具有相同的功能,在病毒與宿主結(jié)合和產(chǎn)生中和抗體方面發(fā)揮重要作用,是冠狀病毒的主要抗原蛋白,也是新疫苗研究的首選蛋白。
1.1.2 E蛋白
E 基因全長252 nt,編碼84 個(gè)氨基酸,位于膜表面,是PDCoV基因組中最小的結(jié)構(gòu)蛋白。目前對PDCoV E蛋白的研究報(bào)道很少,根據(jù)其他冠狀病毒E蛋白的相關(guān)研究可知其含量很低,但對病毒的組裝、出芽和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸具有一定作用,且這些作用可能與病毒的致病機(jī)制存在某些關(guān)聯(lián)。病毒組裝時(shí),E 蛋白與M 蛋白相互作用形成復(fù)合體,輔助M蛋白進(jìn)入病毒的包膜結(jié)構(gòu)內(nèi)[11]。
1.1.3 M蛋白
M 基因全長654 nt,編碼218 個(gè)氨基酸,位于囊膜表面,是病毒囊膜表面相對豐富的跨膜蛋白,而且相對保守,可作為靶蛋白建立檢測PDCoV 抗體的間接ELISA 方法[12]。M 蛋白在保護(hù)機(jī)體和介導(dǎo)疾病過程中發(fā)揮重要作用,主要參與營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸、形成新病毒顆粒的包膜和病毒顆粒釋放。
1.1.4 N蛋白
N 基因全長1 026 nt,編碼342 個(gè)氨基酸,可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答抗原蛋白。通過對比不同毒株N 蛋白氨基酸可知N蛋白高度保守(97.1%~100.0%)[13]?;诖耍S多研究建立了針對PDCoV N 蛋白的檢測方法。如朱小甫等[14]、黃海鑫[15]、蘇紅等[16]分別建立不同基于PDCoV N 基因的RT-nPCR 檢測方法,對各地區(qū)豬群PDCoV 感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。
1.2.1 ORF1a、ORF1b蛋白
與其他冠狀病毒類似,PDCoV 的ORF1a、ORF1b 可編碼兩個(gè)多聚蛋白(pp1a、pp1b),pp1a 和pp1b 可被蛋白酶切割水解加工產(chǎn)生15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1~NSP15),一些非結(jié)構(gòu)蛋白已被證明參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。如NSP15 以二聚體發(fā)揮酶活的作用機(jī)制,能夠特異性切割雙鏈或單鏈核苷酸尿嘧啶,參與病毒復(fù)制過程,是病毒重要的毒力蛋白[17]。NSP3 編碼木瓜樣蛋白酶,而NSP5 編碼3C 樣蛋白酶,兩者均在切割和加工多聚蛋白的過程中發(fā)揮作用[18]。NSP12是病毒負(fù)鏈RNA合成的過程中不可或缺的RNA聚合酶,NSP14 具有N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性和核酸外切酶活性,兩者共同參與了病毒蛋白水解與基因組RNA的復(fù)制。
1.2.2 輔助蛋白
盡管輔助蛋白對冠狀病毒的復(fù)制并非必不可少,但其已被證明在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、致病機(jī)制和毒力方面發(fā)揮重要作用。因此,鑒定和研究輔助蛋白可提供關(guān)于其在病毒生命周期中的具體功能的信息。Fang等[19]發(fā)現(xiàn),輔助蛋白NS6 過表達(dá)通過與RIG-I/MDA5 相互作用顯著抑制仙臺病毒誘導(dǎo)的β 干擾素產(chǎn)生,以及轉(zhuǎn)錄因子IRF3 和NF-κB的激活。Co-IP競爭性試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了NS6能夠顯著減弱RIG-I/MDA5 與dsRNA 的結(jié)合,表明PDCoV NS6 采用了一種新的免疫抑制策略,抑制RLRs 介導(dǎo)IFN-β 產(chǎn)生。上述結(jié)果表明,NS6是PDCoV 的一個(gè)重要毒力因子,在病毒復(fù)制和致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,因此缺乏輔助NS6蛋白的PDCoV可能是一個(gè)潛在的疫苗候選者。還有研究分析了與NS6相互作用的病毒編碼蛋白和宿主蛋白,結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明NS6在病毒復(fù)制和致病機(jī)制中的作用,為PDCoV防控和藥物靶點(diǎn)篩選提供理論依據(jù)。
此外,NS7 也是PDCoV 的輔助蛋白,Choi 等[20]研究發(fā)現(xiàn),NS7 蛋白能夠減少大鼠輔肌動(dòng)蛋白α4(α-actinin-4,ACTN4)的表達(dá)。許多病毒操縱肌動(dòng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞,而ACTN4是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中一種高度保守的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,具有多種調(diào)控作用,可激活各種轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB),NS7蛋白可能參與了這一過程[21-22]。
已有研究發(fā)現(xiàn),病毒尖峰(S)糖蛋白的激活會觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶,確定了PDCoV進(jìn)入宿主細(xì)胞的兩條途徑:細(xì)胞表面的胰蛋白酶和內(nèi)體中的組蛋白酶L(CTSL)、組蛋白酶B(CTSB)。采用內(nèi)吞體酸化抑制劑(Baf-A1)處理細(xì)胞可完全抑制PDCoV 進(jìn)入;切斷siRNA 介導(dǎo)的CTSL 或CTSB則可顯著減少病毒感染,結(jié)果表明PDCoV可通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。
此外,使用胰蛋白酶處理細(xì)胞會導(dǎo)致S蛋白的裂解和激活,使PDCoV直接從細(xì)胞表面進(jìn)入宿主細(xì)胞[8,23]。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn),豬氨基肽酶N(pAPN)通過內(nèi)吞途徑促進(jìn)PDCoV 入侵細(xì)胞并完成復(fù)制周期,闡明了pAPN 促進(jìn)PDCoV入侵細(xì)胞及復(fù)制的分子機(jī)制。
目前對PDCoV 致病機(jī)制的研究主要限于天然免疫。天然免疫是身體對入侵的病原微生物的第一道防線,主要由天然免疫分子介導(dǎo),清除和消滅病原體。在眾多天然免疫分子中,干擾素是一種具有廣譜抗病毒活性的細(xì)胞因子。干擾素的抗病毒作用是通過與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)信號通路(JAK-STAT),并通過一個(gè)放大的信號級聯(lián)激活干擾素相關(guān)刺激基因(ISG)的表達(dá)。在長期適應(yīng)宿主的進(jìn)化過程中,病毒逐漸獲得了中和天然宿主免疫的能力,并以免疫逃逸的形式更好地適應(yīng)宿主細(xì)胞。當(dāng)PDCoV 病毒介導(dǎo)細(xì)胞受體進(jìn)入靶細(xì)胞后,其基因組RNA通過病毒-宿主膜融合釋放到細(xì)胞質(zhì)中(PDCoV間接影響宿主細(xì)胞抗病毒信號級聯(lián)反應(yīng)見圖1)[25]。在細(xì)胞因子誘導(dǎo)階段,內(nèi)體TLR、胞質(zhì)RIG-I 和MDA5 均可感覺到病毒來源的RNA基因組和其他復(fù)制的RNA中間體的存在。這些受體對病毒來源的RNA進(jìn)行識別并激活一系列信號分子,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF1、IRF3 和IRF7 的核轉(zhuǎn)位。在細(xì)胞核內(nèi),這些轉(zhuǎn)錄因子與其各自的PRD區(qū)域結(jié)合,驅(qū)動(dòng)Ⅰ型和Ⅲ型IFN 以及促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生,并被分泌到細(xì)胞外。之后在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)階段,Ⅰ型和Ⅲ型IFN以自分泌和旁分泌的方式與其同源受體結(jié)合,誘導(dǎo)JAK-STAT通路激活,導(dǎo)致ISGF3 復(fù)合體的核轉(zhuǎn)位,并產(chǎn)生干擾素刺激基因(ISGs),加快了PDCoV的復(fù)制。
圖1 PDCoV間接影響宿主細(xì)胞抗病毒信號級聯(lián)反應(yīng)Fig.1 PDCoV indirectly affects antiviral signaling cascade in host cells
有研究表明,PDCoV nsp5具有拮抗IFN-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用,并且該抑制作用依賴其蛋白酶活性[26]。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,PDCoV nsp5通過裂解STAT2抑制IFN-I 信號,同時(shí)感染該病毒內(nèi)源性STAT2 也被裂解,所有STAT2 裂解的產(chǎn)物失去了誘導(dǎo)IFN-I 的能力。上述結(jié)果表明,PDCoV nsp5 對IFN-I 信號具有拮抗作用。此外,PDCoV的結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白可通過干預(yù)雙鏈RNA 及蛋白激酶R活化蛋白與RIG-Ⅰ結(jié)合,以及抑制RIG-Ⅰ的K63 多聚泛素化,拮抗IFN-β 產(chǎn)生[27]。目前對PDCoV 致病機(jī)制的研究角度單一且數(shù)量較少,有待從多個(gè)角度進(jìn)一步深入探索。
細(xì)胞自噬是指細(xì)胞面臨營養(yǎng)缺乏、應(yīng)激、病原微生物入侵或缺乏生長因子時(shí),可能在細(xì)胞質(zhì)中形成自噬囊泡,包裹外來的病原微生物。之后損壞的細(xì)胞器和一些蛋白質(zhì)被運(yùn)送到溶酶體,形成自噬溶酶體,最終消化包裹的物質(zhì),并再生細(xì)胞器穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。病毒和細(xì)胞自噬之間的聯(lián)系引起了廣泛關(guān)注,已證明體內(nèi)許多免疫相關(guān)因素通過自噬抵抗病毒感染,但許多病毒也可利用細(xì)胞自噬加強(qiáng)其復(fù)制。此外,細(xì)胞凋亡是一個(gè)細(xì)胞主動(dòng)終止其生命的過程,對維持細(xì)胞的平衡至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡可由多種細(xì)胞信號觸發(fā),包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加,氧化損傷導(dǎo)致的活性氧(如羥基自由基)積累,以及毒素、一氧化氮(NO)、生長因子和病毒感染等激素刺激,可在各種應(yīng)激條件下發(fā)生,并在抵抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)互動(dòng)的過程,在此過程中,細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡的過程消除病毒進(jìn)而抵抗病毒感染,而病毒可延長細(xì)胞的存活時(shí)間,使病毒后代的數(shù)量最大化,或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,促進(jìn)病毒后代的釋放和傳播,使其能夠繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞。
袁為峰[28]通過構(gòu)建PDCoV 結(jié)構(gòu)蛋白N、M、E 和非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp6 的真核表達(dá)質(zhì)粒,證明了PDCoV 結(jié)構(gòu)蛋白N和非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp6 均可顯著上調(diào)自噬基因LC3-Ⅱ的表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)自噬和PDCoV 感染之間的關(guān)系,試驗(yàn)使用自噬促進(jìn)劑雷帕霉素和自噬抑制劑氯喹預(yù)處理LLCPK1細(xì)胞和IPEC-J2細(xì)胞。結(jié)果表明,PDCoV N蛋白的表達(dá)水平隨著LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平增加,而氯喹可通過自噬途徑抑制PDCoV 復(fù)制,研究結(jié)果為進(jìn)一步探索病毒與細(xì)胞自噬間的關(guān)系提供了更多理論依據(jù)。
PDCoV 通過糞便-口腔途徑傳播[28],并在小腸絨毛上皮的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制,被感染的小腸腸道細(xì)胞發(fā)生廣泛的空泡化并與絨毛上皮分離,導(dǎo)致絨毛萎縮。腸道細(xì)胞的大量損失阻礙了小腸對營養(yǎng)物質(zhì)和電解質(zhì)的吸收和消化,導(dǎo)致仔豬吸收不良和消化不良引起的腹瀉,造成致命的脫水。這種病理生理變化(包括腸細(xì)胞的空泡變性和最終死亡)與病毒的細(xì)胞溶解作用引起的壞死有關(guān),而非細(xì)胞凋亡。Jang 等[29]研究表明,PDCoV 只能在體外誘導(dǎo)ST 豬睪丸細(xì)胞和LLC豬腎細(xì)胞的凋亡,不能誘導(dǎo)體內(nèi)感染的腸道細(xì)胞發(fā)生凋亡。Lee 等[30]闡述了PDCoV 感染后細(xì)胞凋亡過程的潛在機(jī)制,指出使用PAN-caspase抑制劑可抑制PDCoV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,減少PDCoV 的復(fù)制,提示PDCoV 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能伴隨著caspase 的激活。此外,PDCoV 感染需要激活caspase-9 啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子負(fù)責(zé)內(nèi)在的線粒體凋亡途徑。試驗(yàn)結(jié)果表明,PDCoV感染導(dǎo)致Bax介導(dǎo)的線粒體外膜通透性(MOMP),導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素c(Cytc)特異性地重新定位到細(xì)胞質(zhì)中。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放的抑制劑環(huán)孢素A(CsA)可顯著抑制PDCoV 引發(fā)的細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制。此外,在CsA 存在下,PDCoV 感染細(xì)胞中細(xì)胞色素c 的釋放被完全抑制,提示MPTP 在PDCoV 感染的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用。綜上所述,PDCoV感染通過Bax募集或MPTP開放刺激MOMP,從而允許導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的Cytc 釋放到細(xì)胞質(zhì)中,促進(jìn)病毒的體外復(fù)制。
近年來,新發(fā)冠狀病毒如SADS-CoV、MERS 以及2019 年暴發(fā)的SARS-CoV-2 給人類和動(dòng)物帶來了嚴(yán)重的健康問題和經(jīng)濟(jì)損失。PDCoV 屬于冠狀病毒科中冠狀病毒亞科的三角洲冠狀病毒屬,可感染鳥類和哺乳動(dòng)物,是僅次于PEDV的豬腸道致病病毒,了解PDCoV編碼蛋白的功能以及病毒如何調(diào)控宿主共能、利用宿主機(jī)制逃避免疫反應(yīng),有助于明確病毒的致病機(jī)制和商品化疫苗研發(fā),減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。