白藜蘆醇調(diào)控ROS/NLRP3/Caspase1 通路介導(dǎo)的細胞焦亡對重癥肺炎大鼠肺損傷的保護作用

盧晶 苑萌 馮學(xué)輝 劉佳麗

重癥肺炎由普通肺炎發(fā)展而來，該病進一步引起肺損傷、呼吸衰竭等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后［1?2］。目前臨床上對重癥肺炎的治療主要以抗菌藥物干預(yù)為主，雖能減輕機體炎性反應(yīng)，緩解呼吸困難癥狀，但臨床療效仍不理想。重癥肺炎是一種混合感染的疾病，容易引起引起致病菌耐藥性，一旦出現(xiàn)耐藥，可能會加快病情的發(fā)展，甚至危及患者的生命［3］。白藜蘆醇是一種多酚物質(zhì)，主要存在于葡萄、藜蘆、桑葚等植物中，具有廣泛的抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的作用［4］。相關(guān)文獻顯示，肺損傷可促進機體活性氧簇（reactive oxy?gen species，ROS）的產(chǎn)生，ROS 可以通過激活NOD樣受體蛋白3（NOD?likereceptorthermalproteindo?main3，NLRP3）炎癥小體，促進機體釋放半胱氨酸蛋白酶?1（cysteinylaspartatespecificproteinase1，Cas?pase?1），進而導(dǎo)致細胞焦亡［5］。本研究將建立重癥肺炎大鼠模型，探討白藜蘆醇對ROS/NLRP3/Caspase1 通路及其介導(dǎo)的細胞焦亡的影響，探討其治療重癥肺炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

50只雄性清潔級健康SD 大鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心。動物批號：No.44007200026770。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進行試驗。動物飼養(yǎng)與實驗嚴(yán)格按照動物試驗倫理進行。

1.1.2 主要實驗儀器

光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）、血氣分析儀（武漢明德生物科技股份有限公司）、全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、石蠟切片機（LEICA 公司）；石蠟包埋機（LEICA 公司）。

1.1.3 主要實驗藥物及試劑

白藜蘆醇、0.9%生理鹽水、戊巴比妥、二甲苯、蘇木精?伊紅（HE）染色試劑盒、ROS 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）、NLRP3 抗體、Caspase?1抗體、細胞焦亡關(guān)鍵蛋白Gasdermin D 的N 末端片段（GSDMD?N）抗體、β 肌動蛋白基因（β?actin）抗體（兔多克隆抗體，IgG，稀釋度1∶20 000）、蛋白裂解液（RIPA Lysis Buffer，RIPA）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組

40 只SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，經(jīng)氣管穿刺0.30 mL 肺炎克雷伯菌液，7 d 后大鼠出現(xiàn)活動和進食明顯減少，口鼻分泌物增多，現(xiàn)呼吸困難、喘促、肺部濕啰音等癥狀時，視為建模成功。10 只SD 大鼠正常飲食喂養(yǎng)5 周后，經(jīng)腹腔注射生理鹽水。將建模成功的40 只SD 大鼠依據(jù)隨機數(shù)字法分為4 組，即模型組、白藜蘆醇低劑量組（6.5 mg/kg 灌胃）、中劑量組（13.0 mg/kg 灌胃）、高劑量組（26.0 mg/kg 灌胃）各10 只。

1.2.2 給藥方法

白藜蘆醇低、中、高劑量組大鼠分別給予6.5 mg/kg、13.0 mg/kg 和26.0 mg/kg 白藜蘆醇；給藥方式均為灌胃給藥，空白組和模型組灌胃生理鹽水10 mg/kg，每日1 次，連續(xù)灌胃8 周。

1.2.3 標(biāo)本采集

8 周后，將大鼠麻醉，將大鼠平躺置于動物手術(shù)臺上，腹部消毒，用剪刀沿著腹中線切開腹腔，露出腹主動脈，用10 mL 的無菌注射器慢慢抽回血液處死大鼠。取大鼠血液15 mL，采用高速冷凍離心機以3 000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm），取上清液放于-80℃超低溫冰箱。用剪刀沿胸切口，一部分肺組織甲醛中固定，用于HE 染色；一部分用于Western 印跡法檢測。

1.2.4 相關(guān)生化指標(biāo)檢測方法

取大鼠上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測肺組織中白細胞介素?1β（IL?1β）、白細胞介素?6（IL?6）、腫瘤壞死因子?α（TNF?α）水平。

1.2.5 大鼠肺組織HE 染色

包埋切片。用中性甲醛固定大鼠肺組織24 h 以上，脫水，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，在60℃下烘烤40 min，脫蠟直至水化。往切片中加入蘇木素染色5 min，再用清水沖洗5 min；用1%鹽酸乙醇將其浸漬5 s；用伊紅溶液浸泡3 min，將其分別放入二甲苯中透明10 min；用中性樹脂密封，放在玻片架上，干燥后于顯微鏡下觀察。

1.2.6 蛋白印跡法

取冷凍后的SD 大鼠肺組織，稱量后，加入200 μ的LRIPA 將其稀釋，提取總蛋白，用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。用50 μg 蛋白行電泳、電膜反應(yīng)，5%脫脂乳于室溫下封閉過夜，再加入一抗［ROS、NLRP3、Caspase1、GSDMD?N 以及1∶3 000 的β?ac?tin 內(nèi)參］，4℃條件下孵育過夜，洗膜后加入（1∶2 000）二抗再培養(yǎng)2 h，用電化學(xué)發(fā)光法（Electrochemiluminescence，ECL）熒光顯影，觀察、拍照，并用Image J 軟件對其進行分析檢測電泳條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS?t 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SD 大鼠相關(guān)血清因子水平比較

干預(yù)治療8 周后，模型組TNF?α、IL?6、IL?1β、ROS 水平>白藜蘆醇低劑量組>白藜蘆醇中劑量組>白藜蘆醇高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組SD 大鼠相關(guān)血清因子水平比較（）Table 1 Comparison of Serum Factor Levels in SD Rats（）

表1 各組SD 大鼠相關(guān)血清因子水平比較（）Table 1 Comparison of Serum Factor Levels in SD Rats（）

注：與空白組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05；與低劑量組比，cP<0.05；與中劑量組比，dP<0.05。

2.2 肺組織病理學(xué)變化

與空白組SD 大鼠比，模型組SD 大鼠肺組織明顯損傷，且有大量炎癥細胞浸潤；模型組SD 大鼠比，白藜蘆醇低、中、高劑量組SD 大鼠肺泡內(nèi)滲出、炎癥細胞浸潤等癥狀均明顯改善。見圖1。

圖1 SD 大鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×200）Figure 1 Pathological changes of lung tissue in SD rats（HE，×200）

2.3 各組SD 大鼠肺組織中NLRP3、Caspase1、GSDMD?N 蛋白水平比較

干預(yù)治療8 周后，模型組NLRP3、caspase?1 和GSDMD?N 水平>白藜蘆醇低劑量組>白藜蘆醇中劑量組>白藜蘆醇高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖2。

圖2 蛋白印跡圖Figure 2 Western blotting map

表2 各組SD 大鼠肺組織中NLRP3、Caspase1、GSDMD?N蛋白水平比較（）Table 2 Comparison of NLRP3，Caspase1 and GSDMD?N protein levels in lung tissue of SD rats in each group（）

表2 各組SD 大鼠肺組織中NLRP3、Caspase1、GSDMD?N蛋白水平比較（）Table 2 Comparison of NLRP3，Caspase1 and GSDMD?N protein levels in lung tissue of SD rats in each group（）

注：與空白組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05；與低劑量組比，cP<0.05；與中劑量組比，dP<0.05。

3 討論

肺炎是由細菌、病毒感染或病毒和細菌混合感染引起的肺泡、肺間質(zhì)炎癥性疾病，重癥肺炎是肺炎進一步惡化而來，重癥肺炎患者的機體炎癥程度較高，通常還會出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥、急性呼吸衰竭等臨床表現(xiàn)［6?7］。

本研究通過構(gòu)建大鼠重癥肺炎模型，觀察白藜蘆醇對重癥肺炎大鼠肺損傷的保護作用以及ROS/NLRP3/Caspase1 通路在其中作用。IL?1β 能促進細胞內(nèi)各種細胞因子的表達，TNF?α、IL?6 能促進細胞內(nèi)各種炎癥因子的激活，上述炎癥指標(biāo)是細胞焦亡通路的下游作用因子，其在細胞外能聚集炎癥細胞，加快炎癥反應(yīng)，加劇肺組織損傷。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)治療8 周后，與模型組比較，白藜蘆醇各劑量組TNF?α、IL?6、IL?1β、ROS 水平下降；且白藜蘆醇劑量越高降低幅度越大。TNF?α、IL?1β、IL?6 是重癥肺炎發(fā)生的主要炎性因素，其發(fā)生與NLRP3 有一定關(guān)系。NLRP3 炎癥小體在炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大激活中的調(diào)控作用已引起人們的注意，NLRP 3 和Caspase 1 是一類模式識別受體，與病原菌結(jié)合后在細胞內(nèi)促使Caspase1 活化，活化的Caspase1 將TNF?α、IL?1β、IL?6 前體分解成促炎生物活性成熟體，從而參與炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大過程［1］。洪蕾等［8］研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過下調(diào)炎癥因子的表達，減輕機體炎癥反應(yīng)來修復(fù)細胞損傷。相關(guān)文獻報道，白藜蘆醇可明顯減少大鼠肺組織中IL?18、IL?1β 水平，并通過抑制NLRP3 的分泌，緩解肺組織的炎癥反應(yīng)［9］。黃艷生等［10］研究顯示，海水淹溺大鼠出現(xiàn)的呼吸衰竭情況時使用白藜蘆醇的預(yù)處理可以快速緩解起癥狀，改善大鼠的缺氧狀態(tài)，促進大鼠的康復(fù)。干預(yù)治療8 周后，白藜蘆醇低、中、高劑量組SD 大鼠肺組織中肺泡內(nèi)滲出、炎癥細胞浸潤等癥狀均比模型組明顯改善，提示白藜蘆醇能夠有效改善病理學(xué)病變及肺功能。原因考慮為，在肺損傷疾病中，白藜蘆醇對大鼠肺組織保護很可能與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)，通過減少小鼠肺內(nèi)炎性細胞浸潤，進而減少肺組織損傷［11］。何瓊等［12］研究也證實了，用白藜蘆醇預(yù)處理的急性肺損傷小鼠肺組織肺損傷更輕。

細胞焦亡是一種依賴于Caspase1 活性的消皮素蛋白介導(dǎo)的細胞凋亡過程，在細胞凋亡過程中中，炎癥小體NLRP3 的活化起著至關(guān)重要的作用。GSDMD?N 是一種有效的炎性小體活化及細胞焦亡的標(biāo)志物，是真正引起細胞焦亡的功能蛋白，其表達水平增加，可誘發(fā)肺組織細胞焦亡，導(dǎo)致肺損傷［13］。研究結(jié)果還顯示，干預(yù)治療8 周后，相較于模型組，白藜蘆醇各劑量組NLRP3、caspase?1和GSDMD?N 蛋白水平顯著下降，白藜蘆醇劑量越高下降幅度越大。白藜蘆醇能通過抑制NLRP3的氧化反應(yīng)，減少其氧化損傷，從而控制炎癥小體NLRP3、caspase?1 的含量［14］。白藜蘆醇作為具有抗炎、抗菌、抗炎等多種活性物質(zhì)，被證實能夠?qū)χ嗵撬碌姆紊掀ぜ毎雇銎鹨欢ūＷo作用，且白藜蘆醇在肺炎模型中同樣具有抗炎活性。

綜上所述，白藜蘆醇可改善重癥肺炎大鼠肺損傷，其機制可能與通過下調(diào)ROS/NLRP3/Caspase1 信號通路表達水平，抑制炎癥因子和細胞焦亡的發(fā)生相關(guān)。