厄洛替尼衍生物的合成及抗腫瘤活性研究

趙智偉 田思琪 杜宇 王春光 陳曉杰 郝雪琴

摘 要：以2-氨基-4，5-雙（2-甲氧基乙氧基）苯甲酸乙酯鹽酸鹽為起始原料，經(jīng)過環(huán)合、氯化、取代得到厄洛替尼，然后在其端基炔結(jié)構(gòu)上通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與芐基疊氮反應(yīng)得到4種1，2，3-三氮唑類化合物，其中化合物5a對(duì)肺癌細(xì)胞HCC827及其吉非替尼耐藥細(xì)胞的HCC827GR具有一定的抑制效果，優(yōu)于厄洛替尼，并且引起HCC827細(xì)胞阻滯在G2/M期，引起HCC827GR細(xì)胞在G0/G1期阻滯.

關(guān)鍵詞：厄洛替尼；1，2，3-三氮唑；抗腫瘤藥物；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)：R914.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

厄洛替尼（erlotinib，圖1）是一款經(jīng)典的表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）小分子抑制劑，于2004年被美國(guó)食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市，作為一種口服的可逆性競(jìng)爭(zhēng)性表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitors，EGFR-TKI），能夠與突變的EGFR的三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）結(jié)合口袋結(jié)合，阻礙EGFR磷酸化，從而抑制了下游信號(hào)通路激活.其最初被批準(zhǔn)用于治療經(jīng)傳統(tǒng)化療失敗的晚期非小細(xì)胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC），與傳統(tǒng)化療藥物的臨床治療相比，厄洛替尼治療后可以使患者中位生存期從4月提升到40月以上［1］，并且在無進(jìn)展生存率、治療有效率、生活質(zhì)量和耐受性方面均有更好的表現(xiàn)［2］.盡管厄洛替尼在NSCLC靶向治療中顯著延緩了疾病的進(jìn)展，但是與另外兩種第一代EGFR抑制劑吉非替尼（gefitinib，圖1）［3-4］和?？颂婺幔╥cotinib，圖1）［5-6］一樣，在用藥治療約9 ～ 14月后，耐藥性問題逐漸顯現(xiàn)，幾乎所有的腫瘤再次進(jìn)入進(jìn)展期，因此如何解決厄洛替尼耐藥性問題一直是藥學(xué)工作者研究的重點(diǎn)［7-8］.

1，2，3-三氮唑是一種非常重要的含氮雜環(huán)化合物，由3個(gè)氮原子和2個(gè)碳原子構(gòu)建成五元雜環(huán)［9］，分子式為C2H3N3.1，2，3-三氮唑具有特殊的平面剛性結(jié)構(gòu)，因而擁有較強(qiáng)的嵌入DNA的能力，同時(shí)具有大偶極矩，能夠與不同生物靶點(diǎn)形成疏水、氫鍵、范德華力和偶極-偶極鍵等多種非共價(jià)相互作用力［10］.另外，1，2，3-三氮唑的結(jié)構(gòu)特征允許其作為酰胺、酯、羧酸、烯烴剛性類似物等的電子等價(jià)取代物，因此具有廣譜的生物活性，常作為重要的分子砌塊用于活性化合物的合成，如制備抗菌［11］、抗瘧［12］、抗真菌［13］、抗病毒［14］、抗結(jié)核［15］和抗癌活性化合物［16］等.在藥物化學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，有多種臨床藥物經(jīng)1，2，3-三氮唑修飾改造后增強(qiáng)了原有的生物活性或獲得了新的生物活性，例如利用抗人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）藥物齊多夫定帶有疊氮基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特性，與端基炔類化合物經(jīng)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)得到具有1，2，3-三氮唑的化合物（圖2a），對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用［17］.有課題組在苯環(huán)或苯胺結(jié)構(gòu)上引入1，2，3-三氮唑得到化合物MMG-0358和Vertex-AT［18］（圖2（b，c）），作為吲哚胺-2，3-雙加氧酶1（indoleamine-（2，3）-dioxygenase 1，IDO1）抑制劑，這兩個(gè)化合物都能夠深入到IDO1的靶點(diǎn)蛋白中，且1，2，3-三氮唑環(huán)能與靶點(diǎn)血紅素中的亞鐵離子形成氫鍵作用，三氮唑鏈接的苯環(huán)可以深入到有Cys129，Leu234和Gly262氨基酸所包圍的疏水性口袋中，其中MMG-0358苯環(huán)上的羥基可以與Ser167形成氫鍵作用；這兩個(gè)化合物都具有優(yōu)異的IDO1抑制活性，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別達(dá)到82 nmol·L-1和23 nmol·L-1［18］.

為尋找更加新型高效的對(duì)突變細(xì)胞有抑制作用的抗腫瘤藥物，本研究通過點(diǎn)擊反應(yīng)對(duì)厄洛替尼進(jìn)行了改造，與芐基疊氮類化合物反應(yīng)得到一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的厄洛替尼衍生物（圖3），希望其能夠在解決耐藥性問題方面起到作用.為了進(jìn)一步探究該新合成的化合物對(duì)肺癌細(xì)胞HCC827以及所對(duì)應(yīng)的耐藥性細(xì)胞的抑制活性，利用二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）比色法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)HCC827以及吉非替尼耐藥的HCC827GR細(xì)胞進(jìn)行了體外抗腫瘤活性檢，并以厄洛替尼作為陽性對(duì)照藥物，研究了其對(duì)這兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州予華儀器有限公司）；YRE-2020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州予華儀器有限公司）；布魯克AV400型核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；LC 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）.

厄洛替尼（99.5%，阿拉丁試劑）；2，4-二溴芐基疊氮（99.5%，阿拉丁試劑）；3-氯-4-氟芐基疊氮（99%，阿拉丁試劑）；2-氟-4-溴芐基疊氮（99%，阿拉丁試劑）；3-氯-6-氟芐基疊氮（99%，阿拉丁試劑）；五水硫酸銅（98%，國(guó)藥集團(tuán)）；抗壞血酸鈉（99%，國(guó)藥集團(tuán)）；其余試劑均為市售分析純.

1.2 合成方法

1.2.1 6，7-二甲氧乙氧基喹唑啉-4-酮的合成（化合物2）

在帶有攪拌的反應(yīng)瓶中，把2-氨基-4，5-雙（2-甲氧基乙氧基）苯甲酸乙酯鹽酸鹽（化合物1）（3.5 g，0.01 mol）加入甲酰胺100 mL中，再加入甲酸銨2 g（0.03 mol），攪拌均勻后在氮?dú)夥諊?，緩慢加熱?60 ℃，反應(yīng)約10 h，薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）監(jiān)控原料反應(yīng)完全，冷卻至室溫，向反應(yīng)液中加入乙酸乙酯100 mL和水80 mL，攪拌后分出有機(jī)相，濃縮后得到6，7-二甲氧乙氧基喹唑啉-4-酮2.1 g（化合物2），收率為71.4%;1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.97（s，1H），7.47（s，1H），7.16（s，1H），4.19～4.27（m，4H），3.70～3.74（m，4H），3.35～3.37（m，6H）.

1.2.2 4-氯-6，7-二（2-甲氧基乙氧基）喹唑啉的合成（化合物3）

在帶有攪拌的反應(yīng)瓶中，把6，7-二甲氧乙氧基喹唑啉-4-酮（化合物2）3 g（0.01 mol）和N，N-二甲基甲酰胺1 g加入到二氯亞砜30 mL中，攪拌均勻后緩慢升溫至80 ℃，反應(yīng)結(jié)束后，在0～10 ℃條件下加入飽和氫氧化鈉溶液100 mL，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH到8～9，攪拌20 min，用二氯甲烷50 mL萃取多次，合并有機(jī)相，然后用飽和食鹽水洗滌1次，再用水洗滌多次，無水硫酸鈉干燥后濃縮得到4-氯-6，7-二（2-甲氧基乙氧基）喹唑啉2.3 g（化合物3），收率為73.7%，LC-MS（ESI）：m/z 313［M+H］+.

1.2.3 N-（3-乙炔苯基）-6，7-雙（2-甲氧乙氧基）-4-喹啉胺的合成（化合物4）

在反應(yīng)瓶中，把4-氯-6，7-二（2-甲氧基乙氧基）喹唑啉（化合物3）3 g（0.01mol）加入異丙醇100 mL中，再加入間氨基苯乙炔1.3 g（0.011 mol），加熱回流，反應(yīng)3 h， TLC監(jiān)控原料反應(yīng)完全，置于0 ℃攪拌30 min，抽濾后烘干得到N-（3-乙炔苯基）-6，7-雙（2-甲氧乙氧基）-4-喹啉胺（化合物4）2.4 g，收率為61%；1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：9.48（s，1H），8.51（s，1H），8.00（s，1H），7.91（d，J=12.0 Hz，1H），7.87（s，1H），7.41（t，J=6.0 Hz，1H），7.17～7.27（m，2H），4.29～4.31（m，4H），4.21（s，1H），3.75～3.80（m，4H），3.38（s，3H），3.36（s，3H）.

1.2.4 目標(biāo)化合物的合成（以化合物5a為例）

在反應(yīng)瓶中，依次加入N-（3-乙炔苯基）-6，7-雙（2-甲氧乙氧基）-4-喹啉胺（化合物4）0.5 g，2，4-二溴芐基疊氮0.5 g，叔丁醇10 mL，水10 mL，四氫呋喃10 mL，五水硫酸銅0.25 g，抗壞血酸鈉0.5 g，在70 ℃條件下反應(yīng)，TLC監(jiān)控原料反應(yīng)完全，加入二氯甲烷20 mL，過濾反應(yīng)液，水相用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后，濃縮后用甲醇重結(jié)晶得到白色的產(chǎn)品0.47 g，收率為55.13%.化合物5a，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：9.58（s，1H），8.72（s，1H），8.49（s，1H），8.28（s，1H），7.89～7.99（m，2H），7.86（s，1H），7.64（s，2H），7.57（d，J=7.6 Hz，1H），7.47（t，J=7.9 Hz，1H），7.24（s，1H），5.70（s，2H），4.26～4.35（m，4H），3.73～3.83（m，4H），3.39（s，3H），3.36（s，3H）;13C NMR（150 Hz，DMSO-d6）：156.84，154.06，153.39，148.56，147.45，147.22，140.83，140.56，133.73，131.21，130.67，129.51，123.23，122.41，120.83，119.30，109.44，108.68，103.71，70.61，70.54，68.84，68.51，58.88，58.82，52.01.

分別采用 3-氯-4-氟芐基疊氮0.5 g，2-氟-4-溴芐基疊氮0.5 g，2-氟-6-氯芐基疊氮0.5 g替換5a合成過程中的2，4-二溴芐基疊氮0.5 g，得到化合物5b（收率為71.97%），5c（收率為70.74%），5d（收率為40.1%）.化合物5b，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.55（s，1H），8.60（s，1H），8.26（s，1H），7.90～7.95（m，2H），7.54～7.55（m，2H），7.44～7.49（m，2H），7.28～7.33（m，2H），5.75（s，2H），4.31～4.33（m，4H），3.75～3.81（m，4H），3.39（s，3H），3.37（s，3H）;13C NMR（100 Hz，DMSO-d6）：163.5，161.1，153.7，148.7，146.9，140.4，134.3，134.2，133.0，131.3，130.0，129.5，122.4，122.3，120.9，119.3，117.6，117.4，115.5，115.3，70.5，68.8，68.5，58.8，50.7.化合物5c，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.58（s，1H），8.63（s，1H），8.26（s，2H），7.91（s，1H），7.37～7.66（m，6H），5.71（s，2H），4.30～4.32（m，4H），3.77～3.79（m，4H），3.39（s，3H），3.37（s，3H）;13C NMR（100 Hz，DMSO-d6）：161.7，159.2，148.7，147.0，140.4，132.8，131.2，129.5，122.9，122.7，122.6，122.4，122.2，120.9，119.7，119.4，119.3，70.5，68.8，68.5，58.8，47.2.化合物5d，1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：9.57（s，1H），8.61（s，1H），7.89～8.23（m，3H），7.34～7.59（m，6H），5.78（s，2H），4.30～4.33（m，4H），3.77～3.81（m，4H），3.38（s，3H），3.37（s，3H）;13C NMR（100 Hz，DMSO-d6）：140.4，132.3，132.2，131.2，129.4，126.3，122.4，122.2，121.4，121.2，120.9，119.3，115.5，115.3，104.0，70.5，70.5，68.8，68.5，58.8，45.1.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布用中位數(shù)表示.組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果分析與討論

2.1 抗腫瘤活性研究

2.1.1 MTT法測(cè)定化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制

采用MTT法測(cè)試4個(gè)化合物和erlotinib對(duì)HCC827細(xì)胞和HCC827GR細(xì)胞的活性.首先收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液含量為3×107/L，96孔板中每孔加入100? μL細(xì)胞懸液（邊緣孔用無菌PBS填充）.5% CO2（體積分?jǐn)?shù)），37 ℃孵育過夜，加入濃度梯度的藥物（0，6.25，12.50，25.00，50.00 μmol/L），設(shè)5個(gè)復(fù)孔.5% CO2，37 ℃孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài).每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）.

HCC827GR細(xì)胞是HCC827細(xì)胞通過吉非替尼低濃度長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)傳代得到的對(duì)吉非替尼耐藥的細(xì)胞，HCC827細(xì)胞和HCC827GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50如表1所示，HCC827GR對(duì)吉非替尼的48 h耐藥指數(shù)達(dá)到12.06.化合物5a對(duì)HCC827細(xì)胞具有良好的活性抑制作用，IC50達(dá)到8.17 μmol/L，優(yōu)于erlotinib（IC50=11.81 μmol/L，表2）.化合物5a對(duì)HCC827GR細(xì)胞同樣具有良好的活性抑制作用，IC50達(dá)到2.38 μmol/L，優(yōu)于erlotinib（IC50＞20 μmol/L）.說明引入苯基三氮唑后，針對(duì)實(shí)體瘤抑制活性方面比對(duì)照藥物有顯著提高［19］.4種化合物中5a抗腫瘤活性最好，因此進(jìn)一步選取化合物5a研究腫瘤抑制活性.

2.1.2 化合物5a對(duì)HCC827和HCC827GR細(xì)胞周期分布的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，具體步驟如下：提前24 h將2 mL的HCC827/ HCC827GR的細(xì)胞懸液（1×105/孔）接種在6孔板中培養(yǎng)過夜；除去原始培養(yǎng)基，每孔加入2 mL含不同濃度化合物5a和erlotinib（終濃度為0，3.5，7.0，14.0，28.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基處理24 h，0.1 ％（體積分?jǐn)?shù)）DMSO（完全培養(yǎng)基稀釋）作為對(duì)照；胰蛋白酶消化、離心收集細(xì)胞，用70%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇重懸細(xì)胞，-20 ℃至少3 h；PBS洗滌細(xì)胞，加100 μL RNaseA重懸細(xì)胞，室溫放置1 h，然后用碘化丙啶（Propidium iodide，PI，最終質(zhì)量濃度1.8 μg/mL，Biolegend cat：640945）避光染色15 min；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BD FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)管中進(jìn)行檢測(cè).所有結(jié)果均使用FlowJo軟件v105.3.6進(jìn)行分析.

為了研究化合物5a和elotinib對(duì)細(xì)胞周期的影響，采用不同濃度的化合物5a或elotinib處理肺癌細(xì)胞HCC827，經(jīng)過24 h后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期（圖4）.在化合物處理24 h時(shí)，對(duì)HCC827細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，和對(duì)照相比，用5a處理時(shí)，隨著濃度升高（3.5，7.0，14.0和28.0 μmol/L），G0/G1期細(xì)胞比例變化不明顯，S期細(xì)胞比例隨著濃度的提高而減少，G2/M期細(xì)胞比例隨著濃度的提高而增大，且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性；用erlotinib處理HCC827細(xì)胞，在低濃度（3.5 μmol/L）的時(shí)候，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯減少，G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯，繼續(xù)升高濃度，細(xì)胞各個(gè)周期變化均不明顯.因此5a使HCC827細(xì)胞阻滯在G2/M期，erlotinib 對(duì)HCC827細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期.

用DMSO 作為對(duì)照，以及不同濃度的5a和erlotinib對(duì)耐藥性食管癌細(xì)胞HCC827GR進(jìn)行處理，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相.在化合物處理24 h時(shí)，對(duì)HCC827GR細(xì)胞周期檢測(cè)顯示（圖5），和對(duì)照相比，用5a處理后，隨著濃度升高（3.5，7.0，14.0和28.0 μmol/L），G0/G1細(xì)胞比例逐漸升高；S期細(xì)胞比例隨著濃度的提高逐漸減少，呈現(xiàn)濃度梯度依賴性；G2/M期細(xì)胞比例隨著濃度的提高變化不明顯；用erlotinib處理時(shí)，在低濃度（3.5μmol/L）時(shí)HCC827GR細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例有著明顯提高，后續(xù)隨著濃度提高變化不明顯；S期細(xì)胞數(shù)量比例在隨著濃度的提高而減少，呈現(xiàn)濃度梯度依賴性；G2/M期細(xì)胞比例在3.5 μmol/L時(shí)降低比較明顯，后續(xù)隨著濃度的提高而增加.因此5a和erlotinib 使HCC827GR細(xì)胞阻滯在G0/G1期.

3 結(jié) 論

本文通過對(duì)厄洛替尼進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，在其端基炔結(jié)構(gòu)上通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與芐基疊氮反應(yīng)得到4種1，2，3-三氮唑類化合物，其中化合物5a對(duì)肺癌HCC827細(xì)胞及其吉非替尼耐藥性的HCC827GR細(xì)胞具有一定的抑制效果，優(yōu)于厄洛替尼，并且對(duì)HCC827細(xì)胞在G2/M期引起阻滯，對(duì)HCC827GR細(xì)胞在G0/G1期引起阻滯.

參 考 文 獻(xiàn)

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Synthesis and antitumor activity of erlotinib derivatives

Zhao Zhiwei1a，b， Tian Siqi1a， Du Yu1a， Wang Chunguang2， Chen Xiaojie1a，b， Hao Xueqin1a，b

（1. a. School of Basic Medical Sciences; The First Affiliated Hospital; b. Henan Provincial Key Laboratory of Tumor Epigenetics，

Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China; 2. Henan Wanliu Biotechnology Co.， Ltd.， Luoyang 471000， China）

Abstract： Erlotinib was obtained from 2-amino-4，5-bis（2-methoxyethoxy）ethyl benzoate hydrochloride by cyclization， chlorination and substitution. Then four erlotinib derivatives were designed and synthesized from erlotinib with azido compounds via click reaction. Their anti-tumor activity were evaluated against HCC827 and HCC827GR tumor cells. Compound 5a

showed a certain inhibitory effect on non-small cell lung cancer HCC827 cell and corresponding gefitinib-resistant cell HCC827GR cell， which was superior to erlotinib. Compound 5a

also can block HCC827 cells in G2/M phase and HCC827GR cells in G0/G1 phase.

Keywords： erlotinib; 1，2，3-triazole; antitumor drugs; cell cycle

［責(zé)任編校 趙曉華 陳留院］

收稿日期：2022-04-27;修回日期：2022-11-10.

基金項(xiàng)目：河南省自然科學(xué)基金（182300410370）;河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102310362）.

作者簡(jiǎn)介：趙智偉（1980-），男，河南洛陽人，河南科技大學(xué)副主任醫(yī)師，主要從事抗腫瘤藥物合成研究，E-mail：1980zhaozhiwei@sina.com.

通信作者：郝雪琴，E-mail：haoxueqin@haust.edu.cn.