外泌體包裹的miR-19b抑制EV71復制的影響

李艷梅 程俠菊 王燕

摘 要：［目的］探討外泌體包裹的miR-19b對EV71病毒復制的影響，為EV71病毒的miRNA防治藥物的開發(fā)提供參考.［方法］將游離的miR-19b-cy3.5分子和轉染miR-19b-cy3.5的HT29細胞分泌的外泌體分別處理T98G細胞，觀察進入細胞的效率；分別提取未處理的、轉染mimic-n.c.和轉染miR-19b的HT29細胞分泌的外泌體，并給予T98G細胞孵育后，檢測細胞內miR-19b的表達；分別以60 mg/L 轉染mimic-n.c.的HT29細胞分泌的外泌體、60 mg/L 和40 mg/L 轉染miR-19b的HT29細胞分泌的外泌體孵育T98G細胞并感染EV71病毒，檢測病毒RNA載量；將攜帶包裹的miR-19b-cy3.5的HT29細胞來源的外泌體，通過尾靜脈注射小鼠檢測miR-19b在小鼠各個器官中的表達.［結果］ miR-19b-cy3.5能夠通過外泌體的形式進入T98G細胞中，而游離的miR-19b-cy3.5無法進入細胞；轉染miR-19b的HT29細胞分泌的外泌體在處理T98G細胞后，胞內miR-19b高表達， 同時，外泌體處理后的T98G細胞中EV71病毒RNA復制量顯著降低；動物實驗中，外泌體包裹的miR-19b能夠在小鼠的腦、肝及肺有效表達.［結論］外泌體包裹的miR-19b能夠有效進入靶細胞中，并且可以抑制靶細胞中EV71病毒的復制；同時，外泌體包裹的miR-19b能夠有效進入小鼠腦、肝以及肺等組織中并表達.

關鍵詞：miR-19b；EV71；外泌體;microRNA

中圖分類號：R392文獻標志碼：A

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）病毒屬于A型腸道病毒，是無包膜正向單鏈RNA病毒，衣殼為二面體立體對稱，對中樞神經系統(tǒng)有極高的感染性.EV71主要引起5歲以下兒童手足口?。╤and-foot and mouth disease，HFMD），重癥感染常導致急性腦損傷（Acute brain injury，ABI），臨床癥狀包括腦炎（encephalitis）、無菌性腦膜炎（aseptic meningitis）、急性無力肢體麻痹（acute flaccid paralysis）等，據(jù)統(tǒng)計約0.2%～1% EV71感染的兒童發(fā)展為神經系統(tǒng)綜合征［1］ .由于腸道病毒的傳染性強，HFMD經常于夏秋季在幼兒園或小學生發(fā)生小規(guī)模流行［2］ .目前在臨床上尚無有效的抗病毒特效藥物，對EV71感染的患者主要以對癥和支持治療為主.

外泌體是由細胞釋放到細胞外基質中的一種雙層膜結構的囊泡，內含的核酸及蛋白質在病毒的持續(xù)性感染及擴散中起到了重要作用.2013年，SHTAM等［3］發(fā)現(xiàn)了細胞囊泡運輸?shù)恼{節(jié)機制，為外泌體作為基因和藥物遞送的載體提供了理論依據(jù)，具有重要的臨床意義.相對于脂質體制劑來說，外泌體是天然存在的分泌性信息載體，毒性較低，生物相容性好、具有高通透性和滯留效應、能透過血腦屏障.

miRNA是外泌體中含量最豐富的一種RNA，是一類長度為19～24個核苷酸的非編碼RNA，通過加速mRNA 降解或者抑制mRNA翻譯調控基因表達［4］ ，進而參與細胞生長、增殖、凋亡和信號轉導的半蛋白編碼基因的表達［5-6］ .有證據(jù)表明，病毒感染可以影響miRNA 的表達，改變miRNA的表達可以抑制或增強抗病毒反應［7］ .研究發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（HIV-1）受體CD4蛋白受miR-221和miR-222的調控［8］ ， miR-34a是黃病毒復制的有效抑制劑［9］，miRNA-221具有增強IFN-I抗丙型肝炎病毒（HCV）的作用［10］ .較多證據(jù)表明miRNA與EV71感染復制有關.miR-197的過表達會抑制EV71的復制，而抑制miR-197表達后EV71復制水平將顯著升高［11］ .EV71感染細胞分泌的外泌體選擇性地包裝了高水平miR-146a，miR-146a可通過抑制I型干擾素應答功能轉移到受體細胞并促進外泌體EV71 RNA在受體細胞中復制［12］ .在EV71感染過程中hsa-miR-17（～92）的表達顯著下調，過表達hsa-miR-17（～92） EV71的復制受到抑制，而抑制內源性hsa-miR-17（～92）促進了EV71復制［13］ .microRNA-23b通過下調EV71 VPl蛋白抑制腸病毒71復制［14］ .

miR-19b是一個與細胞分化和生長等有關的 miRNA分子，與心肌分化以及腫瘤侵襲遷移等有關［15-16］ .有研究報道gga-miR-19b-3p促進新城疫病毒（NDV）誘導的炎癥細胞因子的產生抑制NDV的復制，而抑制內源性miR-19b表達則有相反的效果上調miR-19b可以抑制NDV的復制［17］ .還有研究發(fā)現(xiàn)miR-19b是調控人類免疫缺陷病毒（HIV）感染期間CD8+T細胞功能的“磷酸酶和緊張素同源物”，可以直接抑制體外感染HIV的T細胞中的病毒產生［18］ .目前，miR-19b是否影響EV71病毒的復制尚未有報道.本研究以期為EV71的以外泌體為載體的miRNA防治藥物的開發(fā)提供新的參考與策略，探討了外泌體包裹的miR-19b對EV71復制的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株HT-29，EV71、人腦膠質瘤細胞T98G以及miR-19b-cy3.5質粒由生物醫(yī)學研究院保存；DMEM、1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司；ExoQuickTC 外泌體提取試劑盒（美國SBI）；超過濾管（美國 Millipore）；Trizol 試劑（北京天漠生物科技有限公司）；miRNA 反轉錄試劑盒（廣州銳博科技生物有限公司）.

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染實驗

HT29細胞接種至24孔板中，待細胞生長至 50%～70%，將細胞分為空白對照組、轉染mimic-n.c.對照組和轉染miR-19b組.轉染方式如下，A管：將20 pmol siRNA溶于25 μL無血清培養(yǎng)基中；B管：將1.5 μL Lipofectamine 3000溶于25 μL 無血清培養(yǎng)基中混勻；將Ａ和Ｂ兩管混合，放置5 min，將混合液加入24孔板對應孔中.

1.2.2 外泌體提取

將HT29細胞培養(yǎng)上清以10 000 r/min，4 ℃離心45 min，去除死細胞及細胞碎片，并通過0.22 μm過濾器進行過濾.使用Exoquick-TC（美國System Bioscieonce公司）提取細胞培養(yǎng)上清中的外泌體，將培養(yǎng)基與Exoquick-T試劑混勻，置于４℃冰箱靜置過夜，以1 500 r/min，4 ℃離心30 min，去掉上清，將離心管底部的外泌體沉淀用PBS懸浮.

1.2.3 熒光定量 PCR

將T98G細胞接種至12孔板中，待細胞生長至 70%～80%后分為3組，其中空白對照組加入正常的HT29分泌的外泌體，mimic-n.c.對照組加入轉染mimic-n.c.的HT29分泌的外泌體，處理組加入轉染miR-19b的HT29分泌的外泌體，培養(yǎng)48 h.

將T98G細胞接種至12孔板中，待細胞生長至 70%～80%后分為3組，60 mg/L 轉染mimic-n.c.的HT29分泌的外泌體、40 mg/L 轉染miR-19b的HT29分泌的外泌體以及60 mg/L 轉染miR-19b的HT29分泌的外泌體分別與MOI=2的EV71混勻共培養(yǎng)T98G細胞48 h.

收集以上6組細胞，使用Trizol法（InvitrogenTM TRIzol）提取細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒（First Strand cDNA Synthesis）分別將總RNA分別逆轉錄成對應的cDNA，再利用熒光定量 PCR （Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術以GAPDH為內參基因，檢測EV71病毒RNA以及miR-19b的表達量.反應程序設置為95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，共計40個循環(huán).引物序列如下：

EV71 viral RNA：

Forward： 5′-GCTCTATAGGAGATAGTGTGAGTAGGG-3′

Reverse： 5′-ATGACTGCTCACCTGCGTGTT-3′

miR-19b：

Forward： 5′-CCTGTCGCCCAATCAAA-3′

Reverse：5′-CAACCTGTGTAGAAAGGGGTT-3′

GAPDH：

Forward： 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′

Reverse： 5′ -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′

1.2.4 外源性外泌體包裹的miR-19b-cy3.5在小鼠體的分布

尾靜脈注射BALB/c小鼠轉染miR-19b-cy3.5的HT29細胞分泌的外泌體，對照組注射PBS.48 h后取腦、肺、肝組織置于4%多聚甲醛固定8 h；冷凍切片機切片5 μm，室溫放置30 min；PBS洗3次，每次5 min；免疫組化筆畫圈，2% BSA室溫封閉1 h；一抗4℃孵育過夜；PBS洗3次，每次5 min；二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI染色，PBS洗3次，每次5 min；滴加防淬滅劑，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察miR-19b-cy3.5的表達情況.

1.2.5 細胞的固定及免疫熒光

在培養(yǎng)板中培養(yǎng)好細胞后，吸除培養(yǎng)基，使用PBS輕洗細胞２次，然后加入4%多聚甲醛（PBS配制）固定15 min；除去多聚甲醛，PBS輕洗細胞３次，每次５ min.用0.5%Triton X-100室溫通透20 min，除去Triton X-100，使用PBS輕洗細胞3次，每次5 min；用3% H2O2孵育15 min，除去H2O2，PBS輕洗細胞3次，每次5 min；用10%的與二抗同源的血清封閉30 min；滴加足夠量適宜濃度的一抗，4 ℃孵育過夜，除去一抗，使用PBS輕洗細胞3次，每次5 min；滴加足夠量適宜濃度的二抗，室溫避光孵育60 min，除去二抗，使用PBS輕洗細胞3次，每次5 min；用0.5 mg/L? DAPI避光孵育5 min，PBS輕洗細胞3次，每次5 min，將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出，用吸水紙吸干爬片上的液體，封片液封片，用激光共聚焦采集圖像.

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，上述實驗均重復3次，組間差異比較采用t檢驗.P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結 果

2.1 外泌體攜帶包裹的miR-19b可以有效地形式進入靶細胞

將miR-19b-cy3.5分子轉染HT29細胞，提取分泌的外泌體并加入T98G細胞中，外泌體包裹的miR-19b-cy3.5可以有效進入T98G細胞，而游離的miR-19b-cy3.5分子無法進入T98G細胞（圖1（a））.另外，我們在T98G細胞中過表達外泌體的分子標志物CD63，發(fā)現(xiàn)miR-19b與CD63發(fā)生共定位，這說明miR-19b隨外泌體一同進入T98G細胞（圖1（b））.

2.2 外泌體包裹的miR-19b在靶細胞中可有效抑制EV71病毒復制

T98G細胞分別與未處理的HT29細胞、轉染mimic-n.c.的HT29細胞以及轉染miR-19b的HT29細胞分泌的外泌體共孵育，48 h后檢測發(fā)現(xiàn)，與轉染miR-19b的HT29細胞分泌的外泌體共孵育的T98G細胞中的miR-19b表達顯著增加（圖2（A））.另外，轉染miR-19b的HT-29細胞分泌的外泌體，使其攜帶miR-19b后并處理T98G細胞（40 mg/L），T98G胞內的病毒RNA復制載量顯著低于轉染mimic-n.c.的HT29細胞分泌的外泌體處理組，同時，60 mg/L的攜帶miR-19b外泌體處理T98G細胞后，其病毒RNA復制載量顯著低于40 mg/L外泌體處理組，說明外泌體攜帶的miR-19b在抑制靶細胞中病毒復制過程中顯示出劑量依賴性（圖2（B））.

2.3 外泌體攜帶包裹的miR-19b在小鼠組織內的分布

小鼠尾靜脈分別注射轉染miR-19b-cy3.5的HT29細胞分泌的外泌體，對照組給予 PBS處理，48h后共聚焦分析組織切片，結果顯示，外泌體攜帶的miR-19b-cy3.5能夠有效進入小鼠腦、肝以及肺并表達（圖3）.

3 結 論

外泌體是細胞分泌的一種胞外囊泡，直徑為30～150 nm，由包括T細胞、上皮細胞、少突膠質細胞等多種細胞分泌，廣泛分布于血液、唾液、腦脊液等生物體液中［19-20］ .研究證實，外泌體中含有DNA，miRNA，4次跨膜蛋白超家族（CD9，CD63，CD81，CD82）以及與病毒感染復制有關的分子等［5，20-22］ ，是細胞間信號傳遞和信息交流的重要方式，可參與機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等［23］ .近年來，一些研究表明外泌體中還包含有STING蛋白，miR-H5，miR-H3和miR-H6等miRNA參與病毒的復制和傳播［24］ .HIV感染后通過DC信號將病毒粒子與外泌體一起釋放并增強了病毒的感染能力［25-26］ .丙型肝炎病毒（HCV）的RNA可在感染細胞的外泌體中檢測到，并可以作為感染顆粒發(fā)揮作用［27-28］ .不同病原體感染不同細胞產生的外泌體具有不同的表面分子，可作為后期藥物及疫苗研發(fā)的重要靶點.

miR-19b是 miR-17-92 基因簇中重要的致癌成員之一，可能與血小板聚集和活化密切相關，在非小細胞肺癌、前列腺癌等多種腫瘤中高表達，能夠調控腫瘤細胞的侵襲和遷移能力 ［15，29-31］ ，也參與NDV和HIV病毒的感染與復制［17-18］ .miR-19b與EV71的感染復制是否有關系還沒有相關研究.本研究利用不同質量濃度的外泌體包裹的miR-19b處理EV71感染的T98G細胞，通過檢測病毒RNA的表達量，發(fā)現(xiàn)miR-19b可以濃度依賴性抑制EV71在T98G細胞內的復制.

miR-19b可以抑制EV71的具體機制還不清楚，有待于進一步研究.據(jù)目前報道，miR-221可以通過靶向IFN/JAK/STAT通路中的抑制因子SOCS1和SOCS3增強IFN的抗HCV作用［10］ ；miR-34家族成員通過加強干擾素調節(jié)因子3 （IRF3）磷酸化和核易位發(fā)揮抗黃病毒作用［9］ ；EV71感染細胞分泌的外泌體選擇性地包裝高水平的miR-146a，可以通過抑制I型干擾素反應，功能上轉移到并促進外泌體EV71 RNA在受體細胞中復制［12］ ；DNA甲基化也可能是hsa-miR-17 92調控EV71病毒感染的一種新機制［13］ ；miR-23b和miR-23b的上調可通過靶向EV71 3 UTR保守序列直接抑制EV71的復制［14］ .由此可見，miRNA可以通過多種途徑參與病毒感染與復制.

目前在臨床上對EV71感染的患者主要以對癥和支持治療為主，外泌體包裹的miR-19b在體內是否也可以如進入T98G細胞順利在機體組織中表達？本實驗將外泌體包裹的miR-19-cy3.5尾靜脈注射BALB/c小鼠后，冷凍切片觀察發(fā)現(xiàn)小鼠腦、肝以及肺組織均可檢測到miR-19b-cy3.5.

綜上，外泌體包裹的miR-19b可以濃度依賴性抑制EV71在T98G細胞內的復制，也可以在體內的腦、肝及肺組織在表達；這為EV71的以外泌體為載體的miRNA防治藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù).我們將會對外泌體包裹的miR-19b可以抑制EV71復制的具體機制做進一步的研究.

參 考 文 獻

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Exosome mediated miR-19b effect on the replication of EV71

Li Yanmei1， Cheng Xiaju1， Wang Yan2

（1. Institute of Biology and Medical Sciences， Soochow University， Suzhou 215123， China; 2. Suzhou Municipal Hospital， Suzhou 215008， China）

Abstract： ［Objective］The paper aims to examine exosome mediated miR-19b effect on the replication of Enterovirus 71 in T98G cells. ［Methods］T98G cells were treated with miR-19b molec μles and exosomes secreted by miR-19b-cy3.5 transfected HT29 cells to determine their entry mode. T98G cells were respectively treated with exosomes secreted by normal HT29 cells， mimic-n.c. transfected HT29 cells and miR-19b transfected HT29 cells to detect miR-19b expression. 60 mg/L? exosomes secreted by mimic-n.c. transfected HT29 cells， 60 mg/L? and 40 mg/L? exosomes secreted by miR-19b transfected HT29 cells were respectively co-c μltured with EV71 to detect the expression of viral RNA. ［Results］The expression of miR-19b in mice was detected by intravenous injection of exosomes secreted by miR-19b-cy3.5 transfected HT29 cells. miR-19b mediated by exosomes co μld enter T98G cells. miR-19b was highly expressed in T98G cells treated with exosomes secreted by miR-19b transfected HT29 cells. The virus RNA significantly decreased in T98G cells treated with the exosomes secreted by miR-19b transfected HT29 cells. ［Conclusion］miR-19b mediated by exosomes was expressed in the brain， liver and lungs of mice. exosomes mediated miR-19b was highly expressed in T98G cells， and concentration dependent inhibition of EV71 replication. It is expressed in mice brain， liver and lung.

Keywords： miR-19b; EV71; exosomes; microRNA

［責任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2022-01-06;修回日期：2022-04-23.

基金項目：國家自然科學基金（81902913）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）.

作者簡介：李艷梅（1984-），女，山西呂梁人，蘇州大學助理研究員，研究方向為生物顯微技術與感染免疫，E-mail：yanmeili1031@163.com.

通信作者：王燕，E-mail：wooyan@yeah.net.