展示p53蛋白表位噬菌體phage-SD的制備及應(yīng)用

劉興友 孫夢月 潘鵬濤 劉國偉

摘 要：［目的］利用噬菌體展示技術(shù)制備一種可用于檢測血清p53抗體的噬菌體.［方法］利用基因工程手段將編碼p53蛋白N端20～31位的多肽SD的基因克隆到絲狀噬菌體載體fADL-le的pIII蛋白基因中，制備展示該外源肽的噬菌體phage-SD并進(jìn)行了Western blot鑒定.在此基礎(chǔ)上，分別以phage-SD和重組p53蛋白為檢測抗原，利用ELISA方法對乳腺癌患者血清p53抗體進(jìn)行檢測.［結(jié)果］成功制備出能特異性識別血清p53抗體的噬菌體phage-SD.ELISA檢測結(jié)果表明，60例乳腺癌患者中phage-SD檢測到13例p53抗體陽性患者，檢出率為21.67%，與重組p53蛋白檢測效率（21.67%）一致.［結(jié)論］成功制備一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的可用于血清p53抗體檢測的噬菌體phage-SD，為新型血清p53抗體檢測試劑的開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：噬菌體展示；絲狀噬菌體；p53抗體；ELISA

中圖分類號：R-33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

自1985年美國科學(xué)家SMITH首次報道將核酸內(nèi)切酶展示在噬菌體的表面并創(chuàng)立了噬菌體展示技術(shù)，并于2018年憑借該項研究獲得諾貝爾化學(xué)獎［1］，噬菌體展示技術(shù)經(jīng)過30多年的發(fā)展目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等各個領(lǐng)域［2-5］.

絲狀噬菌體是侵染大腸桿菌的一種無包膜桿狀病毒，長約900 nm，直徑為6 nm，內(nèi)部為單鏈環(huán)狀DNA基因組，表面被各種外殼蛋白所覆蓋［6］.噬菌體表面的外殼蛋由其基因組中相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼，因此，通過將外源基因定向克隆到特定外殼蛋白基因中，可以用融合表達(dá)的方式，使感興趣的外源蛋白或多肽展示在噬菌體的表面.理論上，噬菌體表面的所有外殼蛋白均可用于展示，但目前最常用的有兩種外殼蛋白，分別是pIII蛋白展示系統(tǒng)和pVIII蛋白展示系統(tǒng)［7］.5個拷貝的pIII蛋白位于噬菌體的尾部，直接參與噬菌體侵染大腸桿菌的過程.該展示系統(tǒng)具有對展示的外源肽的大小無嚴(yán)格限制的優(yōu)點，完整的蛋白甚至抗體都可以通過該系統(tǒng)展示在噬菌體的表面，但其拷貝數(shù)相對較低［8］.成熟的pVIII蛋白大約由50個氨基酸構(gòu)成，位于噬菌體的背部，每個噬菌體大約有2 700個拷貝.與pIII展示系統(tǒng)相比，外源多肽可以通過該系統(tǒng)以高拷貝的形式展示在噬菌體的表面，并刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但該系統(tǒng)展示對外源肽的大小有限制，通常不超過15個氨基酸，否則會影響噬菌體的組裝和形成.

腫瘤患者體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種針對胞內(nèi)及胞外抗原的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中p53介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)在腫瘤患者體內(nèi)最為常見［9-11］.目前，抗體型腫瘤標(biāo)志物的檢測多以重組蛋白為檢測抗原，存在制備煩瑣、價格高昂且檢測效率不高等問題［12-13］.噬菌體作為一種規(guī)則化的生物模板，利用噬菌體展示技術(shù)，可以在噬菌體表面展示不同的外源肽來識別不同的目標(biāo)物，用于靶專一性的生物識別.

本研究以絲狀噬菌體為模板，選擇p53抗體為靶點，利用噬菌體展示技術(shù)將p53蛋白的關(guān)鍵表位多肽SD（SDLWKLLPENNV）展示在噬菌體表面，并初步檢測乳腺癌患者血清中的p53抗體，為后續(xù)血清p53抗體檢測試劑的開發(fā)及其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持.

1 材料和方法

1.1 載體及菌株

噬菌體載體fADL-1e購自美國Antibody Design 公司（Catalog number：PD020）；E. coli JM109感受態(tài)購自北京索萊寶科技有限公司.

1.2 主要試劑及儀器

2×premix預(yù)混液、限制性內(nèi)切酶Bgl I，DNA Marker，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒小量提取及DNA凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；引物合成及測序均由上海生物工程有限公司完成；小鼠抗M13噬菌體pⅢ單克隆抗體購自北京NEB有限公司；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG及HRP標(biāo)記羊抗人IgG購自北京Abbkine公司；全波長酶標(biāo)儀（Spectra max Plus 384）購自美國MOLECULAR DEVICES；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Amersham Imager 680）購自美國GE公司；健康人及乳腺癌患者血清來自新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，所有血清收集均在患者知情同意的情況下收集的，且本實驗是在新鄉(xiāng)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會及新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)的情況下進(jìn)行的.

1.3 重組噬菌體載體fADL-le-SD的構(gòu)建

酶切噬菌體載體fADL-1e：用Bgl I限制性內(nèi)切酶對載體fADL-1e進(jìn)行酶切，反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切后的載體，并按照DNA凝膠回收試劑盒的說明回收和純化酶切后的載體.噬菌體展示SD多肽的合成：首先合成編碼p53蛋白N端第20～31位氨基酸SDLWKLLPENNV的兩個互補DNA片段；5′-CGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTGGCCCGGG-3′，5′-GGGCCAACGTTGTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTCTGATGCCATGGCCGGCT-3′，將兩個互補的DNA片段等摩爾混合溶解，94 ℃變性5 min，58 ℃復(fù)性5 min，使兩條互補的單鏈片段結(jié)合形成雙鏈.SD多肽片段與fADL-1e酶切載體的連接：將合成的SD多肽目的片段與Bgl I酶切后fADL-1e載體16 ℃過夜連接，并將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞.菌液PCR鑒定陽性克?。禾羧慰寺∵M(jìn)行菌液PCR鑒定，引物和擴(kuò)增條件如下：上游引物：5′-CCGTGCATCTGTCCTCGTTCAA-3′；下游引物：5′-GTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTC-3′；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性6 min，94 ℃變性35 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；4 ℃保存.反應(yīng)結(jié)束后，將篩選到的陽性克隆送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)，將構(gòu)建成功的重組噬菌體載體命名為fADL-le-SD.

1.4 噬菌體phage-SD的制備及滴度測定

將200 μL測序正確的含有fADL-1e-SD的JM109接種到200 mL的LB液體培養(yǎng)基（100 mg/L Kar+）中，37 ℃震蕩培養(yǎng)10 h；4 ℃，8 000 r/min離心10 min，保留沉淀；加入50 mL的PEG/NaCl溶液，混勻后，4 ℃冰箱過夜；次日，10 000 r/min離心15 min，保留沉淀；PBS緩沖液溶解沉淀后，12 000 r/min離心1 min，保留上清；再次加入體積分?jǐn)?shù)為20%的PEG/NaCl溶液，4 ℃下靜置5 h；12 000 r/min離心10 min，PBS緩沖液溶解沉淀，4 ℃冰箱保存.

進(jìn)行噬菌體phage-SD的滴度測定時，首先制備對數(shù)期（OD600約為0.5）的JM109菌液，再取10 μL制備好的噬菌體懸液加到90 μL的PBS中混勻，此稀釋度為0.1，用PBS進(jìn)行梯度稀釋至10-12，從10-6至10-12梯度中各取10 μL與200 μL處于對數(shù)期JM109菌液混勻，37 ℃，靜置30 min，將菌液涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)，同時取200 μL處于對數(shù)期JM109菌液涂布在卡那抗性平板作對照；次日，根據(jù)公式計算噬菌體滴度：滴度=菌落數(shù)/（接種噬菌體的體積×稀釋度）.

1.5 Western-blot分析噬菌體phage-SD

噬菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，300 mA電流電轉(zhuǎn)90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以商品化的鼠源anti-pⅢ單克隆抗體（NEB）或p53抗體陽性癌癥患者血清或健康人血清為一抗，羊抗鼠IgG或羊抗人IgG為二抗，對phage-SD進(jìn)行Western-blot分析.

1.6 血清p53抗體檢測方法的建立

phage-SD-ELISA：將制備好的噬菌體phage-SD作為包被抗原，30 mg/L包被酶標(biāo)板，每孔50 μL，冰箱4 ℃過夜；次日，用PBST洗板3次，最后一次靜置5 min；加200 μL用PBST稀釋的5%的脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h；PBST洗板后加50 μL稀釋比例為1∶200的待檢測的乳腺癌或健康人血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗板后加50 μL稀釋比例為1∶5 000 HRP標(biāo)記羊抗人二抗，37 ℃孵育45 min；PBST洗板后加100 μL四甲基聯(lián)苯胺單組分顯色液，遮光條件下反應(yīng)10 min后立即加入50 μL ELISA終止液，所有樣本均采用復(fù)孔檢測，OD450波長下讀取實驗結(jié)果，并計算每個樣本檢測結(jié)果的平均值.健康人血清用于確定該檢測方法的cut-off值，具體確定方法詳見文獻(xiàn)［6］.p53-ELISA：以重組p53蛋白（購自Abcam， Catalog number：ab82201）作為包被抗原檢測血清p53抗體的方法簡稱為p53-ELISA.除了酶標(biāo)板上包被的抗原為3 μg/mL的重組p53蛋白外，整個實驗流程與phage-SD-ELISA完全相同.

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析.乳腺癌患者組及健康人血清p53抗體檢出率的比較采用四格表的χ2檢驗.P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 重組噬菌體載體fADL-le-SD的構(gòu)建及鑒定

對酶切后的載體fADL-le和SD序列連接，構(gòu)建重組載體fADL-1e-SD，如圖1所示.

對載體fADL-1e以及酶切后的載體fADL-1e進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖2.fADL-1e載體主要以線狀的形式存在，酶切后電泳遷移速率比線狀空載快，初步證明酶切成功.

PCR反應(yīng)中上游引物在載體fADL-1e的pⅢ基因插入位點上游大約700 bp處，下游引物為連接片段的反義鏈，因此陽性克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增后會在700 bp處出現(xiàn)特異條帶.結(jié)果如圖3所示，在700 bp處出現(xiàn)一條特異性目的條帶，初步表明外源肽SD的編碼片段被成功插入到噬菌體的pⅢ基因中，重組噬菌體載體構(gòu)建成功.

重組載體測序結(jié)果如圖4所示，黃色標(biāo)記部分為信號肽，紅色標(biāo)記部分為SD多肽序列，灰色標(biāo)記部分為Linker，綠色標(biāo)記部分為pIII蛋白部分序列，目的片段的編碼區(qū)（879～914）被成功連接到fADL-1e的pⅢ基因中，表明重組載體fADL-1e-SD構(gòu)建成功，可用于下一步噬菌體phage-SD的制備.根據(jù)滴度計算公式，計算制備的噬菌體phage-SD滴度為1.6×1011 pfu/mL.

2.2 Western-blot分析噬菌體phage-SD

為驗證p53蛋白N端SD多肽與pⅢ融合表達(dá)并成功展示在噬菌體的表面，將制備的phage-SD分別與anti-pⅢ的單克隆抗體及p53抗體陽性腫瘤患者血清雜交，結(jié)果如圖5所示，phage-SD能同時與anti-pⅢ單克隆抗體及腫瘤患者血清p53抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，且目的條帶位置相同，而該噬菌體與健康人血清無任何交叉反應(yīng)，表明外源肽SD被成功展示在噬菌體的pⅢ蛋白表面，且能特異性的識別腫瘤患者血清p53抗體.

2.3 噬菌體phage-SD檢測血清p53抗體結(jié)果

分別以噬菌體phage-SD，重組p53蛋白為檢測抗原，利用ELISA方法對60例乳腺癌患者及200例健康人進(jìn)行血清p53抗體的檢測，統(tǒng)計結(jié)果如表1和圖6所示，60例乳腺癌患者中，噬菌體phage-SD檢測到13例p53抗體陽性患者血清，檢出率為21.67%，與重組p53蛋白檢測效率（21.67%）一致，兩種檢測方法的特異性分別為96.50%（phage-SD-ELISA）、96.00%（p53-ELISA）.該結(jié)果表明，phage-SD在檢測乳腺癌患者血清p53抗體方面，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且制備簡單等優(yōu)點，可用于乳腺癌患者血清p53抗體的檢測應(yīng)用研究.

3 討 論

從CRAWFORD等［13］在乳腺癌患者血清中檢測到p53抗體以來，大量研究證實，血清p53抗體在腫瘤的診斷、預(yù)后分析、療效評估、復(fù)發(fā)及腫瘤早期發(fā)現(xiàn)等方面具有重要的參考價值［14-15］.LUBIN等［16］通過體外合成重疊多肽的方法系統(tǒng)研究了腫瘤患者血清p53抗體識位點，發(fā)現(xiàn)血清p53抗體識別的表位主要位于蛋白的兩端，其中絕大部分位于蛋白的N端，且該免疫應(yīng)答反應(yīng)與腫瘤類型無關(guān).本文中選擇的SD多肽即位于p53蛋白的N端第20～31位，是p53抗體識別的一個核心關(guān)鍵表位.噬菌體展示技術(shù)能夠?qū)⒒蛐团c表現(xiàn)型聯(lián)系起來，使研究者可以在基因水平上實現(xiàn)對蛋白質(zhì)構(gòu)象的體外控制，在體外獲得具有良好生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物.在本研究中外源肽SD定向克隆到pⅢ外殼蛋白的N端的最前端，這樣可使外源肽SD展示在噬菌體的表面并徹底暴露出來，便于抗體的識別，避免了該外源肽在蛋白內(nèi)暴露不充分的問題.

目前，血清p53抗體的檢測主要是以重組p53蛋白為檢測抗原［17-20］，而重組蛋白的制備步驟煩瑣、制備周期長且后期純化成本較高、穩(wěn)定性差.絲狀噬菌體作為天然生物納米材料在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中能保持生物活性，具有穩(wěn)定性高的特性，同時，噬菌體長期保存后仍具有侵染活性，侵染大腸桿菌后可大量制備噬菌體，生產(chǎn)成本低廉且后期純化步驟簡單.在本研究中，噬菌體phage-SD在乳腺癌患者血清p53抗體陽性檢出率方面與重組p53蛋白一致，均為21.67%，但是噬菌體phage-SD檢測血清p53抗體的特異性（96.5%）稍高于重組p53蛋白（95%）.這表明噬菌體phage-SD在檢測乳腺癌患者血清p53抗體方面具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點，可以代替重組蛋白用于乳腺癌血清p53抗體的檢測研究.

本研究以絲狀噬菌體為模板，利用噬菌體展示技術(shù)將p53蛋白核心表位SD展示在噬菌體的pⅢ蛋白表面，成功制備一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的可用于血清p53抗體檢測的噬菌體phage-SD，為新型血清p53抗體更有效和更低成本的檢測試劑開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

參 考 文 獻(xiàn)

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Preparation and application of bacteriophage phage-SD displaying epitope of p53 protein

Liu Xingyou1，2， Sun Mengyue1， Pan Pengtao2， Liu Guowei3

（1. College of life sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， China; 2. College of Life Science and Basic Medicine，

Xinxiang University， Xinxiang 453003， China; 3. Xinxiang Central Hospital， Xinxiang 453099， China）

Abstract： ［Objective］This research aimed to prepare a new type of phage using phage display technology for the detection of serum p53 antibodies. ［Methods］The fADL-le phage vector was double digested by Bgl I and then the adaptor molecule encoding the peptide SD located in the N-terminal of 20-31 amino acid of p53 protein was inserted in the gene III， and phage-SD was prepared and analyzed by Western blot. Then， serum p53 antibody in the breast cancer patients was detected by ELISA method using phage-SD and recombinant p53 protein as the coating antigen， respectively. ［Results］The peptide SD was successfully displayed on the surface of the bacteriophage and the expressed peptide SD also could identify the p53 antibody. Among the 60 breast cancer patients， 17 patients（21.67%）were tested positive for serum p53 antibody by phage-SD ELISA， and the detection efficiency of this method was the same as the p53-ELISA. ［Conclusion］Phage-SD was successfully prepared， and this phage presented high detection efficiency and specificity and had the potential to develop into a new type of diagnosis reagent for the detection of serum p53 antibody.

Keywords： phage display; filamentous bacteriophage; p53 antibody; ELISA

［責(zé)任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2022-03-28;修回日期：2022-04-25.

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81702074）；河南省科技攻關(guān)計劃項目（212102110160）；河南省高等學(xué)校重點科研項目（22A180008）.

作者簡介：劉興友（1963-），男，重慶市人，新鄉(xiāng)學(xué)院教授，博士，研究方向為預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：xingyouliu63@163.com.

通信作者：潘鵬濤，E-mail：panpengtao126@163.com.