不同部位載藥可溶性微針載藥量比較及體外評價(jià)

鐘家浩 姚文棟 謝先澤 徐恒武

可溶性微針（dissolving microneedle，DMN）是一種由可溶性生物相容性材料制成微米級針體，在穿透皮膚角質(zhì)層（stratum corneum，SC）后溶解釋放裝封于針體內(nèi)藥物的一種新型給藥劑型[1-3]。DMN 刺穿角質(zhì)層產(chǎn)生微孔道，但其深度不會(huì)損傷真皮中的神經(jīng)末梢和血管[3]。因此，DMN 透皮給藥不會(huì)導(dǎo)致出血和疼痛，是一種無痛給藥方式。盡管在藥物遞送方面極具開發(fā)潛力，但DMN 由于依賴針體透皮給藥，其載藥局限于針體而使載藥量低，限制了其進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用潛力[4]。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，醫(yī)用膠布輔助微針給藥后背襯層也會(huì)溶解吸收[5-6]。因此，本研究以聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）為材料，制備不同部位載不透皮的多肽類藥物——神經(jīng)毒素（neurotoxin，NT）的DMN，并對其形態(tài)特征，機(jī)械強(qiáng)度，載藥量及體外透皮釋放進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀 器 微針模具，臺(tái)州薇凱生物科技有限公司；HF-50 數(shù)顯推拉力計(jì)HLX-S 推拉力計(jì)測試機(jī)架，美國PACK 公司；TL6R 立式低速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；DZF-6050 真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Nikon Eclipse Ci-L 顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社。

1.2 材 料 NT，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%，云南龍鳳谷生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)H45 021228；PVP，美國Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)BCBP9635V；CS，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C11 082605；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

1.3 不同部位載藥DMN 的制備 本研究依據(jù)前期研究使用兩步離心法[5-6]制備DMN（見圖1）：（1）DMN針體的制備：以質(zhì)量比為1∶1 分別稱取CS 與PVP 于燒杯中，加入5 mg/mL 的NT 水溶液或純水0.8 mL，充分溶解并攪拌均勻。將含藥的基質(zhì)液注入微針模具中，在4 ℃條件下，4 000 r/min 離心10 min，除去并收集微針模具表面的含藥基質(zhì)液，放入干燥箱中干燥1 h 后取出備用；（2）DMN 背襯層的制備：以質(zhì)量比為1∶1 分別稱取CS 與PVP 于燒杯中，加入5 mg/mL的NT 水溶液或純水5.0 mL，攪拌均勻后注入微針模具，相同條件下離心10 min，取出具有含藥基質(zhì)液的微針模具干燥成形，用彎鑷小心脫模，即得DMN。

圖1 兩步離心法制備不同部位載藥可溶性微針示意圖

1.3.1 針體載藥可溶性微針的制備（DMN-A）在“1.3”項(xiàng)下，（1）中使用5 mg/mL 的NT 水溶液溶解CS與PVP；（2）中加入純水，其余步驟不變，得到針體載藥可溶性微針（DMN-A）的制備。

1.6 體外透皮釋放 使用Franz 擴(kuò)散池法做體外透皮釋放評價(jià)。在Franz 擴(kuò)散池的接收室內(nèi)加入pH=7.4 的PBS 作為接收液，超聲排出多余空氣。取離體大鼠皮膚，角質(zhì)層朝上。將DMN-A、DMN-B、DMN-C置于離體大鼠皮膚上，按壓后用醫(yī)用膠布固定，過程中保證皮膚完整性。固定供給池和接收室，隨后以600 r/min 的轉(zhuǎn)速模擬人體皮下血液和組織液內(nèi)循環(huán)，保持32 ℃恒溫。分別于0、10、20、30 min 及1、2、3、4、6、8 h 后收集0.5 mL 接收液作為樣品進(jìn)行含量測定，取樣后及時(shí)補(bǔ)充等量新鮮接收液。將取出的接收液樣品處理并HPLC 測定濃度，計(jì)算并繪制藥物累積滲透釋藥曲線。

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1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)（適用于n＜50），均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。n 表示實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)。

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停工吹掃期間，輕油線的吹掃基本在4月11日至4月12日完成，為了在安全的前提下完成吹掃任務(wù)，采取以下較好的措施：

1.3.2 背襯層載藥可溶性微針（DMN-B）的制備 在“1.3”項(xiàng)下，（1）中使用純水溶解CS 與PVP；（2）中加入5 mg/mL 的NT 水溶液，其余步驟不變，得到DMN-B 的制備。

1.3.3 針體與背襯層均載藥可溶性微針（DMN-C）的制備 在“1.3”項(xiàng)下，（1）中使用5 mg/mL 的NT 水溶液溶解CS 與PVP；（2）中加入5 mg/mL 的NT 水溶液，其余步驟不變，得到DMN-C 的制備。

1.5 載藥量測定 將DMN 溶于1 mL 去離子水中，提取10 min 后，以8 000 r/min 離心，5 min 后取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，以前期研究中的色譜條件測定其載藥量。

1.4 形態(tài)特征及機(jī)械強(qiáng)度 將微針裁剪至合適大小置于Nikon Eclipse Ci-L 顯微鏡下觀察形態(tài)特征，記錄微針長度及寬度。使用HF-50 數(shù)顯推拉力計(jì)測定微針縱向與橫向的斷裂力以確定DMN-A、DMN-B、DMN-C 的機(jī)械強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.2 載藥量測定 針體載藥的DMN-A 載藥量最少，為（15.2±0.3）μg；背襯層載藥的DMN-B 載藥量較DMN-A 顯著升高（P＜0.01），達(dá)（87.4±2.8）μg；針體與背襯層均載藥的DMN-C 載藥量較DMN-A 也顯著升高（P＜0.01），為（103.7±3.2）μg；表明背襯層載藥空間的增加使載藥量明顯提升。

表1 不同部位載藥的DMN 機(jī)械強(qiáng)度

圖2 不同部位載藥可溶性微針1 h 與8 h 透皮釋放曲線（n=3）注：DMN-A 是針體載藥可溶性微針；DMN-B 為背襯層載藥可溶性微針；DMN-C 為針體與背襯層均載藥可溶性微針

圖2 DMN 正置與側(cè)置下形態(tài)特征（比例尺為1000 μm）

2.1 形態(tài)特征及機(jī)械強(qiáng)度 三種DMN 均由同一批微針模具制備，形態(tài)特征一致。如圖2 所示，DMN 整體為金字塔形，正置鏡頭下可見正方形及棱邊輪廓，側(cè)置鏡頭下為三角形。DMN 高度達(dá)500 μm，底寬度為300 μm，針體之間間距約為850～900 μm。機(jī)械強(qiáng)度如表1 所示，DMN-A、DMN-B、DMN-C 的橫向斷裂力、縱向斷裂力比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 體外透皮釋放 體外透皮釋放如圖3 所示，三種不同的DMN 的釋放均呈現(xiàn)緩釋狀態(tài)，但又有明顯的差異。針體載藥的DMN-A 在三者中釋放速度最快，盡管在前期釋放較慢（前20 min），但在1 h 已大于60%，且在4 h 已釋放90%以上；背襯層載藥的DMN-B 在三者中釋放速度最緩，0.5 h 仍不足10%，8 h 未達(dá)60%，DMN-B 在8 h 仍呈釋放趨勢；針體與背襯層均載藥的DMN-C 釋放速度略快于DMN-B，但明顯低于DMN-A，8 h 釋放70%，在4～8 h 釋放速度已有所減緩，但仍呈釋放趨勢。

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3 討論

DNM 通過微米級針體穿透角質(zhì)層，與體液接觸后生物相容性材料溶解釋放裝封在微針中的藥物[1-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，背襯材料溶解后亦會(huì)通過皮膚吸收。因此，本研究制備了不同部位載藥的DMN-A、DMNB、DMN-C 并對其進(jìn)行表征及體外評價(jià)。三種不同部位載藥的DMN 形態(tài)特征一致，均為金字塔形，表明載藥對形態(tài)無影響。DMN 通過針體穿過SC 釋藥，需要具備足夠的機(jī)械強(qiáng)度。前期研究中發(fā)現(xiàn)PVP 及CS的復(fù)合材料可以增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度，因此選擇了兩者機(jī)械強(qiáng)度比例制備DMN[5]。已有研究表明，金字塔形的微針相比于其他形狀微針結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)固[7]，能夠更好地穿透SC。所制備的三種微針在機(jī)械強(qiáng)度無明顯差異，不同部位載藥未改變機(jī)械強(qiáng)度。

進(jìn)一步，通過對2017年不同讀者實(shí)際參與采訪工作的程度進(jìn)行初步分析，得到如圖1所示的結(jié)果。由圖可知，研究生讀者對采訪工作的參與程度與借閱需求極度不對稱（薦購書目冊次與借閱冊次比值小于0.05）；由于我館采訪模式的設(shè)置，教職工對采訪工作的參與程度較高；本?？粕c全英語實(shí)驗(yàn)班的參與程度處于較低水平。

在制備的三種DMN 中DMN-A 的載藥量最低，這是因?yàn)槠渲煌ㄟ^微針針體載藥，相比于其余兩者載藥空間最小。盡管載藥量較低，在釋放時(shí)由于針體最先穿過角質(zhì)層與體液接觸，因此，DMN-A 釋放速率遠(yuǎn)高于其余兩者，在4 h 已基本釋放完全。背襯層載藥明顯增加了載藥空間，DMN-B 載藥量約為DMN-A 的5.75 倍。但DMN-B 釋放速率最慢，在最初30 min 釋放極少，較DMN-A 呈現(xiàn)更明顯的緩釋趨勢[8]。這是由于，DMN-B 需要先溶解進(jìn)入皮膚的前端針體，然后再釋放。由于針體與背襯層均載藥，載藥空間最大，DMN-C 載藥量最高，約為DMN-A 的6.82 倍。在體外透皮釋放時(shí)，DMN-C 針體溶解后在前期較DMN-B 也有明顯釋放，背襯層的緩慢釋放也較DMN-A 持久。盡管DMN-C 兼具DMN-A 兩者特性，但其在6 h 后仍有釋放，甚至8 h 依舊未釋放完全。而微針在穿透活體動(dòng)物的角質(zhì)層后，微孔道在6 h 基本恢復(fù)，8 h 恢復(fù)完全[8-9]。DMN-B、DMN-C 有部分在背襯層中的藥物滯留在角質(zhì)層外。因此，DMN-C相較DMN-A 雖顯著提高了載藥量，仍存在優(yōu)化空間。后續(xù)可改進(jìn)針體及靠近微針的前部背襯層用于載藥，而靠后的背襯層部分不載藥，調(diào)整其比例，使DMN-C 在6 h 內(nèi)釋放完全。