基于GEO 數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討扶正化瘀膠囊抗肝纖維化作用機制

陳松鶴 王 燕 龔雯婷 陳 燁 虞 聽

肝纖維化是由于各種原因引起的慢性肝損傷在創(chuàng)面愈合過程中，肝細(xì)胞再生、膠原活化和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積導(dǎo)致的結(jié)果[1]，屬于病理學(xué)的概念。肝纖維化可進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化、肝癌，甚至導(dǎo)致死亡。針對肝纖維化病因治療后，肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的，但臨床上并未有相應(yīng)的化學(xué)藥物[2]。肝纖維化中醫(yī)上屬于“積聚”“脅痛”“癥瘕”范疇，病機主要責(zé)之于正虛、濕熱、痰瘀、濁毒為主。中醫(yī)藥在該病治療上其有獨特優(yōu)勢，中成藥是諸多中醫(yī)治療的一種，相較于傳統(tǒng)中藥湯劑具有免煎便捷，口感良好的優(yōu)點。近年來，扶正化瘀膠囊作為治療肝纖維化的中成藥之一，臨床上多為療效研究，但對其作用機制的探索較少。本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫差異基因分析聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接驗證的方法對扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的機制進(jìn)行初步探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 肝纖維化差異性基因的篩選 運用GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），以“l(fā)iver fibrosis”為檢索詞檢索并下載與肝纖維化相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用R 軟件對下載數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P＜0.05 且|logFC|≥1.5 為條件篩選差異表達(dá)基因，并繪制熱圖和火山圖。

1.2 扶正化瘀膠囊有效成分與靶點篩選 運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com/），以“丹參、冬蟲夏草、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子”6 種中藥為檢索詞，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，篩選出扶正化瘀膠囊的主要有效成分和對應(yīng)靶點。

1.3 扶正化瘀膠囊有效成分對應(yīng)靶點標(biāo)準(zhǔn)化處理利用Uniport（https://www.uniport.org/）數(shù)據(jù)庫和Perl工具將已篩選的扶正化瘀膠囊主要有效成分對應(yīng)的靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名。

1.4 “中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.9.0 軟件對扶正化瘀膠囊中各中藥、成分、靶點進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“中藥-成分-靶點”中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點蛋白的篩選 利用STRING（https://string-db.org/Version 11.0）數(shù)據(jù)庫對扶正化瘀膠囊作用于肝纖維化的潛在靶點進(jìn)行分析，限定人種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI，最低互動評分設(shè)置0.04，導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和TSV 文件。將導(dǎo)出的TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，通過CytoNCA 插件分析并篩選出核心靶點蛋白。

1.6 基因本體（GO）功能富集分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析 將藥物與疾病的共同靶點導(dǎo)入DAVID（https://david.Ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫，利用R 軟件進(jìn)行GO 和KEGG（P＜0.05）信號通路富集分析，并繪圖以可視化。

1.7 分子對接 選取PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點蛋白對應(yīng)的有效成分，在PubChen、PDB 數(shù)據(jù)庫下載小分子配體和受體蛋白，運用AuToDockTool、Vana 軟件進(jìn)行的分子對接，并通過PyMol 軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化差異基因 從GEO 數(shù)據(jù)庫搜索篩選得到基因芯片GSE197112，包括4 個肝纖維化患者樣本（GSM5909322、GSM5909323、GSM5909324、GSM 5909325）和4 個正常的樣本（GSM5909318、GSM590 9319、GSM5909320、GSM5909321）。通過R 軟件以“P＜0.05 且|logFC|≥1.5”對所得基因進(jìn)行差異分析，得到差異性基因8478 個，上調(diào)基因4252 個，下調(diào)4225 個，并繪制熱圖及火山圖（見圖1A-B）。圖1A中左側(cè)為正常組，右側(cè)為肝纖維化組，紅色為高表達(dá)，綠色為低表達(dá)，黑色為無差異。圖1B 中火山圖中左側(cè)綠色區(qū)域為下調(diào)基因，右側(cè)紅點區(qū)域為上調(diào)基因，黑色區(qū)域為無差異。

圖1 A 為正常組與肝纖維化組差異基因熱圖；B 為正常組與肝纖維化組差異基因火山圖；C 為“中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；D為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.2 扶正化瘀膠囊有效成分及靶點基因的獲取 通過TCMSP 平臺以O(shè)B≥30%及DL≥0.18 為篩選條件，得到丹參成分65 種，靶點2567 個；冬蟲夏草成分7 種，靶點384 個；桃仁成分23 種，靶點342 個；松花粉成分2 種，靶點157 個；絞股藍(lán)成分24 種，靶點623 個；五味子成分8 種，靶點995 個。通過Uniport 數(shù)據(jù)庫和Perl 工具將扶正化瘀膠囊的有效成分對應(yīng)靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理轉(zhuǎn)換成Gene Symbol，去重后得到有效靶點基因1261 個。

2.3 “中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用Cytoscape 3.9.0 軟件將扶正化瘀膠囊的“中藥-成分-靶點”進(jìn)行可視化展示，建立中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（見圖1C）。圖中共有135 個節(jié)點，262 條邊，外圈為扶正化瘀膠囊的中藥成分，中間紅色區(qū)域為潛在靶點，其中degree 數(shù)值越大，圖形越大，顏色越深，通過節(jié)度值分析參與調(diào)控的主要成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA 等。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點的篩選 利用STRING 數(shù)據(jù)庫分析潛在靶點基因，以“minimum required interaction score≥0.04”為條件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（見圖1D）。圖中共有67 個節(jié)點，368 條邊，平均節(jié)點數(shù)為10.1。通過PPI 所得TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，運用CytoNCA 插件進(jìn)行分析，分別以betweenness centrality（BC）、closeness centrality（CC）、degree centrality（DC）、eigenvector centrality（EC）、LAC 大于等于中位數(shù)為過濾條件進(jìn)行篩選，最終得出MMP9、CASP3、IL1B、CCL2、MYC、ESR1、VEGFA、CDKN1A、RELA 共9 個核心靶點，35條邊，見圖2。

圖2 核心靶點的篩選

2.5 GO 與KEGG 富集分析 將扶正化瘀膠囊與肝纖維化交集的67 個的靶點基因進(jìn)行GO 和KEGG富集分析。GO 富集分析分別從生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）三個方面進(jìn)行分析并選取前10 的條目，KEGG 富集分析選取靠前的30 個條目。GO 富集結(jié)果顯示生物過程可能與對異物刺激、活性氧及代謝過程、氧氣水平、類固醇激素的、脂多糖等的反應(yīng)有關(guān)；細(xì)胞成分方面可能與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物，膜筏，染色體區(qū)域等有關(guān)；分子功能方面可能與類固醇激素受體活性，核受體活性，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性，轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合，DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等有關(guān)（見圖3A）。KEGG 富集分析結(jié)果共涉及36 條通路，見圖3B。

圖3 A 為GO 功能富集分析；B 為KEGG 通路富集分析

2.6 分子對接驗證 選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選的核心靶點蛋白中靠前的MMP9、CASP3、CCL2 和IL1B 與對應(yīng)的有效成分quercetin（槲皮素）通過Vana 與PyMol軟件進(jìn)行分子對接處理。四者的最低的結(jié)合能分別為-7.2、-6.8、-7.4 和-10 kcal/mol，提示四者均具有較好的的結(jié)合活性和穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象，見圖4。

圖4 槲皮素與靶點蛋白分子對接驗證

3 討論

本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫差異基因分析聯(lián)合中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接驗證的方法初探扶正化瘀膠囊抗肝纖維化的作用機制，通過構(gòu)建“中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)度值分析扶正化瘀膠囊參與調(diào)控的主要成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹參酮ⅡA 等。研究表明，槲皮素具有保肝和抗纖維化作用，其機制可能與通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads 和PI3K/Akt 通路之間的串?dāng)_來減弱肝星狀細(xì)胞活化和減少自噬有關(guān)[3]。木犀草素能有效減輕肝纖維化[4]，同時降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平[5]。山奈酚作為一種黃酮類產(chǎn)物能顯著降低壞死性炎癥評分和膠原沉積肝組織，改善肝纖維化形成[6]。丹參酮ⅡA 是丹參的主要成分，廣泛應(yīng)用于肝病治療當(dāng)中。肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化的主要事件，丹參酮ⅡA 能抑制血管緊張素Ⅱ以抑制肝星狀細(xì)胞的增值，從而對肝纖維化具有預(yù)防和治療作用[7]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示共有67 個節(jié)點，368 條邊，并運用CytoNCA 插件分析得到MMP9、CASP3、IL1B、CCL2、VEGFA 等核心靶點9 個。MMP9 是基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP9 在纖維化消退中起著關(guān)鍵作用[8]。CASP3 是一種細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶，支持肝細(xì)胞CASP3的激活在非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)細(xì)胞凋亡、纖維化中起著重要作用，CASP3 的失活能防止肝細(xì)胞死亡，并改善肝纖維化[9]。IL1B 基因在HBV 引起的慢性肝臟炎癥的發(fā)病機制中起重要作用，并被認(rèn)為可能會增加NASH 的易感性并賦予肝實質(zhì)損傷的更高風(fēng)險[10]。CCL2 可能是聯(lián)系肝臟炎癥、纖維化、血管新生這三個關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)的紐帶。楊萍等[11]研究表明，CCL2 具有促進(jìn)HSC 活化及肝纖維化進(jìn)展的作用。VEGFA 可通過被抑制減少HF 的病理性血管生成以減輕肝纖維化。綜上所述，扶正化瘀膠囊抗肝纖維化具有多成分、多靶點的特點[12]。

GO 富集分析顯示，生物過程可能對異物的刺激、活性氧及代謝過程、氧氣水平、類固醇激素、脂多糖等反應(yīng)有關(guān)。許多不同的藥物和外源性物質(zhì)可損傷膽管上皮并引起炎癥性膽管疾病[13]。氧化應(yīng)激（OS）介導(dǎo)了纖維化的進(jìn)展，并且OS 相關(guān)分子可能充當(dāng)與肝纖維化有關(guān)的分子和細(xì)胞事件的介質(zhì)?；钚匝醯漠a(chǎn)生在肝損傷和肝纖維化發(fā)生中起重要作用，能誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死和凋亡，并放大炎癥反應(yīng)?；钚匝踹€刺激Kupffer 細(xì)胞和循環(huán)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生促纖維化介質(zhì)，并直接激活肝星狀細(xì)胞導(dǎo)致纖維化[14]。許多類固醇激素通過微調(diào)與脂質(zhì)合成、輸出和代謝相關(guān)基因的表達(dá)，成為脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑[15]，故通過調(diào)節(jié)類固醇激素水平可作為潛在預(yù)防NAFLD 的干預(yù)措施。分子功能方面可能與類固醇激素受體活性，核受體活性，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性，轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，細(xì)胞因子受體結(jié)合，轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合，DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等有關(guān)。研究表明，某種FXR 激動劑如BAR704 能通過干擾肝星狀細(xì)胞中的TGFβ-SMAD3 通路，增加短異二聚體伴侶（SHP）的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)該核受體與SMAD3 的結(jié)合，從而消除磷酸鹽的結(jié)合以減少肝纖維化[16]。相互連接的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)不僅促進(jìn)了肝細(xì)胞功能障礙，而且還引導(dǎo)了NASH 和纖維化進(jìn)展所需的肝內(nèi)串?dāng)_[17]。

KEGG 富集分析靠前的通路最可能與AGERAGE 信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用，TNF 信號通路，流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化，IL-17 信號通路，NF-κB 信號通路脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等有關(guān)。研究表明，AGEs-RAGE 軸在肝損傷和NAFLD 發(fā)病機制中起著重要作用[18]，若晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的增加，能誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞通過自噬激活導(dǎo)致丙型肝炎相關(guān)纖維化[19]。腫瘤壞死因子（TNF）-α與肝纖維化有關(guān)，具有肝毒性，膽汁淤積產(chǎn)生的TNF-α 可通過HSC 產(chǎn)生TIMP-1 促進(jìn)肝纖維化[20]。IL-17 是一種促炎癥因子，在諸多肝病尤其是在肝纖維化的進(jìn)展中起著重要作用。高脂肪飲食和高乳脂快餐飲食能促使小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性大泡和微泡脂肪變性、肝臟炎癥、纖維化及動脈粥樣硬化[21]。扶正化瘀膠囊可能通過干預(yù)腫瘤壞死因子、促炎癥因子、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路來減輕肝纖維化，達(dá)到護(hù)肝作用。

綜上所述，本文運用GEO 數(shù)據(jù)庫疾病差異基因分析聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接驗證的方法，初步探索扶正化瘀膠囊抗肝纖維的作用機制，主要涉及腫瘤壞死因子、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝等方面，為后期進(jìn)一步實驗提供理論參考。