7省16個(gè)產(chǎn)地一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素含量測(cè)定與相關(guān)性分析

吳玲芬 李 敏 陳芝華

一枝黃花系菊科多年生草本植物一枝黃花Solidago decurrens Lour.的干燥全草，收錄于2020 年版《中國(guó)藥典》，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[1-2]。一枝黃花在我國(guó)南方各省均有分布，包括江蘇、浙江、江西、云南等省，別名蛇頭王、見(jiàn)血飛、金鎖鑰、滿山黃等[3]。一枝黃花富含黃酮、酚酸、萜類等多種活性成分，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等生理活性[4-6]。目前對(duì)于一枝黃花的研究鮮有含量測(cè)定，報(bào)道也僅限于單成分與少數(shù)產(chǎn)地[7-8]。黃酮類與酚酸類是一枝黃花的主要藥效成分，包括蘆丁、綠原酸、槲皮素等，其中蘆丁是2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[1]。因此，我們收集了一枝黃花主產(chǎn)區(qū)的16 份新鮮藥材資源，對(duì)其農(nóng)藝性狀、蘆丁、綠原酸、槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定，并分析了其與經(jīng)緯度、海拔間的相關(guān)性，以期為一枝黃花優(yōu)良種質(zhì)篩選及藥材質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 2021 年9 月至2021 年10 月，收集江蘇、湖北、浙江、貴州、江西、云南、陜西等7 省16個(gè)產(chǎn)地一枝黃花新鮮健康植株，由麗水市人民醫(yī)院陳芝華主管藥師鑒定為菊科一枝黃花Solidago decurrens Lour.，見(jiàn)表1。

表1 供試一枝黃花種質(zhì)資源

蘆丁（B20771）、綠原酸（B20781）、槲皮素（B20527）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，乙腈（色譜級(jí)）、甲醇（色譜級(jí)）購(gòu)于杭州寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司，甲醇、乙醇、冰醋酸等均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀測(cè)定 挑取每個(gè)產(chǎn)地健康完整的新鮮植株，用卷尺測(cè)量株高，用游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗，隨機(jī)選擇3 片葉片，用直尺測(cè)量葉長(zhǎng)與葉寬，計(jì)算葉長(zhǎng)寬比為葉長(zhǎng)與葉寬的比值，n=15。

1.2.2 蘆丁、綠原酸、槲皮素含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 安捷倫1260 色譜儀（Agilent Eclipse XDB-C18 色譜柱，4.6×250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈—0.2%醋酸水，流速1.0 mL/min，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)（326 nm、360 nm、371 nm），進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 一枝黃花HPLC 色譜圖樣品（a）與標(biāo)準(zhǔn)品（b）（1，蘆?。?，綠原酸；3，槲皮素）

1.2.2.2 線性關(guān)系考察 配制1 mL 含蘆丁162.40 μg、綠原酸158.00 μg、槲皮素161.52 μg 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0 mL混合標(biāo)品溶液，用甲醇定容至10 mL 容量瓶，取適量溶液過(guò)0.45 μm 濾膜，在“1.2.2.1 色譜條件”下測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系考察

1.2.2.3 樣品含量測(cè)定 精密稱取一枝黃花樣品粉末0.2 g，加入70%乙醇50 mL 提取，室溫下超聲提取30 min（600 W，40 kHz），旋干后，用純甲醇定容至25 mL 容量瓶，取適量溶液過(guò)0.45 μm 濾膜，在“1.2.2.1 色譜條件”下測(cè)定峰面積，n=3。

1.2.2.4 精密度考察 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“1.2.2.1 色譜條件”依次進(jìn)樣6 次（n=6），蘆丁、綠原酸、槲皮素峰面積RSD 分別為0.73%、0.88%與1.33%，表明本試驗(yàn)儀器精密度良好。

1.2.2.5 穩(wěn)定性考察 隨機(jī)取一枝黃花SD14 樣品，按照“1.2.2.3 樣品含量測(cè)定”制備樣品溶液，室溫避光條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定蘆丁、綠原酸、槲皮素含量（n=6），得RSD 分別為2.92%、2.38%與1.84%，表明一枝黃花樣品溶液在室溫避光條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.2.6 重復(fù)性考察 隨機(jī)取一枝黃花SD8 樣品，精密稱取樣品6 份，按照“1.2.2.3 樣品含量測(cè)定”下測(cè)定蘆丁、綠原酸、槲皮素含量（n=6），得SD8 平均含量分別為0.32%、0.36%與0.29%，RSD 分別為1.09%、2.76%與2.41%，表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

1.2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 隨機(jī)取一枝黃花SD12樣品，精密稱取樣品6 份，加入適量蘆丁、綠原酸與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，按照“1.2.2.3 樣品含量測(cè)定”下測(cè)定蘆丁、綠原酸、槲皮素含量（n=6），計(jì)算加樣回收率=（檢測(cè)量－樣品中量）/加入標(biāo)品量×100%，各含量加樣回收率見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率考察

表4 不同產(chǎn)地一枝黃花農(nóng)藝性狀、蘆丁、綠原酸、槲皮素含量比較

1.2.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用ANOVA 單因素分析，聚類分析按照歐式距離進(jìn)行劃分，采用組內(nèi)連接法（Within-groups linkage）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地一枝黃花農(nóng)藝性狀、有效成分含量比較分析 16 個(gè)產(chǎn)地一枝黃花農(nóng)藝性狀、蘆丁、綠原酸、槲皮素含量存在差異。農(nóng)藝性狀方面，云南產(chǎn)一枝黃花植株生長(zhǎng)勢(shì)較好，其中云南屏邊樣品在株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬指標(biāo)最高，分別達(dá)105.42、0.46、8.45與1.45 cm；湖北與陜西產(chǎn)一枝黃花植株較矮，其中湖北長(zhǎng)陽(yáng)株高、陜西寧強(qiáng)莖粗、湖北巴東葉長(zhǎng)、陜西太白葉寬指標(biāo)最低，分別為55.43、0.29、4.98 與0.85 cm；江蘇句容植株葉片最為狹長(zhǎng)，葉長(zhǎng)寬比為6.96，而湖北巴東植株葉片最為寬鈍，葉長(zhǎng)寬比僅為4.45。有效成分含量方面，浙江產(chǎn)一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素成分含量較高，其中浙江縉云蘆丁與槲皮素含量、浙江景寧綠原酸含量指標(biāo)最高，分別為0.37%、0.31%與0.36%；而陜西寧強(qiáng)樣品蘆丁含量、云南富寧綠原酸含量、湖北長(zhǎng)陽(yáng)槲皮素含量指標(biāo)最低，分別為0.12%、0.09%與0.07%，見(jiàn)表3。

2.2 相關(guān)性分析 16 個(gè)產(chǎn)地一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素含量與農(nóng)藝性狀、經(jīng)緯度、海拔間存在相關(guān)性（見(jiàn)表5）。蘆丁含量與莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、經(jīng)度呈正相關(guān)關(guān)系，其中與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.563（P＜0.05），與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.649（P＜0.01），與株高、緯度相關(guān)性較低；綠原酸含量與葉寬、經(jīng)度、緯度呈正相關(guān)關(guān)系，其中經(jīng)度為顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.664（P＜0.01），與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.532（P＜0.05），與株高、莖粗、葉長(zhǎng)相關(guān)性較低；槲皮素含量與株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉長(zhǎng)寬比、經(jīng)度均呈正相關(guān)，其中與經(jīng)度為顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.557（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素成分含量與農(nóng)藝性狀、生境因子間的相關(guān)性系數(shù)

2.3 聚類分析 以農(nóng)藝性狀、蘆丁、綠原酸、槲皮素含量為指標(biāo)，可將16 個(gè)產(chǎn)地一枝黃花劃分為4 個(gè)居群（見(jiàn)圖2）。居群Ⅰ共5 個(gè)產(chǎn)地，為江蘇宜興、陜西寧強(qiáng)、陜西太白，該居群一枝黃花植株矮小，莖細(xì)，葉片較小，陜西寧強(qiáng)、陜西太白樣品3 種成分含量較低，江蘇宜興樣品蘆丁與綠原酸含量中等，槲皮素含量較高；居群Ⅱ共6 個(gè)產(chǎn)地，為江蘇溧陽(yáng)、江西浮梁、貴州赤水、江西婺源、江蘇句容與貴州凱里，該居群植株中等高度，莖中等粗度，葉片除江蘇溧陽(yáng)較寬鈍外，其余偏狹長(zhǎng)，本居群中江西、貴州產(chǎn)地3 種有效成分中等含量，而江蘇產(chǎn)地有效成分含量較高；居群Ⅲ共3 個(gè)產(chǎn)地，均是浙江產(chǎn)地，為浙江臨安、浙江縉云、浙江景寧，該居群植株較高，生長(zhǎng)勢(shì)較好，莖粗，葉片大而多偏狹長(zhǎng)，3 種有效成分含量最高；居群Ⅳ共2 個(gè)產(chǎn)地，為云南屏邊與云南富寧，云南產(chǎn)一枝黃花植株最高，莖粗，葉片大而偏狹長(zhǎng)，但3 種有效成分較低。

圖2 聚類分析圖

3 討論

一枝黃花是我國(guó)傳統(tǒng)藥材，臨床應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)探討了提取方法（索氏提取、加熱回流、超聲），提取時(shí)間（20、30、40 min），溶劑提取濃度（70%、95%、純乙醇）及流動(dòng)相（乙腈—水，乙腈—醋酸水，甲醇—醋酸水）對(duì)一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素含量測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)這3 種成分在70%乙醇作為提取溶劑，室溫條件超聲提取（600 W，40 kHz）30 min，即可提取完全，在“1.2.2.1 色譜條件”下蘆丁（360 nm）、綠原酸（326 nm）、槲皮素（371 nm）出峰時(shí)間分別為7.19、13.25、16.45 min，分離度與峰型較好，理論塔板數(shù)均不低于2500。本試驗(yàn)建立的HPLC 切換波長(zhǎng)法可同時(shí)檢測(cè)一枝黃花中蘆丁、綠原酸與槲皮素的含量，方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。

藥用植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累受遺傳因素、土壤、光照、經(jīng)緯度、海拔等諸多因素的影響[9]。本試驗(yàn)收集的16 個(gè)產(chǎn)地中，浙江產(chǎn)一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素含量最高，江蘇、湖北、貴州產(chǎn)地其次，而江西、云南、陜西產(chǎn)地相對(duì)較低。從蘆丁含量看，16 個(gè)產(chǎn)地一枝黃花均滿足2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的蘆丁不低于0.10%的含量標(biāo)準(zhǔn)，表明一枝黃花總體藥材質(zhì)量較好。相關(guān)性分析顯示，一枝黃花中蘆丁、綠原酸、槲皮素含量均與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)，與海拔呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果提示在本試驗(yàn)經(jīng)度與海拔范圍內(nèi)，高經(jīng)度、低海拔種植一枝黃花，有利于其藥材中蘆丁、綠原酸、槲皮素含量積累。