宏基因組測(cè)序在實(shí)體器官移植術(shù)后肺部感染患者中的應(yīng)用價(jià)值初探

姜寒水 魯爾旦 吳國(guó)明 祝 艷 劉晴晴 李宗煜 陸 明

實(shí)體器官移植（solid organ transplantation，SOT）技術(shù)日趨成熟，SOT 術(shù)后受者需長(zhǎng)期使用免疫抑制劑來(lái)預(yù)防和治療排斥反應(yīng)，使得細(xì)胞免疫和體液免疫功能低下，繼發(fā)各種病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，其中以肺部感染最常見(jiàn)[1]。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法包括病原體培養(yǎng)、抗原抗體檢測(cè)等，但陽(yáng)性率不盡理想且耗時(shí)較長(zhǎng)。宏基因組測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）可通過(guò)測(cè)定微生物核酸序列，快速、準(zhǔn)確、廣覆蓋地獲得樣本中病原體群體的基因組信息，已越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床[2]。本研究對(duì)57 例肝移植及腎移植術(shù)后發(fā)生肺部感染的受者資料進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2018 年6 月至2020 年7 月在樹(shù)蘭（杭州）醫(yī)院住院治療的57 例診斷為肺部感染的肝移植和腎移植受者，均行纖維支氣管鏡檢查并采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），接受mNGS 和傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法的有19 例，為mNGS 組；采用傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法的有38 例，為傳統(tǒng)方法組。本研究通過(guò)樹(shù)蘭（杭州）醫(yī)院科研倫理委員會(huì)審核（批件號(hào)：KY2022063）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《實(shí)體器官器官移植術(shù)后感染診療技術(shù)規(guī)范（2019 版）》[3]中，細(xì)菌性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：SOT 術(shù)后符合以下第4 條或前3 條中任何2 條：（1）新近出現(xiàn)的咳嗽咳痰或原有呼吸道疾病加重，并出現(xiàn)膿性痰或膿性氣道分泌物，伴或不伴胸痛；（2）發(fā)熱，體溫 ＞38 ℃；（3）外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10×109/L 或＜4×109/L，伴或不伴細(xì)胞核左移；（4）影像學(xué)檢查：胸部影像學(xué)檢查顯示新出現(xiàn)或進(jìn)展性片狀、斑片狀浸潤(rùn)性陰影或段實(shí)變影，伴或不伴胸腔積液。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有支氣管鏡檢查禁忌者。（2）肺部病灶由明顯非感染性因素導(dǎo)致，如藥物相關(guān)肺毒性。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 觀察指標(biāo) 收集納入病例的年齡、性別、移植類型、感染發(fā)生時(shí)間、確診時(shí)間、病原學(xué)結(jié)果采信率、住院天數(shù)等指標(biāo)。所有病例均在入院第2 天行纖維支氣管鏡檢查并采集BALF，傳統(tǒng)方法組用BALF 進(jìn)行細(xì)菌、真菌、抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)等傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)。mNGS 組行常規(guī)傳統(tǒng)檢測(cè)方法同時(shí)送檢mNGS。

1.4.2 方 法 所有BALF 標(biāo)本在獲取后1 h 內(nèi)送本院檢驗(yàn)科，進(jìn)行細(xì)菌涂片及培養(yǎng)（鄭州安圖生物，哥倫比亞血瓊脂平板，批號(hào)20200730B，巧克力瓊脂平板，批號(hào)20200412B），真菌涂片及培養(yǎng)（鄭州安圖生物，沙保羅瓊脂平板，批號(hào)20200527B），結(jié)核涂片及培養(yǎng)（結(jié)核BactecMGIT960 液體培養(yǎng)基，批號(hào)7166829）。呼吸道多項(xiàng)病原體抗原抗體檢測(cè)采用間接熒光法檢測(cè)（北京貝爾生物，腺病毒20200411，合胞病毒20200427，肺炎支原體20200517，肺炎衣原體20200421，甲型流感病毒20200421，乙型流感病毒20200421，埃可病毒20201203，柯薩奇病毒20201228，副流感病毒20200112）。利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（Gene Xpert MTB/RIF）采用巢式熒光PCR 方法（Gepheid AB，批號(hào)1000134732）檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB 基因。六胺銀染色檢測(cè)耶氏肺孢子菌（珠海貝索生物，批號(hào)C210901）。mNGS 按TIANamp MicrDNA 試劑盒（華大基因，鄂漢械備20190039 號(hào)）步驟提取DNA，超聲破碎至200～300 bp 大小片段。使用Agilent 2100 對(duì)DNA 文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)控，環(huán)化后的文庫(kù)加載到測(cè)序芯片，使用BGISEQ-50 進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾掉低質(zhì)量及小于35 bp 的數(shù)據(jù)，獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)通過(guò)BWA網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)匹配到某種病原體的序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)高低及臨床其他指標(biāo)判斷可能的病原體。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用SW 檢驗(yàn)檢測(cè)正態(tài)性。正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述。如方差齊性采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，方差不齊性資料采用近似t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)±（25%分位數(shù)，75%分位數(shù)）[M±（P25，P75）]描述，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。定性資料采用χ2檢驗(yàn)，若理論頻數(shù)T＜5 但T≥1，采用連續(xù)性校正的卡方進(jìn)行檢驗(yàn)，如果理論頻數(shù)T＜1，則用Fisher 確切概率法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS 組及傳統(tǒng)方法組一般資料比較 mNGS組19 例，其中男15 例，女4 例，中位年齡46（27～67）歲，肝移植病例8 例，腎移植病例11 例，中位肺部感染發(fā)生時(shí)間為移植術(shù)后5（0.5～45）個(gè)月。傳統(tǒng)方法組38 例，男29 例，女9 例，中位年齡54（16～65）歲，肝移植病例15 例，腎移植病例23 例，中位肺部感染發(fā)生時(shí)間為移植術(shù)后9（1～216）個(gè)月。兩組間年齡與肺部感染發(fā)生時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組間性別及肝腎移植比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。mNGS 組BALF 病原學(xué)檢出陽(yáng)性率94.74%（18/19），傳統(tǒng)方法組病原學(xué)陽(yáng)性率47.36%（18/38），兩組間檢出陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組實(shí)體器官移植術(shù)后肺部感染患者臨床資料比較

2.2 mNGS 組及傳統(tǒng)方法組檢出病原體分布情況分析 兩組患者病原學(xué)陽(yáng)性檢出共計(jì)36 例，其中耶氏肺孢子菌是檢出最多的病原體，達(dá)到44.4%（16/36），其次為巨細(xì)胞病毒，達(dá)到27.8%（10/36）。16 例耶氏肺孢子菌病例中有13 例為腎移植患者，僅3 例為肝移植患者。巨細(xì)胞病毒也在腎移植患者中更多見(jiàn)。比較mNGS 組和傳統(tǒng)方法病原菌的檢出情況，可發(fā)現(xiàn)巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒、流感嗜血桿菌、軍團(tuán)菌通過(guò)傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)到，而mNGS 則有一定優(yōu)勢(shì)。3例結(jié)核分枝桿菌均用Gene Xpert MTB/RIF 方法檢測(cè)到，但由于此3 例患者并未同時(shí)送檢mNGS，因此無(wú)法得知其對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的可靠性。

mNGS 組19 例患者中，mNGS 檢測(cè)陽(yáng)性為18例，而傳統(tǒng)檢測(cè)方法陽(yáng)性僅為5 例。除了耶氏肺孢子菌、巨細(xì)胞病毒及軍團(tuán)菌這類難以通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)出的特殊病原體之外，曲霉菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌等這類易于被傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢出的病原體通過(guò)mNGS 檢出8 例，僅1 例細(xì)菌培養(yǎng)為肺炎克雷伯桿菌，其mNGS 結(jié)果也與之相符。由此可見(jiàn)mNGS 在常見(jiàn)細(xì)菌、真菌檢出率方面的優(yōu)勢(shì)也遠(yuǎn)勝傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。同時(shí)還可看出傳統(tǒng)方法組檢測(cè)出的5例陽(yáng)性病例結(jié)果與mNGS 組符合率為100.0%（見(jiàn)表2）。mNGS 組中單一檢測(cè)到病原體僅4 例（4/18），分別為肺炎克雷伯桿菌1 例、耶氏肺孢子菌1 例、軍團(tuán)菌1 例、巨細(xì)胞病毒1 例；而混合感染的有14 例（14/18）。

表2 19 例mNGS 組實(shí)體器官移植術(shù)后肺部感染患者病原體檢出情況（例）

3 討論

SOT 患者由于術(shù)后應(yīng)用大劑量免疫抑制劑導(dǎo)致免疫力水平低下，加之肺臟自身的特殊解剖結(jié)構(gòu)，例如屬于開(kāi)放性器官，病原體容易侵犯下呼吸道，多種因素造成肺部感染發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他器官感染。SOT受者肺部感染的程度往往比較嚴(yán)重，一旦發(fā)生感染，病情進(jìn)展迅速，也容易并發(fā)腹腔內(nèi)感染甚至血流感染，且病死率高[3]。因而早期識(shí)別感染病原體可優(yōu)化抗感染治療方案，縮短住院天數(shù)，改善生存率[4-5]。

mNGS 直接從樣品中提取基因組DNA 后進(jìn)行測(cè)序分析，將所測(cè)序列與專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得出樣本中所含物種的信息，通過(guò)嚴(yán)格的宏基因組拼接，可獲得較長(zhǎng)的DNA 片段，若測(cè)序達(dá)到一定的通量，可直接獲得一個(gè)或多個(gè)病原體基因組草圖，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能分析及病原體群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析，可更準(zhǔn)確地反映病原體生存的真實(shí)狀態(tài)[6]。Huang 等[7]對(duì)240 例可疑肺部感染患者的BALF 進(jìn)行mNGS 及傳統(tǒng)病原學(xué)方法檢測(cè)，mNGS 檢測(cè)敏感性88.30%，特異性為81.16%，傳統(tǒng)方法分別為25.73%及88.41%，體現(xiàn)出mNGS 在病原體檢測(cè)上有高靈敏性的巨大優(yōu)勢(shì)。本研究回顧性病例分析2018 年6 月至2020 年7月在樹(shù)蘭（杭州）醫(yī)院住院治療的57 例診斷為肺部感染的肝移植和腎移植受者，采集BALF 進(jìn)行mNGS及傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。mNGS 組病原學(xué)檢出率為94.74%，而傳統(tǒng)方法組僅為47.36%，這與陸瀚瀾等[8]在34 例SOT 術(shù)后肺部感染受者中的研究結(jié)果相似，mNGS 組病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率為92.3%，高于傳統(tǒng)方法組的55.6%。

SOT 患者應(yīng)用抗排異藥導(dǎo)致免疫功能低下，使得肺部感染的病原體譜發(fā)生改變[9]。與陸瀚瀾等[8]研究結(jié)果相似，本研究中SOT 合并肺部感染的受者病原體檢測(cè)到最多的也是耶氏肺孢子菌，其次為巨細(xì)胞病毒、人皰疹病毒、曲霉菌、結(jié)核分枝桿菌。尤其是本研究中腎移植患者耶氏肺孢子菌感染率明顯高于肝移植患者，這也提示耶氏肺孢子菌感染與免疫抑制水平相關(guān)，因?yàn)槟I移植患者需要更大劑量的免疫抑制劑。

綜上所述，本研究中SOT 受者肺部感染病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率方面，mNGS 技術(shù)高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，且縮短確診時(shí)間，對(duì)于耶氏肺孢子菌、巨細(xì)胞病毒等特殊病原體檢測(cè)有較大優(yōu)勢(shì)，顯示其在SOT 受者肺部感染診斷中的良好應(yīng)用前景，但也存在一定的局限性，例如背景菌的摻雜、對(duì)胞內(nèi)菌及厚壁微生物檢出率低、特異性不足等[10-11]。