自體富血小板血漿用于肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

王厚東 張秀峰 裘建明 魯振鋒 沈 忠

肛瘺是常見的肛腸疾病，目前手術(shù)是肛瘺的主要治療方式，但術(shù)后切口愈合緩慢，并且容易假性愈合及復(fù)發(fā)[1-4]。自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是通過差速離心的方法從自體血中提取出來(lái)的血小板濃縮物，近年廣泛應(yīng)用于糖尿病足、慢性下肢靜脈性潰瘍、壓瘡等難愈性創(chuàng)面的臨床治療，效果良好[5-7]，而PRP 在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)方面的研究較少。本研究通過在豬肛瘺術(shù)后創(chuàng)面局部注射PRP，觀察術(shù)后創(chuàng)面的愈合效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量30 kg 雄性巴拿馬豬10 只[上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心清潔級(jí)動(dòng)物房的標(biāo)準(zhǔn)籠中，使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012。標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件為溫度26 ℃，濕度50%，環(huán)境噪聲＜60 dB。動(dòng)物飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，所有動(dòng)物相關(guān)操作均遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)定及條例。

1.2 主要試劑及儀器 豬促血管生成素素-2（angiopoietin-2，ANG-2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0455O2；豬表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epideermal growth factor，EGF）ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0416O2；豬白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0418O2；豬白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12）ELISA 試劑盒，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0864O2；重組Anti-Vimentin 抗體，Abcam 公司，Ab92547；豬CD34 雙抗，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-77718；Medifuge 離心機(jī)，意大利Silfradent 公司；酶標(biāo)儀，MD 公司；正置熒光顯微鏡，日本尼康；成像系統(tǒng)，日本尼康。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肛瘺造模 肌肉注射速眠新Ⅱ號(hào)（2 mg/kg）和阿托品（0.05 mg/kg）誘導(dǎo)麻醉，氣管插管后予以3%異氟烷3 L/min 維持麻醉。麻醉成功后，取仰臥位，固定好四肢及尾部。清理殘留豬肛管內(nèi)糞便后碘伏消毒肛周直徑約15 cm 范圍及肛管，鋪巾。參考A Ba-Bai-Ke-Re 等[8]的掛線法造瘺。右側(cè)位距離肛緣約3 cm 做一大小約0.5 cm 切口，血管鉗鈍性分離皮下組織至齒狀線上，注意避開肛門括約肌，血管鉗由齒狀線上突破直腸黏膜穿出，引入絲線，在絲線引導(dǎo)下穿入橡皮筋，并固定，同法在左側(cè)位對(duì)稱部位做一掛線（見圖1）。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物掛線手術(shù)操作均為同一實(shí)驗(yàn)員。

圖1 肛瘺造模

1.3.2 瘺管造影評(píng)估瘺管形成 術(shù)后第28 天去掉橡皮筋，第38 天進(jìn)行瘺管造影評(píng)估瘺管形成情況。麻醉后取仰臥位，兩后肢充分外展，清理豬肛管及下端直腸內(nèi)殘留糞便，輕柔置入60 mL 注射器外套筒，注意避免損傷腸黏膜，待C 臂機(jī)攝片確定合適位置后，實(shí)驗(yàn)員穿著鉛衣，做好個(gè)人防護(hù)，予以泛影普胺自瘺管外口緩慢注入，防止外漏，邊注入邊攝片，觀察瘺管管腔是否形成。

1.3.3 肛瘺切除及內(nèi)口關(guān)閉 瘺管造影提示所有實(shí)驗(yàn)豬的瘺管造模成功，麻醉成功后，沿著外口距離外口邊緣1.0 cm 做標(biāo)記，環(huán)形切開皮膚及皮下組織，銳性結(jié)合鈍性分離瘺管至內(nèi)口處，右手提起外口及瘺管，可觸及內(nèi)口處粘膜凹陷，絲線全層荷包縫合內(nèi)口處后，切除瘺管，創(chuàng)面充分止血，切除標(biāo)本送病理學(xué)檢查，見圖2。

圖2 肛周瘺管切除術(shù)

1.3.4 PRP、乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）的制備與使用 術(shù)后第3 天，抽取10 mL 外周靜脈血，按照差速離心機(jī)說(shuō)明書要求選擇PRP 模式，進(jìn)行差速離心。離心得到的產(chǎn)物抽取紅細(xì)胞上層約2 mL 液體為富含血小板的PRP，剩余上層液體則為PPP，留取樣本進(jìn)行血常規(guī)檢查PRP、PPP 及外周靜脈血中血小板濃度。

清理手術(shù)創(chuàng)面，采用自身對(duì)照，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左右側(cè)創(chuàng)面隨機(jī)分為PRP 組與PPP 組。生理鹽水及碘伏沖洗創(chuàng)面后，PRP 組側(cè)創(chuàng)面予以PRP 注射，PPP 組側(cè)創(chuàng)面予以PPP 局部注射。注射范圍為創(chuàng)面及皮膚創(chuàng)緣0.5 cm，針距間隔1.0 cm，深度0.5 cm，每點(diǎn)注射0.1 mL。

1.3.5 隨訪創(chuàng)面愈合情況及免疫組化分析 隨訪觀察切口愈合情況，待創(chuàng)面閉合后行B 超檢查進(jìn)一步評(píng)估創(chuàng)面愈合情況。愈合標(biāo)準(zhǔn)為：肛瘺分泌物消失，創(chuàng)面愈合良好。甲級(jí)愈合：愈合優(yōu)良，沒有不良反應(yīng)的初期愈合；乙級(jí)愈合：愈合欠佳，愈合處有炎癥反應(yīng)，如紅腫、硬結(jié)、血腫、積液等但未化膿；丙級(jí)愈合：切口化膿，需切開引流。術(shù)后第12 天取創(chuàng)面組織標(biāo)本，ELISA 檢測(cè)組織樣本中EGF，Ang-2、IL-6、IL-12含量，免疫組化檢測(cè)CD34 表達(dá)水平以及免疫熒光檢測(cè)波形蛋白（Vimentin）表達(dá)情況。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 檢驗(yàn)；兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造影及瘺管病理檢查結(jié)果 10 只豬20 條瘺管造影提示造模成功（見圖3），病理結(jié)果可見管腔內(nèi)肉芽組織及管壁纖維組織，見圖4。

圖3 瘺管造影

圖4 瘺管病理圖片（HE 染色，400×）

2.2 外周靜脈血、PRP 及PPP 中血小板濃度比較常規(guī)檢查顯示，周靜脈血、PPP 及PRP 中血小板平均濃度為（194.10±44.44）×109/L、（80.90±28.58）×109/L、（668.90±188.30）×109/L，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 肛瘺愈合情況 所有瘺管切除后創(chuàng)面均為甲級(jí)愈合，未發(fā)現(xiàn)有明顯假性愈合及不愈合創(chuàng)面（見圖5）。PRP 注射組平均愈合時(shí)間為（16.9±2.0）d，顯著低于PPP 注射組（21.2±2.1）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.660，P＜0.01）。B 超評(píng)估所有創(chuàng)面未見明顯假性愈合。

圖5 術(shù)后隨訪圖片

2.4 EGF、Ang-2、IL-6、IL-12、CD34 及Vimentin 表達(dá)水平 ELISA 結(jié)果顯示，PRP 注射組創(chuàng)面組織中EGF 和Ang-2 含量高于PPP 注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果顯示，PRP 注射組的CD34 水平顯著高于PPP 注射組（P＜0.05）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Vimentin 蛋白在PRP 注射組的組織中的水平高于PPP 注射組（P＜0.01）。在組織炎癥反應(yīng)方面，炎癥因子IL-6 及IL-12 在PPP 注射組的創(chuàng)面組織中含量均顯著高于PRP 注射組（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組創(chuàng)面中央組織EGF、Ang-2、CD34、Vimentin、IL-6 及IL-12 含量比較（）

表1 兩組創(chuàng)面中央組織EGF、Ang-2、CD34、Vimentin、IL-6 及IL-12 含量比較（）

注：PPP 為乏血小板血漿；PRP 為富血小板血漿；EGF 為表皮生長(zhǎng)因子，Ang-Ⅱ?yàn)榇傺苌伤丌?；AOD 為平均光密度值；Vimentin 為波形蛋白；IL-6 為白介素-6；IL-12 為白介素-12

3 討論

肛瘺平均發(fā)病年齡為30～40 歲，平均發(fā)病率為1.69/10000，近年來(lái)逐步升高[9]。肛瘺難以自愈，手術(shù)是主要治療方式，但術(shù)后切口愈合緩慢，住院時(shí)間長(zhǎng)，醫(yī)療費(fèi)用高，且術(shù)后易出現(xiàn)假性愈合及復(fù)發(fā)，目前對(duì)于復(fù)雜性肛瘺的治療，仍較為困難。PRP 是從自體血中提取出來(lái)的血小板濃縮物，包含的各生長(zhǎng)因子，其濃度比例與體內(nèi)相似，且生長(zhǎng)因子之間有最佳協(xié)同作用，具有促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)、減少出血和滲出、抗感染等作用。PRP 近年來(lái)在難愈合性創(chuàng)面，如糖尿病足、壓瘡及慢性下肢靜脈性潰瘍等疾病的臨床應(yīng)用中取得良好的治療效果[10-12]。

本研究采用掛線法對(duì)巴拿馬豬進(jìn)行肛瘺造模，瘺管造影顯示，所有瘺管均造模成功，組織病理檢查進(jìn)一步明確瘺管形成。血常規(guī)檢查提示，PRP 組血小板水平明顯高于PPP 組及外周靜脈血。瘺管切除后將PRP 注射到創(chuàng)面，術(shù)后12 d 取創(chuàng)面組織進(jìn)行分析。ELISA 法檢測(cè)結(jié)果提示，PRP 注射可以抑制炎癥反應(yīng)介質(zhì)IL-6 及IL-12 水平，提高創(chuàng)面組織中Ang-2 及EGF 水平；免疫組化提示，PRP 組新生血管標(biāo)記物CD34 明顯高于PPP 組；免疫熒光檢測(cè)顯示，PRP組波形蛋白水平明顯高于PPP 組。觀察結(jié)果顯示，PRP 組瘺管愈合時(shí)間明顯少于PPP 組，表明PRP 能夠促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合。

PRP 促進(jìn)創(chuàng)面愈合可能與PRP 促進(jìn)細(xì)胞增殖、新生血管形成及組織重塑有關(guān)。當(dāng)上皮組織損傷時(shí)，血小板形成止血血栓，分泌凝血因子促進(jìn)纖維蛋白凝固，血栓和凝固的纖維蛋白可作為細(xì)胞增殖和遷移的基質(zhì)[13-17]。PRP 可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白A（cyclin A）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）表達(dá)，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移[15]。Koulikovska 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PRP 可以顯著抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞凋亡。PRP 在用于鼠皮膚傷口實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面動(dòng)脈血管密度顯著高于對(duì)照組，并且實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面愈合速率明顯高于對(duì)照組，與本研究結(jié)果相似，并且本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PRP可以提高促Ang-2 水平，表明PRP 可以促進(jìn)創(chuàng)面血管再生促進(jìn)傷口愈合[17]。此外，PRP 還可以通過加速上皮細(xì)胞分化，促進(jìn)組織形成結(jié)構(gòu)緊密、排列有序的膠原蛋白束加快傷口愈合[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，PRP 注射后創(chuàng)面EGF 升高，可以進(jìn)一步提高成纖維細(xì)胞水平，波形蛋白水平增高，可以促進(jìn)傷口愈合。Kakudo等[19]對(duì)使用PRP 的植皮供區(qū)進(jìn)行HE 染色及膠原纖維染色也發(fā)現(xiàn)，上皮組織厚度明顯高于對(duì)照組。本研究中，PRP 注射組炎癥反應(yīng)水平較PPP 組低，PRP 可能通過促進(jìn)單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞建立抗感染的微環(huán)境，為感染性傷口的愈合起到抑制炎癥反應(yīng)的作用[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，采用掛線法進(jìn)行肛瘺造模簡(jiǎn)便易行，造模成功率高。對(duì)于肛瘺切除術(shù)后創(chuàng)面，自體PRP 局部注射可以顯著促進(jìn)愈合，其促進(jìn)愈合的機(jī)制可能與PRP 可以提高創(chuàng)面組織中EGF 及Ang-2含量，促進(jìn)上皮生長(zhǎng)及新生血管形成有關(guān)。此外，PPR還可以減輕組織炎癥反應(yīng)，這些作用共同作用于創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合。對(duì)于PRP 促進(jìn)肛瘺術(shù)后傷口愈合的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。